Name: Caratterizzazione di calcificazione eventi utilizzando dal vivo ottica ed elettronica Microscopia tecniche in un tubeworm Marine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 39 s
Description: Scopri la caratterizzazione degli eventi di calcificazione in Hydroides elegans utilizzando microscopia ottica ed elettronica. Questo metodo combina indicatori fluorescenti per pH intracellulare e segnali di calcio con tecniche di imaging avanzate.

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Gli autori desiderano inviare un grande ringraziamento a Clemson Broadcast Productions, registrazione audio di J. Bright, narrazione di A. D. McQuiston, addolcimento audio, K. Murphy, videografia di G. Spake, arti grafiche di T. Messervy, montaggio video di T. Messervy e E. Rodgers. L'assistenza tecnica e la consulenza scientifica si ispirarono ai consigli di S. Kawada, S. Kubo, J. Hudson, T. Darroudi, D. Mulwee, H. Qian, Y. W. Lam, M. B. Johnstone, C. Campanati, A. C. Lane e R. Dineshram. Questo studio è stato finanziato da tre sovvenzioni GRF dell'HKSAR-RGC (numeri di sovvenzione: 705511P, 705112P e 17304914).

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

imaging ottico diretta è un metodo utile per osservare eventi cellulari in un organismo multicellulare. Qui, sono stati usati indicatori di pH e ioni calcio interni per misurare il flusso di ioni nei siti di mineralizzazione. In queste regioni, pompaggio ione attivo è necessario per elevare il pH e Ca 2+ concentrazione consentire calcificazioni 2, 3. Quando si applica molecole fluorescenti a studiare un organismo, è fondamentale garantire che la conce...

Biomineralization è una serie complessa di eventi, quali ponti una serie di attività cellulari conseguente produzione di minerali squisitamente ordinate 1. La sfida è quella di caratterizzare sia il processo cellulare dinamica e le sofisticate strutture minerali utilizzando una combinazione di metodi di microscopia ottica ed elettronica. Un innalzamento del pH intracellulare favorisce la formazione di CaCO 3 cristalli, quindi, identificando la fase vita che ha una maggiore pH rivela momento calcificazioni è probabile che si verificano 2, 3. I tubicoli della famiglia Serpulidae sono calcifiers comuni nell&#39;oceano 4. È anche un modello invertebrato popolare per la ricerca marina, soprattutto in biofouling 5, 6. In questo studio, il processo di calcificazione nei compartimenti mineralizzanti durisi osserva ng biomineralization. Il rapido processo di metamorfosi prevede l&#39;emergere di strutture di carbonato di calcio 7, 8. Dimostriamo come interno misurazioni del pH può essere eseguita sul tubeworm, e come le fasi della vita e dei tessuti rilevanti per la calcificazione potrà essere schermato. Dopo la fase di vita di interesse è identificato, il tessuto responsabile calcificazioni può essere caratterizzata con una risoluzione superiore utilizzando metodi di microscopia elettronica. Utilizzando la microscopia a fluorescenza, si determina il tempo necessario per il carbonato di calcio ad apparire dopo l&#39;induzione metamorfica. Una simile fase della vita è stato successivamente visualizzata con SEM-EDS per la distribuzione composizione elementare, e il minerale depositato è stato analizzato utilizzando due diversi metodi di microscopia elettronica, in particolare SEM-EBSD e FIB-TEM.

