Name: Sviluppo di un protocollo di raffinata per Trans-sclerale Subretinal trapianto delle cellule epiteliali del pigmento retinico umano negli occhi di topo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 45 s
Description: Scopri una tecnica di iniezione trans-sclerale sottoretinica per il trapianto di cellule epiteliali del pigmento retinico umano negli occhi di roditori. Questo metodo minimizza i danni retinici e garantisce una consegna riproducibile.

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Desideriamo ringraziare Patty Lederman per la sua assistenza sulla chirurgia e Susan Borden per preparazione delle cellule RPE. Riconosciamo anche NYSTEM C028504 per il finanziamento per questo progetto. Justine d. Miller è supportato da NIH concedere F32EY025931.

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state approvate dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) presso la State University di New York Albany.
1. pre-iniezione preparazione
<ol><li>
Preparazione di una sospensione di cellule hRPESC-RPE Nota: Le seguenti operazioni vengono eseguite in cappuccio sterili per coltura ed è necessario avere familiarità con base tecnica sterile.<ol>
<li>Isolare le cellule di hRPE primario da donatore umano occhi invecchiati 50-90 anni e cellule di coltura in piastre da 24 pozzetti12. Crioconservare le cellule al passaggio 1, disgelo secondo necessità e cultura passaggio 2 (P2) celle per 4-5 settimane (Figura 1A) per iniezione.</li>
		<li>Rimuovere il terreno di coltura12 e delicatamente risciacquo pozzi due volte con 500 µ l pre-riscaldati 1 X tampone di Dulbecco fosfato isotonico senza calcio & magnesio (1 x DPBS-CMF) aggiungendo 1 X DPBS-CMF nei pozzetti usando una pipetta di 1.000 µ l e rimuoverlo utilizzando un vuoto.</li>
		<li>Aggiungere 300 µ l tripsina/dnasi in ciascun pozzetto. Incubare le cellule hRPESC-RPE in tripsina/dnasi (4 kU dnasi per 1 mL di 0,25% tripsina-EDTA) per 4 min a 37 ° C per dissociare le cellule.</li>
		<li>Controllare le cellule al microscopio per vedere se essi sono arrotondati. Continuare a incubare le cellule in tripsina/dnasi per altri 2 minuti, se essi non hanno arrotondato ancora.</li>
		<li>Una volta che le cellule sono arrotondate per eccesso, è possibile utilizzare una pipetta di 1.000 µ l per triturare le cellule distaccate dal pozzo e trasferire la tripsina/dnasi contenenti cellule indipendente in una provetta conica da 15 mL con uguale volume di terreno di coltura pre-riscaldato, per inattivare la tripsina/dnasi.</li>
		<li>Lavare i pozzetti con pre-riscaldato 1 X DPBS-CMF pipettando delicatamente su e giù, specialmente intorno ai bordi del pozzo; quindi aggiungere queste cellule al precedente tubo conico.</li>
		<li>Centrifugare la provetta conica a 286 x g per 5 min a 4 ° C per agglomerare le cellule.</li>
		<li>Rimuovere il supernatante e risospendere le cellule con 1 mL di terreno di coltura.</li>
		<li>Contare le celle utilizzando un emocitometro.</li>
		<li>Centrifugare a 286 x g per 5 min a 4 ° C per agglomerare le cellule.</li>
		<li>Rimuovere il supernatante e risospendere le cellule in sterile bilanciato sale soluzione (BSS) a 50.000 cellule / µ l (per fornire 50.000 cellule in 1 µ l di volume durante l'iniezione subretinal).</li>
		<li>Trasferire la sospensione cellulare finale (CS) in un tubo del microcentrifuge 1,7 mL e mantenere in una miscela di acqua e ghiaccio fino all'utilizzo di iniezione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione dell'iniettore di cella
	<ol>
<li>Inserire un ago smussato 33 sterile nella siringa per iniezione ed avvitare strettamente per assemblare l'iniettore.</li>
		<li>Pulire l'iniettore con etanolo 100% 5 - 6 volte.</li>
		<li>Pulire l'iniettore con etanolo al 70% 5 - 6 volte.</li>
		<li>Pulire l'iniettore con BSS 5 - 6 volte.</li>
		<li>Contrassegnare l'ago dell'iniettore con un pennarello nero sterile in una posizione di 600 µm distanza dalla punta dell'ago sotto il microscopio per dissezione (Figura 1B).</li>
		<li>Posizionare l'iniettore su un micromanipolatore per iniezione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. subretinal iniezione
<ol><li>
