Caratterizzazione di calcificazione eventi utilizzando dal vivo ottica ed elettronica Microscopia tecniche in un tubeworm Marine

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare la posizione e la struttura dell'evento di calcificazione eseguendo una combinazione di metodi di microscopia ottica ed elettronica. Ciò si ottiene monitorando il verme tubolare larvale vivente durante la metamorfosi, la fase di vita responsabile della calcificazione che può essere rilevata utilizzando indicatori fluorescenti sensibili al pH intracellulare e ai segnali del calcio. L'imaging del pH intracellulare ci consente di studiare la concentrazione di protoni dentro e fuori dal citoplasma nel processo di calcificazione.

Per iniziare, l'imaging intracellulare del pH nelle larve di verme tubolare marino, le larve nuotatrici competenti vengono colorate con il colorante indicatore di pH intracellulare, SNARF-1 AM. Le larve vengono quindi trasferite in una capsula di IBMX contenente acqua di mare con una sottile finestra di osservazione in vetro e poste su un microscopio fluorescente, dove vengono colpite con luce a 488 nanometri di lunghezza d'onda, che viene assorbita dal colorante. Vengono raccolte emissioni di 580 nanometri e 640 nanometri dal colorante. I valori del pH intracellulare possono essere calcolati dai rapporti di questi valori.

La microscopia ottica ci consente di identificare il tempo e la regione tissutale associati a un livello di pH più elevato. Questo è il primo passo per determinare i punti temporali di interesse per ulteriori analisi. Nella seconda fase, conservare il verme tubolare con fissativi nei punti temporali rilevanti per la microscopia elettronica.

Una nuova fase di vita mineralizzante viene identificata utilizzando la mappatura SEM-EDS per il segnale del calcio. Quindi le regioni con un alto segnale di calcio vengono sottoposte a screening utilizzando SEM/EBSD, identificando la presenza di minerale cristallino. Infine, utilizzando un fascio di ioni focalizzato il minerale viene tagliato, una sezione sottile viene preparata per l'osservazione TEM.

Questa sezione viene utilizzata per ottenere un modello di diffrazione selettiva dell'area. Il vantaggio principale di questa tecnica o di un metodo di test convenzionale come la spettroscopia di diffrazione di raggi X di massa è che fornisce l'osservazione diretta di strutture specifiche che sono state osservate con metodi di microscopia ottica ed elettronica, quindi gli eventi di calcificazione discreti possono essere studiati direttamente sia a livello temporale che spaziale. Quando la calcificazione viene studiata con il calcio e gli indicatori di pH intracellulare, possiamo identificare la scala temporale di questi eventi fisiologici rilevanti.

Conservare il campione al momento giusto è fondamentale per un'analisi SEM fruttuosa. Quando si cerca il primo evento di calcificazione biologica, SEM/EDX può essere utilizzato per lo screening della distribuzione elementare del calcio. Una posizione che ha più calcio può indicare la presenza di carbonato di calcio, tuttavia, solo la presenza di un modello di diffrazione a raggi X può confermare l'esistenza di una struttura cristallina.

Tali informazioni possono essere ottenute utilizzando EBSD e TEM. La diffrazione di retrodiffusione elettronica è una tecnica di caratterizzazione cristallografica per identificare materiale cristallino o policristallino, purché la microstruttura e l'angolo REM degli elettroni soddisfino la condizione di diffrazione di Bragg. Tipicamente, gli elettroni retrodiffusi vengono raccolti con un'inclinazione di 70 gradi su un campione lucidato con mappe di orientamento dei grani o dei cristalli.

Per un campione non lucidato, generare una tale mappa da queste superfici irregolari è difficile, perché non tutte le serie di servizi soddisfano i requisiti dell'angolo EBSD. Tuttavia, sotto forma di punto IG, è ancora possibile raccogliere un modello di diffrazione di Cacucci da queste superfici irregolari, purché sia soddisfatto il requisito dell'angolo EBSD. Il modello di diffrazione di Cacucci fornisce una conferma inequivocabile della presenza del minerale cristallino.

Il nostro metodo è diretto e veloce e può essere utilizzato anche per altri tessuti mineralizzanti. Qui, un fascio ionico focalizzato viene utilizzato per fabbricare un microcampione, che è anche un metodo molto diretto per preparare una sezione TEM. Per esaminare il processo di metamorfosi, i vermi tubolari sono stati coltivati in laboratorio per circa cinque giorni.

Le larve competenti nuoteranno in avanti invece di un movimento circolare. Ciò significa che sono pronti per la metamorfosi. Incubare le larve competenti nella soluzione fluorescente in acqua di mare, coprire i contenitori con un foglio per prevenire il fotosbiancamento e incubare gli animali durante la notte.