<table><tbody><tr><td>Esametildisilazano</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>16700(EM)</td><td></td></tr><tr><td>Tetrossido di osmio 2% Soluzione acquosa</td><td>Microscopia elettronica</td><td>Scienze 19192</td><td></td></tr><tr><td>IBMX 3-Isobutil-1-metilxantina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PHZ1124</td><td></td></tr><tr><td>Nigericina, acido libero</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N7143-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Piatto diametro 35 mm, foro 27 mm, vetro n. 0, non rivestimento</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D110400</td><td></td></tr><tr><td>5-(e-6)-carbossi SNARF-1, estere acetossimetilico, acetato</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C-1271</td><td></td></tr><tr><td>BDH cloruro di potassio, grado ACS</td><td>VWR</td><td>BDH0258-500G</td><td></td></tr><tr><td>grado di reagente paraformaldeide , cristallino</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>1 M acido cloridrico per analisi volumetrica</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>083-01095</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di idrossido di sodio 0,05 M per analisi volumetrica</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>199-02185</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma</td><td>C0875</td><td></td></tr><tr><td>FASW</td><td>Iwaki Co. Ltd.</td><td>Rei-sea Marine</td><td></td></tr><tr><td>Membrane Estere di Cellulosa Mista; 47 mm Ø, 0.45 &micro; m</td><td>ADVANTEC</td><td>A045A047A</td><td></td></tr><tr><td>etanolo</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>051-00476</td><td></td></tr><tr><td>Acqua di mare artificiale per tamponi</td><td></td><td></td><td>da SOP06 del DOE (1994), cdiac.ornl.gov/ftp/cdiac74/sop06.pdf</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>163-03545</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio esaidrato</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>135-00165</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>039-00475</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di sodio</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>197-03345</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>089-08415</td><td></td></tr><tr><td>2-ammino-2-idrossimetil-1,3-propandiolo (tris)</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>207-06275</td><td></td></tr><tr><td>2-amminopiridina</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd</td><td>011-02775</td><td></td></tr><tr><td>Orion 5-star Plus pHmetro</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PrpHecT ROSS Micro Combination Elettrodo pH 8220BNWP</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovision, versione 4.6, Axio Osservatore Z1</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH, Bethesda, MD, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HRTEM H500</td><td>Hitachi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU6600 VPSEM</td><td>Hitachi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NB5000 Sistema a fascio di ioni ed elettroni focalizzati (FIB-SEM)</td><td>Hitachi&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

caratterizzazione di calcificazione eventi utilizzando dal vivo ottica ed elettronica microscopia tecniche in un tubeworm marine

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Caratterizzare il primo evento di produzione biologica di carbonato di calcio richiede una combinazione di approcci microscopici. In primo luogo, la distribuzione intracellulare del pH e gli ioni calcio possono essere osservati utilizzando la microscopia dal vivo nel tempo. Ciò consente l'identificazione dello stadio di vita e del tessuto con la caratteristica di interesse per ulteriori studi di microscopia elettronica. La fase di vita e i tessuti di interesse sono in genere più alti nei segnali di pH e Ca. 
Qui, utilizzando H. elegans, presentiamo un protocollo per caratterizzare la presenza di strutture di carbonato di calcio in un campione biologico al microscopio elettronico a scansione (SEM), utilizzando la spettroscopia a raggi X a dispersione di energia (EDS) per visualizzare la composizione elementare, utilizzando la diffrazione di retrodiffusione elettronica (EBSD) per determinare la presenza di strutture cristalline e utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) per analizzare la composizione e la struttura del materiale. In questo protocollo, un fascio ionico focalizzato (FIB) viene utilizzato per isolare campioni con dimensioni adatte all'analisi TEM. Poiché la FIB è una tecnica site specific, dimostriamo come le informazioni delle tecniche precedenti possano essere utilizzate per identificare la regione di interesse, dove i segnali Ca sono più alti.

Di seguito sono riportate alcune osservazioni del processo di calcificazione durante la metamorfosi del tubeworm. La figura 1 mostra che i valori di pH vicino regione collare è superiore rispetto agli altri tessuti dopo metamorfosi. La figura mostra una 2i tubeworm con distribuzione omogenea di Ca, suggerendo senza grandi eventi calcificazione hanno cominciato; La figura mostra un 2II tubeworm che ha cal...

Dimostriamo l'uso di vari metodi di microscopia utili per osservare la calcificazione di un verme tubolare, Hydroides elegans, oltre a localizzare e caratterizzare il primo materiale calcificato. La microscopia dal vivo e la microscopia elettronica vengono utilizzate insieme per fornire informazioni funzionali e materiali importanti nello studio della biomineralizzazione.

