Multimodali ottici Metodi Microscopia Reveal Polyp Tissue morfologia e struttura in Caribbean Reef costruzione Coralli

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di visualizzare polipi di corallo spessi uno o due millimetri in 3D per comprendere la struttura fine, nonché i pigmenti di corallo e la loro localizzazione. Ciò si ottiene incorporando prima il campione nella cera, quindi tagliando il campione in sezioni di un micron utilizzando un microtomo. Successivamente, viene utilizzata una tecnica di faccia a blocchi seriali progettata su misura per visualizzare i polipi dei coralli e ricostruire l'immagine 3D.

Utilizzando più immagini 2D, si ottengono risultati che mostrano la capacità della tecnica di risolvere i dettagli strutturali fini del tessuto corallino senza comprometterne l'integrità strutturale. Dimostrazione della procedura. Oggi sarà il turno del Dr.Maunde Siva guru, collaboratore del mio gruppo di ricerca.

Per preparare la cera di prefiltrazione, sciogliere 3,6 grammi di manzo in scaglie in un bicchiere di vetro su una piastra calda. Quindi, aggiungi 400 milligrammi di Sudan. Quattro per ridurre al minimo la fluorescenza del fondo di cera, mescolare bene e attendere fino a quando non si ottiene una soluzione traslucida rossa.

Aggiungete poi 81 grammi di paraffina e mescolate bene. Successivamente, aggiungere 15 grammi di barretta VI granulare bianca e sciogliere completamente nello stesso becher. Una volta sciolto, mescolarlo nuovamente per ottenere una soluzione di cera completamente miscelata.

Ora aggiungi il composto in una bottiglia di vetro e chiudi senza stringere con un coperchio. Metti la bottiglia di vetro in un forno ventilato a 60 gradi Celsius per mantenere gli ingredienti allo stato liquido e per tutte le infiltrazioni che avvengono. Questa soluzione può essere portata a 200 millilitri e suddivisa in due bottiglie da 100 millilitri.

Uno per l'infiltrazione e uno per l'inclusione finale dei campioni di corallo della barriera corallina dei Caraibi sono stati raccolti dall'AU e fissati in paraformaldeide sul campo. Per incorporare i tessuti di corallo per SBFI, lavare prima i polipi di corallo raccolti sul campo e conservarli a quattro gradi Celsius in paraformaldeide. Successivamente, lavali in PB S3 volte per cinque minuti ogni volta quando sono pronti per essere ripresi.

Decalcificare i polipi in soluzione ex Cal due per 24 ore o fino a quando i polipi non sono totalmente privi di carbonato di calcio. Incubare diversi polipi di corallo decalcificati come un unico blocco in una serie di etanolo da 25, 50, 75 e 100% seguita da un x xilene. Sostituire per 30 minuti ogni sessione per disidratare i campioni.

Quindi, posizionare i polipi lavorati in xilene al 100%. Sostituire in forno a 65 gradi Celsius per 30 minuti. Successivamente, sostituire con una soluzione fresca e incubare per altri 30 minuti.

Orientare i polipi con la parte superiore rivolta verso il basso e la superficie il più piatta possibile. Crea soluzioni di due a uno, uno a uno e uno a due. Sostituto dello xilene e cera di prefiltrazione.

In provette Falcon da 50 millilitri incubare i polipi di corallo con queste tre concentrazioni crescenti di cera di prefiltrazione, seguite da tre incubazioni in cera di prefiltrazione al 100% per 30 minuti a un'ora ogni volta. Trasferire ora il campione nella cera da inclusione. Rimuovere la cera di inclusione dopo 30 minuti, quindi sostituirla con cera di inclusione fresca e continuare l'incubazione per un minimo di quattro ore a 65 gradi Celsius.

Successivamente, fotografa l'isolato. Ciò è necessario perché una volta incorporato nella cera, la posizione del campione diventerà invisibile poiché la cera rossa incorporata è opaca. Quindi posizionare piccole gocce di cera ad alto punto di fusione attorno al nuovo stampo di incorporamento in acciaio inossidabile preriscaldato e lasciarlo raffreddare.