Le larve del verme tubolare vengono lavate contro la rete di nylon che tratterrà le larve ma consentirà il passaggio della soluzione. Lavare le larve con acqua di mare filtrata due volte per rimuovere la soluzione colorante in eccesso. Premere il colino sulla capsula di Petri per creare una tenuta ermetica prima di rilasciare il sigillo per scartare la soluzione di lavaggio.

Fare attenzione a non seccare le larve. Quindi posizionare ciascuna delle 10-20 larve in un piatto sottile con fondo di vetro con IBMX e coprire il piatto fino all'imaging. Successivamente, inserire gli appositi cubi filtranti con gli appositi specchi dicroici per rilevare i segnali fluorescenti.

Ottimizza il tempo dell'otturatore in modo che sia abbastanza veloce da catturare immagini per un organismo vivente. Quindi, selezionare i parametri di sezionamento ottico sull'opzione Z-Stack, spostare il tavolino microscopico su e giù per definire la posizione di inizio e fine dell'acquisizione dell'immagine. Imposta una distanza di un micrometro tra gli strati.

Dopo l'imaging, esportare tutti i dati come file TIF in scala di grigi. Questa operazione può essere eseguita selezionando File, Esporta. Assicurati che i tipi di file vengano visualizzati come immagini TIF, quindi fai clic su Avvia.

L'immagine in scala di grigi in ogni canale, in ogni livello di Z-Stack sarà nella stessa cartella di immagini pronta per l'analisi dell'immagine. Infine, generare un'immagine composita per ciascuno dei canali fluorescenti, utilizzando ImageJ. I seguenti video JoVE mostrano come eseguire la calibrazione e le misurazioni del pH intracellulare.

Conservare i vermi tubolari in fase di metamorfosi utilizzando un fissativo reticolante, utilizzando una soluzione di paraformaldeide al 4% in acqua di mare. Basta mescolare una parte di paraformaldeide al 16% in tre parti di acqua di mare e lasciare che il fissaggio avvenga durante la notte. Smaltire il fissativo primario e rifissare il campione per 30 minuti in una soluzione acquosa di tetraossido di osmio all'1% per stabilizzare ulteriormente le strutture tissutali.

Assicurati di lavorare in una cappa aspirante e di avere bottiglie di rifiuti separate che siano chiaramente etichettate, prepara formaldeide e tetraossido di osmio. Quindi, disidratare i campioni utilizzando una serie di etanolo graduato, lasciando passare cinque minuti tra le modifiche. Il passo successivo consiste nel disidratare i campioni con una soluzione 1:1 di etanolo e HMDS, quanto basta per coprire il campione.

Attendere che il campione evapori a secco nella cappa aspirante, quindi ripetere la procedura con HMDS puro. Per creare una frattura controllata del campione, far scorrere la lama diamantata contro il piatto, racchiudendo alcuni individui per eseguire un taglio triangolare. Con la piastra di Petri coperta, posizionare la piastra di coltura contro un tronchetto di alluminio, premere delicatamente per ottenere una frattura controllata.

Osservare con un microscopio da dissezione, raccogliere con cura un pezzo di frattura che contiene alcuni vermi tubolari intatti. Con la vernice d'argento, attaccare il campione al supporto del campione SEM, dipingere intorno ai bordi con vernice d'argento per ridurre la carica. Il campione è ora pronto per essere visualizzato per l'analisi SEM-EDS.

Inserire il campione nel supporto nel microscopio. Orientare il campione e posizionarlo sotto la colonna di elettroni. Analizzare l'esempio in modalità VP SEM.

Ottimizza la messa a fuoco e l'astigmatismo secondo necessità. Selezionare l'ingrandimento in modo tale che un singolo organismo riempia l'intero campo visivo. Analizza la distribuzione elementare del calcio sul campione acquisendo una mappa dell'intero campo visivo, esegui la mappa per 15 minuti o più o fino a quando i dati mostrano una localizzazione distinta del calcio all'interno dell'organismo.

Per ottenere la quantificazione dei punti per una regione di interesse, selezionare l'opzione ID punto utilizzando lo strumento Punto singolo. Fare clic sull'area di interesse per eseguire una scansione. Registra attentamente la posizione catturando una serie di immagini con ingrandimenti decrescenti.

Per preparare i campioni per l'EBSD, rimuovere il campione dal supporto piatto del SEM e incollarlo su un tronchetto pre-inclinato di 45 gradi usando vernice d'argento. Utilizzando le immagini SEM di riferimento, localizzare l'animale di interesse e la regione esatta dell'animale da esaminare. Inclinare il tavolino di 25 gradi in modo che la superficie del campione sia ora a circa 70 gradi rispetto al fascio di elettroni.

Alza il palco. Selezionare la modalità EBSD nel software AZtec. Scegli l'aragonite come fasi di interesse.