Caratterizzazione di calcificazione eventi utilizzando dal vivo ottica ed elettronica Microscopia tecniche in un tubeworm Marine

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare la localizzazione e la struttura dell'evento di calcificazione eseguendo una combinazione di metodi di microscopia ottica ed elettronica. Questo viene ottenuto monitorando il verme tubicolo larvale vivente durante la metamorfosi, la fase vitale responsabile della calcificazione che può essere rilevata utilizzando indicatori fluorescenti sensibili ai segnali intracellulari di pH e calcio. L'imaging del pH intracellulare ci permette di studiare la concentrazione di protoni entranti ed uscenti dal citoplasma nel processo di calcificazione.Per iniziare, per l'analisi del pH intracellulare nelle larve di verme tubicolare marino, le larve competenti nuotanti vengono colorate con il colorante indicatore del pH intracellulare, SNARF-1 AM. Le larve vengono quindi trasferite in una capsula contenente acqua di mare con IBMX e una sottile finestra di osservazione in vetro, e posizionate su un microscopio a fluorescenza, dove vengono irradiate con luce a una lunghezza d'onda di 488 nanometri, assorbita dal colorante. Vengono raccolte le emissioni a 580 e a 640 nanometri provenienti dal colorante. I valori del pH intracellulare possono essere calcolati dai rapporti tra questi valori.La microscopia ottica ci permette di identificare il tempo e la regione del tessuto associati a un livello di pH più elevato. Questo è il primo passo per determinare i punti temporali di interesse per ulteriori analisi. Nel secondo passaggio, fissare il verme tubicolo con fissativi nei punti temporali rilevanti per la microscopia elettronica.Una nuova fase vitale di mineralizzazione viene identificata mediante mappatura SEM-EDS per il segnale del calcio. Successivamente, le regioni con un segnale di calcio elevato vengono analizzate mediante SEM/EBSD, identificando la presenza di minerale cristallino. Infine, utilizzando un fascio ionico focalizzato, il minerale viene sezionato e viene preparata una sezione sottile per l'osservazione al microscopio elettronico a trasmissione (TEM).Questa sezione viene utilizzata per ottenere un modello di diffrazione da area selettiva. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto a metodi di prova convenzionali, come la spettroscopia di diffrazione a raggi X su campioni massivi, è che consente l'osservazione diretta di specifiche strutture precedentemente individuate mediante metodiche di microscopia ottica ed elettronica; pertanto, gli eventi discreti di calcificazione possono essere studiati direttamente a livello sia temporale che spaziale. Quando la calcificazione viene studiata mediante indicatori del calcio e del pH intracellulare, è possibile identificare la scala temporale di questi eventi fisiologici rilevanti.Conservare il campione al momento giusto è fondamentale per un'analisi SEM efficace. Quando si cerca il primo evento di calcificazione biologica, la SEM/EDX può essere utilizzata per analizzare la distribuzione degli elementi del calcio. Una zona con una maggiore concentrazione di calcio può indicare la presenza di carbonato di calcio; tuttavia, solo la presenza di un pattern di diffrazione a raggi X può confermare la struttura cristallina.Queste informazioni possono essere ottenute utilizzando EBSD e TEM. La diffrazione degli elettroni retrodiffusi è una tecnica di caratterizzazione cristallografica impiegata per identificare materiali cristallini o policristallini, a condizione che la microstruttura e l'angolo REM degli elettroni soddisfino la condizione di diffrazione di Bragg. Tipicamente, gli elettroni retrodiffusi vengono raccolti con un'inclinazione di 70 gradi su un campione lucidato, ottenendo