Versare un piccolo volume di cera da letto appena sciolta dalla seconda aliquota e posizionare rapidamente il polipo di corallo rivolto verso il basso sopra il punto di cera bianca. Quindi posizionare un portacampioni di plastica sul vassoio in acciaio inossidabile e versare altra cera di inclusione in modo che la cera raggiunga la superficie dello stampo di plastica. Ora togli l'intera configurazione dal forno a 65 gradi Celsius e lasciala raffreddare su un banco o una superficie fredda fino a quando la cera non si sarà completamente indurita.

Successivamente, metti il blocco essiccato in frigorifero a quattro gradi Celsius, al riparo dalla luce per una conservazione a lungo termine per sezionare il blocco. Per prima cosa, taglialo e taglia sezioni di un micron. Utilizzando un microtomo, cattura l'immagine della faccia liscia del blocco, che contiene il campione.

ogni volta. Quando una sezione viene rimossa, il campione appare quando la cera bianca inizia a scomparire. Quindi acquisisci le immagini con una fotocamera monocromatica utilizzando un filtro fluorescente adatto per rilevare l'autofluorescenza dei cromatofori o dell'immagine del polipo di corallo, da tre a quattro nuclei decalcificati da ciascun campione.

Per eseguire l'imaging a fluorescenza a due fotoni, posizionare i nuclei dei polipi di corallo lavati in para formaldeide al 4% capovolti in un piatto di vetro coperto utilizzando un laser a due fotoni a 780 nanometri con un'immagine di eccitazione da tre a quattro polipi a due diversi ingrandimenti utilizzando un obiettivo 10x. Quindi, utilizzare la modalità di scansione dei riquadri per raccogliere da 25 a 100 immagini per piano focale in XY a intervalli di 10 o 20 micron. Quindi raccogli da 50 a 100 immagini attraverso l'asse Z a intervalli di 10 o 20 micron, che saranno da 5.000 a 10.000 immagini in totale per polipo di corallo.

Dopo quell'immagine, tre o quattro aree di polipi per rappresentare un nucleo e una specie di corallo. Quindi memorizza tutte le immagini in formato dati grezzi sul disco rigido del sistema. In questa procedura, ritagliare i dati 2D per ridurre le dimensioni del file concentrandosi su un singolo polipo utilizzando lo strumento di ritaglio quadrato e compilarlo come un singolo file TIF.

Nel software di acquisizione. Apri i file assemblati dei dati SBFI o le pile Z multiple affiancate di due sezioni ottiche fotoniche nel modulo di programma EMERIS surpass sotto il progetto dell'algoritmo di volume, i dati SBFI renderizzati in 3D. Utilizzando una proiezione di ombre, creare una modalità ISOSURFACE in cui i voxel sono la soglia per creare un motivo di superficie solida.

Visualizza le proiezioni 3D utilizzando un algoritmo di ritaglio semplice in modalità ortogonale XY, xz e YZ per rivelare la struttura e la forma 3D dei coralli. Quindi anima le proiezioni utilizzando un modulo di animazione con fotogrammi chiave. Nello stesso programma erris, genera file video con compressione del 5% e genera clip video in formato VI utilizzando le modalità volume 3D e isosurface.

Ecco le due immagini 3D a fluorescenza fotonica di polipi di corallo da M Anis e M fa Lata. Queste due immagini sono state catturate senza separazione spettrale dei componenti utilizzando l'eccitazione di 780 nanometri del laser a due fotoni con il segnale ottico raccolto da 450 a 700 nanometri, e queste due immagini sono state raccolte con la stessa eccitazione, ma due rivelatori a tubo moltiplicatore di foto sono stati utilizzati contemporaneamente per raccogliere i dati da due componenti, uno da 500 a 550 nanometri e l'altro da 650 a 720 nanometri. Si tratta di immagini rivestite di profondità.

Il rosso è il componente più superficiale e il blu è il componente più profondo in 2D. Sì. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di preparare correttamente il campione incorporato in cera rossa. La combinazione di imaging facciale a blocchi seriali e microscopia fluorescente a due piedi consente l'analisi della pigmentazione dei coralli e della struttura cellulare su una varietà di scale di lenti.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come gestire e visualizzare i coralli che costruiscono la barriera corallina e le loro proprietà spettrali in tre dimensioni.