Area chirurgica e preparazione degli animali
	<ol>
<li>Pesare un ratto RCS (60-100 g) di 4-5 settimane vecchio e anestetizzare utilizzando il sistema di erogazione del vapore isoflurano. Nota: Per indurre l'anestesia mantenere il tasso di flusso di isoflurane al 5%. Confermare la profondità dell'anestesia con le zampe e quindi ridurre il tasso di flusso a 2-3% per la manutenzione di anestesia durante l'intervento chirurgico.</li>
		<li>Posizionare un drappo di chirurgia sterile, con un rilievo di riscaldamento sotto, sul palco del microscopio per dissezione per impostare una zona operatoria sterile.</li>
		<li>Trasferire il ratto l'area chirurgica e posizionarla ratto in un cono di naso collegato al sistema isoflurano per mantenere l'anestesia.</li>
		<li>Coprire il corpo del ratto con garza. Un pizzico di punta del ratto per confermare l'anestesia completa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Trans-sclerale iniezione subretinal sotto il microscopio
	<ol>
<li>Applicare una goccia di lubrificante occhio sull'occhio non operato del ratto.</li>
		<li>Posizionare il ratto sul suo lato destro con il suo occhio sinistro rivolto verso il soffitto per iniezione, la testa verso destra del chirurgo e le spalle verso il chirurgo.</li>
		<li>Tagliare qualsiasi baffi che coprono l'occhio con piccole forbici.</li>
		<li>Una piccola quantità di lavaocchi da lato temporale dell'occhio sinistro a goccia e raccogliere l'eccesso sul lato nasale con un applicatore di cotone per sciacquare l'occhio.</li>
		<li>Dilatare la pupilla con 1% tropicamide e 2,5% fenilefrina (preparata da fenilefrina 10% diluendo in soluzione fisiologica 0,9% sterile il giorno dell'intervento) per un esame OCT post-iniezione applicando una goccia di ciascuno.</li>
		<li>Tirare delicatamente la pelle che circonda l'occhio 4 - 6 volte per aprire la palpebra in modo che l'occhio è leggermente proptosed per facilitare l'accesso alle regioni posteriori al limbus.</li>
		<li>Applicare una goccia di lavaocchi e mantenere umido occhio.</li>
		<li>Delicatamente triturare il CS (preparato al punto 1.1.12) e caricare l'iniettore con 1,2 µ l CS. L'extra 0,2 µ l è utilizzato per compensare il riflusso di iniezione. Nota: Basato su nostre misurazioni, circa 5.000-8.000 celle vengono persi nel riflusso con un'iniezione di 50.000 cellule / µ l che è uguale a circa il 10-16% di perdita delle cellule e un extra di 0,2 µ l CS è stato iniettato per compensare questa perdita di cellule.</li>
		<li>Posizionare l'iniettore riempito con CS su un micromanipolatore (o avere un assistente tenerlo) verticalmente come RPE cellule tendono ad affondare facilmente in sospensione.</li>
		<li>Applicare una goccia di 0.5% proparacaine (anestetico locale) sull'occhio e rimuovere l'eccesso con un applicatore di cotone. Nota: Questo passaggio dovrebbe sopprimere il riflesso corneale e impedire che l'occhio lampeggi durante i passaggi successivi.</li>
		<li>Utilizzare pinze per afferrare la congiuntiva posteriormente al limbus, ruotare l'occhio per via nasale e sollevare la congiuntiva per fare una "tenda".</li>
		<li>Usare le forbici per tagliare la parte superiore della "tenda" per fare una piccola apertura nel conjunctiva ed esporre la sclera sottostante.</li>
		<li>Utilizzare pinze per afferrare il bordo del margine restante congiuntiva accanto al limbus e ruotare l'occhio per via nasale in modo che l'asse pupillare è un angolo di circa 30 gradi rispetto al piano del tavolo (Figura 1). Costante di presa del margine congiuntiva è necessaria per fornire una contro-forza durante gli inserimenti dell'ago e per mantenere l'occhio ad un angolo ottimo.</li>
		<li>Per realizzare un foro pilota per iniezione di cellule, posizionare l'estremità di un ago sterile smussato 31-calibro insulina a 1.200-1.500 µm posteriormente al limbus con l'apertura della punta rivolta verso l'alto.</li>
		<li>Regolare l'angolo dell'ago dell'insulina in modo che è 10-15 gradi di sopra della sclera (tangenziale di un piano immaginario al sito di iniezione desiderato). Lentamente penetrare il complesso sclera-coroide alla profondità dell'ago di circa 500 µm. Nel ratto pigmentato, l'estremità dell'ago sarà 'scomparire' sotto coroidico pigmentato. Per la marca di insulina ago usato qui, la distanza tra la punta dell'ago e la smussatura è 500 µm.</li>