mappe dell'orientamento dei grani o dei cristalli.Per un campione non lucidato, generare una mappa di questo tipo a partire da superfici irregolari è difficile, poiché non tutte le serie superficiali soddisfano i requisiti angolari per l'EBSD. Tuttavia, sotto forma di punto IG, un pattern di diffrazione Cacucci può comunque essere raccolto da queste superfici irregolari, purché siano soddisfatti i requisiti angolari dell'EBSD. Il pattern di diffrazione Cacucci fornisce una conferma inequivocabile della presenza del minerale cristallino.Il nostro metodo è diretto e rapido, e può essere applicato ad altri tessuti mineralizzati. Qui, un fascio ionico focalizzato viene utilizzato per fabbricare un microcampione, che rappresenta anche un metodo estremamente diretto per preparare una sezione per microscopia elettronica a trasmissione (TEM). Per esaminare il processo di metamorfosi, i vermi tubicoli sono stati coltivati in laboratorio per circa cinque giorni.Le larve competenti nuoteranno in direzione anterograda invece che in un movimento circolare. Ciò indica che sono pronte per la metamorfosi. Incubare le larve competenti nella soluzione fluorescente in acqua di mare, coprire i contenitori con carta stagnola per prevenire il fotoblecimento e incubare gli animali per tutta la notte.I larve di verme tubicolo vengono lavate contro una maglia di nylon che tratterrà le larve ma permetterà alla soluzione di passare. Lavare le larve due volte con acqua di mare filtrata per rimuovere l'eccesso di soluzione colorante. Premere il setaccio contro la piastra di Petri per creare una chiusura ermetica, quindi rilasciare la chiusura per eliminare la soluzione di lavaggio.Attenzione a non far seccare i larvi. Successivamente, posizionare ciascuno dei 10-20 larvi in una capsula di vetro sottile con IBMX e coprire la capsula fino all'acquisizione delle immagini. In seguito, inserire i cubetti filtro adatti con gli specchi dicromatici appropriati per rilevare i segnali fluorescenti.Ottimizzare il tempo di otturazione in modo che sia sufficientemente rapido da acquisire immagini di un organismo vivente. Successivamente, selezionare i parametri di sezionamento ottico nell'opzione Z-Stack, spostare il palco del microscopio verso l'alto e verso il basso per definire la posizione iniziale e finale dell'acquisizione delle immagini. Impostare una distanza di un micrometro tra i livelli.Dopo l'acquisizione delle immagini, esportare tutti i dati come file TIF in scala di grigi. Questa operazione può essere eseguita selezionando File, Esporta. Assicurarsi che i tipi di file siano visualizzati come immagini TIF, quindi fare clic su Avvia.L'immagine in scala di grigi in ogni canale, in ogni livello dello Z-Stack, sarà presente nella stessa cartella delle immagini, pronta per l'analisi. Infine, generare un'immagine composita per ciascuno dei canali fluorescenti utilizzando ImageJ. I seguenti video di JoVE illustrano come eseguire la calibrazione e le misurazioni del pH intracellulare.Conservare i vermi tubicoli in metamorfosi utilizzando un fissativo cross-linking, con una soluzione di paraformaldeide al 4% in acqua di mare. È sufficiente mescolare una parte di paraformaldeide al 16% con tre parti di acqua di mare e lasciare avvenire la fissazione durante la notte. Smaltire il fissativo primario e fissare nuovamente il campione per 30 minuti in una soluzione acquosa di tetrossido di osmio all’1% per stabilizzare ulteriormente le strutture dei tessuti.Assicurarsi di lavorare in una cappa aspirante e di avere bottiglie separate per i rifiuti chiaramente etichettate, preparare formaldeide e tetrossido di osmio. Successivamente, disidratare i campioni utilizzando una serie di etanolo a concentrazione crescente, lasciando cinque minuti tra ogni cambio. Il