Inserire la fotocamera EBSD, impostare le condizioni della fotocamera per ottenere un segnale di circa il 90% Utilizzando un raster a fascio veloce, acquisire uno sfondo, quindi catturare un'immagine in azteco. Utilizzando lo strumento Spot Analysis, fare clic sulla posizione del campione che ha mostrato un segnale di calcio più elevato. Eseguire la scansione per vedere se vengono rilevati modelli di Cacucci.

Se i modelli sono presenti e corrispondono a una qualsiasi delle fasi selezionate nel database, verranno automaticamente indicizzati. Proteggere il campione SEM preparato con uno strato di platino mediante rivestimento sputter prima di procedere alla preparazione del microcampione utilizzando un fascio ionico focalizzato. Inserire il campione nella camera FIB SEM, posizionare il campione e acquisire un'immagine di elettroni secondari indotti da ioni.

Individua l'area di interesse dalle immagini di riferimento come precedentemente determinato dalla mappatura EDS in EBSD. Ruotare il tavolino secondo necessità per allineare le caratteristiche di interesse con la cornice della finestra, regolare l'ingrandimento per mostrare l'area per accogliere le caratteristiche di interesse, quindi definire una casella per depositare carbonio e tungsteno. Acquisisci un'istantanea FIB, quindi disegna uno schema di quattro caselle attorno al tappo in tungsteno per definire la posizione del microcampionamento.

Quindi inclinare il tavolino a 58 gradi e tagliare il fondo del microcampione. Inclinare il tavolino a zero, inserire la sonda per microcampionamento al tungsteno, quindi abbassarla fino a quando non tocca il campione. Collegare la sonda di tungsteno e il campione depositando il tungsteno tra la punta della sonda e il rivestimento di tungsteno, quindi eseguire il taglio finale, staccare il microcampione dal resto dell'isola e sollevare la sonda con il microcampione collegato.

Posizionare una semigriglia in rame TEM in un supporto con ingresso laterale, abbassare la sonda in tungsteno fino a quando il microcampione non entra in contatto con la griglia TEM. Il microcampione viene ulteriormente macinato fino a diventare trasparente agli elettroni. Prima dell'analisi TEM, riempire entrambi i dewar con azoto liquido e impostare la tensione di accelerazione a 300 kilovolt.

Posizionare la semigriglia con le lamelle attaccate nel supporto TEM standard. Centrare il raggio sullo schermo al fosforo, contrarre ed espandere il raggio e assicurarsi che tutto il movimento del raggio sia concentrico. Utilizzare le manopole di movimento del tavolino per navigare e localizzare il campione, aumentare l'ingrandimento del campione e regolare l'altezza Z fino a quando il campione non è a fuoco.

Se necessario, utilizzare gli oculari ottici. Inserire la fotocamera e rimuovere lo schermo al fosforo. Espandere il raggio se necessario per evitare di saturare eccessivamente la fotocamera.

Regola la messa a fuoco e i parametri della fotocamera per acquisire un'immagine. Per acquisire un pattern di diffrazione, centrare l'elemento di interesse, rimuovere l'apertura dell'obiettivo e inserire l'apertura di diffrazione. Passa alla modalità Lente di diffrazione.

Inserire il blanker per evitare che il centro del modello di diffrazione bruci la fotocamera o lo schermo al fosforo. Acquisire un'immagine del modello per l'analisi cristallografica. Di seguito sono riportate alcune osservazioni del processo di calcificazione durante la metamorfosi del verme tubolare.

I valori di pH dei vermi tubolari sono aumentati dopo la stimolazione della metamorfosi da parte dell'IBMX e il pH intracellulare ha iniziato ad aumentare oltre l'otto a 31 ore. Il tessuto rilevante per la calcificazione è la regione del colletto. Una mappa sui segnali SEM-EDS mostra che il primo giorno il verme tubolare aveva una distribuzione omogenea di calcio, indicando che il processo di calcificazione non era ancora iniziato.

Due giorni dopo la stimolazione della metamorfosi, alcuni vermi tubolari si erano già calcificati troppo e non erano più adatti per osservare materiali appena calcificati. In un campione di verme tubolare, come quello utilizzato in questo esempio, la calcificazione è ancora allo stadio iniziale, quindi la quantificazione del calcio ha aiutato a determinare la posizione di interesse per caratterizzare la presenza di minerali. Quando esaminata utilizzando SEM-EBSD, l'area localizzata con il forte segnale di calcio aveva anche una struttura cristallina di aragonite.

Utilizzando un fascio ionico focalizzato, il campione è stato preparato per la TEM e il modello di diffrazione del minerale di aragonite è stato analizzato con maggiore dettaglio cristallografico. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come localizzare un evento di mineralizzazione in un organismo multicellulare. Quando la microscopia ottica e la microscopia elettronica vengono utilizzate insieme, possiamo acquisire un grande livello di comprensione fisiologica e materiale del processo di calcificazione.