Montaggio dell'agar: un metodo di base per montare embrioni vivi di pesce zebra per l'imaging a lungo termine

- Inizia aggiungendo agarosio E3 con punto di fusione medio-basso e riscaldando fino a quando l'agarosio non si dissolve completamente. Raffreddare l'agarosio a 37 gradi Celsius e aggiungere la soluzione di tricaina. Successivamente, anestetizzare gli embrioni aggiungendo tricaina a una piastra di Petri contenente embrioni in terreno E3. Agitare la capsula di Petri per raccogliere gli embrioni al centro.

Utilizzando una pipetta di trasferimento, prelevare un embrione con una quantità minima di terreno. Tenere la pipetta in posizione verticale e far rimbalzare l'embrione per posizionarlo sulla punta della pipetta. Ora metti l'embrione nella soluzione di agarosio senza aggiungere alcun mezzo in eccesso, che diluirebbe l'agarosio e impedirebbe la gelificazione. Mescolare delicatamente l'embrione all'interno dell'agarosio e trasferire la soluzione nel pozzetto di una piastra ai fosfori utilizzando la pipetta.

Posizionare la piastra al microscopio e utilizzare la punta di una pipetta per posizionare l'embrione nell'orientamento desiderato. Una volta che l'agarosio si è solidificato, versarvi sopra del terreno E3 contenente tricaina per mantenere l'agar idratato e visualizzare l'embrione. In un protocollo di esempio, monteremo embrioni di pesce zebra parabiotico per l'imaging e l'analisi.

Per acquisire le immagini degli embrioni fusi, preparare l'agarosio a basso punto di fusione allo 0,8%. Mentre è ancora caldo, aliquotare un millilitro di agarosio in tubi per microfughe da 1,5 millilitri posti in un blocco riscaldante a 37 gradi Celsius. Anestetizzare gli embrioni parabiotici aggiungendo 1 millilitro di tricaina a pH 7,0 da 4 milligrammi per millilitro ai 25 millilitri di terreno E3 contenenti gli embrioni. Agitare delicatamente il piatto in modo che gli embrioni si accumulino al centro.

Quindi, utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica a punta larga, aspirare gli embrioni in meno liquido possibile. Quindi, capovolgere la pipetta in posizione verticale e far rimbalzare delicatamente gli embrioni in modo che si depositino sul fondo della pipetta. Quindi trasferire gli embrioni in un'aliquota di 1 millilitro di agarosio a basso punto di fusione toccando leggermente la punta della pipetta sulla superficie dell'agarosio. Eliminare il liquido in eccesso dalla pipetta e utilizzare la pipetta per mescolare delicatamente gli embrioni nell'agarosio.

Quindi, con la pipetta, trasferire l'agarosio e gli embrioni nel pozzetto di una piastra a sei pozzetti con fondo di vetro. Sotto uno stereomicroscopio, utilizzare una punta di caricamento in gel fissata all'estremità di un ago per stuzzicare per posizionare gli embrioni vicino al vetro di copertura e nell'orientamento desiderato per l'imaging. Dopo che l'agarosio si è solidificato e il terreno con tricaina è stato aggiunto ai pozzetti, utilizzare un microscopio confocale a scansione laser a epifluorescenza a campo largo invertito o un microscopio confocale a disco rotante per acquisire le immagini.

Per un campo visivo dell'intero embrione, utilizzare un soggettivo 4x. Usa un obiettivo 20x per visualizzare un tessuto specifico. Elabora le immagini secondo il protocollo di testo.