passo successivo consiste nel disidratare i campioni con una soluzione 1:1 di etanolo e HMDS, in quantità sufficiente a coprire il campione.Attendere che il campione si asciughi per evaporazione nell'armadio a cappa, quindi ripetere la procedura con HMDS puro. Per creare una frattura controllata del campione, passare la lama di diamante lungo la piastra, racchiudendo alcuni individui per ottenere un taglio triangolare. Con la piastra di Petri coperta, appoggiare la piastra colturale su un supporto di alluminio e premere delicatamente per ottenere una frattura controllata.Esaminare utilizzando un microscopio stereoscopico, prelevare con attenzione un frammento di frattura contenente alcuni vermi tubicoli integri. Fissare il campione al portacampione per SEM utilizzando una vernice argentata, applicando la vernice ai bordi per ridurre l'accumulo di carica. Il campione è ora pronto per essere analizzato mediante SEM-EDS.Inserire il campione nel portacampione nel microscopio. Orientare il campione e posizionarlo al di sotto della colonna elettronica. Analizzare il campione in modalità VP SEM.Ottimizzare il fuoco e l'astigmatismo secondo necessità. Selezionare l'ingrandimento in modo che un singolo organismo occupi l'intero campo visivo. Analizzare la distribuzione elementare del calcio sul campione acquisendo una mappa dell'intero campo visivo; eseguire la mappa per 15 minuti o più a lungo, oppure fino a quando i dati mostrano una localizzazione distinta del calcio all'interno dell'organismo.Per ottenere una quantificazione puntuale di una regione di interesse, selezionare l'opzione Point ID utilizzando lo strumento Single Point. Fare clic sull'area di interesse per eseguire una scansione. Registrare attentamente la posizione acquisendo una serie di immagini con ingrandimenti decrescenti.Per preparare i campioni per l'EBSD, rimuovere il campione dal supporto piatto per SEM e fissarlo su un supporto pre-inclinato a 45 gradi utilizzando vernice argentata. Utilizzando le immagini di riferimento ottenute con la SEM, individuare l'animale di interesse e la regione esatta dell'animale da esaminare. Inclinare il piatto di 25 gradi in modo che la superficie del campione formi ora un angolo di circa 70 gradi rispetto al fascio di elettroni.Sollevare la piattaforma. Selezionare la modalità EBSD nel software AZtec. Scegliere l'aragonite come fase di interesse.Inserire la telecamera EBSD, impostare le condizioni della telecamera per ottenere un segnale di circa il 90%. Utilizzando una scansione rapida del fascio, acquisire un fondo, quindi catturare un'immagine in Aztec. Con lo strumento di analisi puntuale, fare clic sulla posizione del campione che ha mostrato un segnale di calcio più elevato. Effettuare una scansione per verificare se vengono rilevati i modelli di Cacucci.Se sono presenti dei pattern che corrispondono a una delle fasi selezionate nel database, questi verranno automaticamente indicizzati. Proteggere il campione preparato per il SEM applicando uno strato di platino mediante rivestimento a spruzzo prima di procedere alla preparazione del microcampione utilizzando il fascio ionico focalizzato. Inserire il campione nella camera del SEM-FIB, posizionare il campione ed acquisire un'immagine live di elettroni secondari indotti da ioni.Individuare l'area di interesse a partire dalle immagini di riferimento precedentemente determinate mediante mappatura EDS in EBSD. Ruotare il piatto secondo necessità per allineare le caratteristiche di interesse con il bordo della finestra, regolare l'ingrandimento in modo da visualizzare l'area che comprende le caratteristiche di interesse, quindi definire un riquadro per depositare carbonio e tungsteno. Acquisire un'istantanea FIB, quindi disegnare un modello di quattro riquadri intorno al cappuccio di tungsteno per definire la posizione del microcampionamento.Quindi inclinare la piattaforma a 58 gradi e tagliare attraverso la parte inferiore del microcampione. Riportare l'inclinazione della piattaforma a zero, inserire la sonda microcampione al tungsteno, quindi abbassarla fino al contatto con il campione. Collegare la sonda al tungsteno e il campione depositando tungsteno tra la punta della sonda e il rivestimento di tungsteno, quindi effettuare l'ultimo taglio, staccare il microcampione dal resto dell'isola e sollevare la sonda con il microcampione attaccato.Posizionare una griglia in rame per TEM nel portagriglia ad inserimento laterale, abbassare la sonda al tungsteno finché il microcampione non entra in contatto con la griglia per TEM. Il microcampione viene ulteriormente lavorato fino a renderlo trasparente agli elettroni. Prima dell'analisi al TEM, riempire entrambi i contenitori con azoto liquido e impostare la tensione di accelerazione a 300 kilovolt.Posizionare la metà della griglia con le lamelle attaccate nel portacampioni standard per TEM. Centrare il fascio sullo schermo fosforoso, contrarre ed espandere il fascio e assicurarsi che tutto il movimento del fascio sia concentrico. Utilizzare le manopole di movimento dello stadio per navigare e localizzare il campione, aumentare l'ingrandimento sul campione e regolare l'altezza Z fino a quando il campione non è a fuoco.Utilizzare gli oculari ottici secondo necessità. Inserire la telecamera e rimuovere lo schermo al fosforo. Espandere il fascio secondo necessità per evitare la sovrasaturazione della telecamera.Regolare la messa a fuoco e i parametri della fotocamera per acquisire un'immagine. Per ottenere un pattern di diffrazione, centrare la caratteristica di interesse, rimuovere l'apertura dell'obiettivo e inserire l'apertura di diffrazione. Passare alla modalità Lente di Diffrazione.Inserire un bloccante per evitare che il centro del pattern di diffrazione danneggi la camera o lo schermo fosforico. Acquisire un'immagine del pattern per l'analisi cristallografica. Di seguito sono riportate alcune osservazioni del processo di calcificazione durante la metamorfosi del verme tubicolo.I valori di pH dei vermi tubolari sono aumentati dopo la stimolazione della metamorfosi con IBMX e il pH intracellulare ha iniziato ad aumentare oltre otto a 31 ore. Il tessuto rilevante per la calcificazione è la regione del collare. Una mappa dei segnali SEM-EDS mostra che il verme tubolare del primo giorno presentava una distribuzione omogenea di calcio, indicando che il processo di calcificazione non era ancora iniziato.Due giorni dopo la stimolazione della metamorfosi, alcuni vermi tubicoli si erano già calcificati eccessivamente e non erano più adatti all'osservazione dei materiali appena calcificati. In un campione di verme tubicolo, come quello utilizzato in questo esempio, la calcificazione si trova ancora in una fase iniziale, pertanto la quantificazione del calcio ha contribuito a determinare la posizione di interesse per caratterizzare la presenza di minerali. Quando esaminata mediante SEM-EBSD, l'area localizzata con un forte segnale di calcio presentava anche una struttura cristallina di aragonite.Utilizzando un fascio ionico focalizzato, il campione è stato preparato per la microscopia elettronica a trasmissione e il pattern di diffrazione del minerale aragonite è stato analizzato con un maggiore dettaglio cristallografico. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come localizzare un evento di mineralizzazione in un organismo multicellulare. Quando la microscopia ottica ed elettronica vengono utilizzate insieme, possiamo ottenere un elevato livello di comprensione fisiologica e materiale sul processo di calcificazione.

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Imaging del calcio: un metodo per visualizzare l'attività neurale in C. elegans vivo

Una suite integrata di tecniche di imaging è stata applicata per determinare polipo morfologia e struttura del tessuto in coralli dei Caraibi Montastraea annularis e M. faveolata. Fluorescenza, blocco faccia seriale, e due fotoni laser microscopio confocale a scansione hanno identificato struttura lobate, pareti polipo, e chromatophore stimato e densità di zooxantelle e distribuzioni.

Multimodali ottici Metodi Microscopia Reveal Polyp Tissue morfologia e struttura in Caribbean Reef costruzione Coralli

L'imaging del comportamento e dell'attività neurale su scale temporali lunghe senza immobilizzazione dell'animale è un prerequisito per comprendere il comportamento. L'imaging delle camere microfluidiche di agarosio (AMI) può essere utilizzato per visualizzare l'attività neurale e il comportamento per tutte le fasi della vita di Caenorhabditis elegans.

Microchambers Agarose per lungo termine Imaging di calcio<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Questo protocollo descrive l'uso di codificato geneticamente Ca2 + reporter per registrare le modifiche attività neurale in comportarsi vermi di Caenorhabditis elegans .

Raziometrici calcio Imaging di singoli neuroni nel comportarsi Caenorhabditis Elegans

In questo articolo, dimostriamo live imaging dei singoli vermi che impiegano un dispositivo microfluidico personalizzato. Nel dispositivo, più vermi individualmente sono confinati per separare chambers, permettendo multiplex sorveglianza longitudinale di vari processi biologici.

Una piattaforma microfluidica per Imaging longitudinale in Caenorhabditis elegans

Qui, i protocolli per l'esecuzione di immagini di tomografia computerizzata a raggi X (microCT) microfocus di tre animali invertebrati marini sono spiegati in dettaglio. Questo studio descrive passaggi quali la fissazione dei campioni, la colorazione, il montaggio, la scansione, la ricostruzione delle immagini e l'analisi dei dati. Vengono inoltre forniti suggerimenti su come il protocollo può essere regolato per diversi campioni.

Microfocus X-ray CT (microCT) Imaging di Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), e Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)

Questo metodo fornisce un modo per coppie di optogenetica e sensori di calcio geneticamente codificati per l'immagine dei livelli di calcio citosolico di base e cambiamenti nei transitori di calcio evocati nei muscoli della parete del corpo dell'organismo modello C. elegans.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Muscoli della parete del corpo

Qui è riportato un sistema per l'imaging del calcio nel comportamento libero di Caenorhabditis elegans con vibrazioni ben controllate e non localizzate. Questo sistema consente ai ricercatori di evocare vibrazioni non localizzate con proprietà ben controllate a spostamento su scala nanometrica e di quantificare le correnti di calcio durante le risposte di C. elegans alle vibrazioni.

Imaging del calcio in Caenorhabditis elegans che si comporta liberamente con vibrazioni ben controllate e non localizzate

Il fluorometro a velocità di ripetizione rapida (FRRf) è un metodo utile per misurare la fotofisiologia del fotosistema II e la produttività primaria. Qui descriviamo un protocollo per misurare la fotofisiologia PSII dell'alga epizoica, Colacium sp. su substrato zooplancton utilizzando FRRf di tipo cuvetta.

Misurazione della fotofisiologia dello stadio collegato di Colacium sp. da un fluorometro a velocità di ripetizione rapida di tipo cuvetta

Le malattie cardiovascolari sono la principale causa di morte in tutto il mondo. La calcificazione vascolare contribuisce in modo sostanziale al carico di morbilità e mortalità cardiovascolare. Questo protocollo descrive un metodo semplice per quantificare la precipitazione di calcio mediata da cellule muscolari lisce vascolari in vitro mediante imaging fluorescente.

Un metodo semi-automatico e riproducibile a base biologica per quantificare la deposizione di calcio in vitro

Qui, presentiamo protocolli e strumenti per visualizzare il calcio durante la fecondazione e l'embriogenesi precoce utilizzando un reporter di calcio geneticamente codificato espresso nella linea germinale del nematode modello C. elegans.

Visualizzazione in vivo dei transitori di calcio durante la fecondazione e lo sviluppo precoce in C. elegans

Scopri la caratterizzazione degli eventi di calcificazione in Hydroides elegans utilizzando microscopia ottica ed elettronica. Questo metodo combina indicatori fluorescenti per pH intracellulare e segnali di calcio con tecniche di imaging avanzate.

Caratterizzazione di calcificazione eventi utilizzando dal vivo ottica ed elettronica Microscopia tecniche in un tubeworm Marine (Video) | JoVE Journal

Caratterizzazione di calcificazione eventi utilizzando dal vivo ottica ed elettronica Microscopia tecniche in un tubeworm Marine

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