		<li>Estrarre delicatamente l'ago da insulina (una molto piccola effusione del sangue può essere visto).</li>
		<li>Se si nota un eccessivo sanguinamento, lancia un occhio può essere applicata per deselezionare il foro, se necessario. Emorraggia continuata dopo l'applicazione lancia indica una nave potrebbe essere danneggiato.</li>
		<li>Guida ago dell'iniettore cella-caricato di RPE nel foro pilota, con l'apertura rivolta verso il basso e con un angolo di circa 10-15 gradi rispetto alla superficie locale della sclera.</li>
		<li>Inserire delicatamente l'ago dell'iniettore nel foro pilota ad una profondità di circa 500 µm per accedere allo spazio subretinal. Ci dovrebbe essere circa un margine di 100 µm tra il bordo del marchio penna nera e il punto dove l'ago è coperto da coroidico pigmentato (Figura 1 e 1 D).</li>
		<li>Chiedere all'assistente di premere delicatamente lo stantuffo della siringa iniettore per iniettare il volume appropriato di cellule (circa 1,2 µ l). Essere pronti a fornire alcune contro-forza come assistente preme sullo stantuffo. Nota: Prassi precedente finto con l'assistente possono fornire sia il chirurgo e l'assistente con la necessaria esperienza con questo passaggio.</li>
		<li>Mentre visivamente concentrandosi sulla penna segnare bordo, fissano l'iniettore per 25-30 s e poi ritirare lentamente l'iniettore. Una piccola quantità di riflusso è osservata comunemente. Nota: Se nessun riflusso è osservato, ci può essere stato un'iniezione intravitreale. Se vedete riflusso attraverso il sigillo o cellule di riempimento sotto la sclera, l'iniezione era troppo bassa.</li>
		<li>Risciacquare l'efflusso di cellulare dal sito di iniezione con il lavaocchi sterile 3 volte e raccogliere l'eccesso con un applicatore di cotone.</li>
		<li>Applicare una goccia di lubrificante occhio occhio operato e il ratto di trasferimento alla stazione OCT per esaminare la posizione delle cellule trapiantate e le dimensioni della vescichetta subretinal.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. post-iniezione trattamento
<ol><li>
Trattamento analgesico antinfiammatorio e dolore
	<ol>
<li>Iniettare buprenorfina a 0,1 mg/kg di peso corporeo in soluzione fisiologica per via sottocutanea per diminuire il dolore.</li>
		<li>Iniettare desametasone a 1,6 mg/kg di peso corporeo in soluzione salina tramite l'iniezione intraperitoneale (I.P.) per controllo di infiammazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Recupero degli animali
	<ol>
<li>Restituire il ratto della gabbia di recupero sotto una lampada di calore per mantenere la temperatura corporea.</li>
		<li>Osservare l'occhio operato per segni di emorragia.</li>
		<li>Osservare il ratto affinché che si tratta dall'anestesia.</li>
		<li>Restituire l'animale recuperato a una gabbia fresca flag la gabbia con una carta di chirurgia e monitorare quotidianamente per eventuali segni di afflizione, emorragia oculare o opacità corneali. Notificare immediatamente il veterinario se ci sono preoccupazioni.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

La tecnica di iniezione subretinal illustrata in questo articolo è via la via trans-sclerale, dove l'ago dell'iniettore penetra gli strati più esterni della parete dell'occhio (sclera-coroide-RPE complesso) senza danneggiare la retina neurale o disturbare la cavità vitrosa. Un approccio alternativo trans-vitreal ha un potenziale rischio di danno di lente che porta alla cataratta, dal momento che l'obiettivo dei roditori occupa la maggior parte della cavità vitrosa. Rispetto a questo metodo, la nostra tecnica è meno risch...

La retina umana situato sul retro le funzioni dell'occhio come un leggero tessuto sensoriale e svolge un ruolo critico nella percezione visiva. Disfunzione delle cellule retiniche o morte delle cellule di conseguenza causa problemi alla vista o cecità permanente. Disordini che coinvolgono la degenerazione o disfunzione delle cellule in diversi strati della retina sono conosciuti come malattie degenerative retiniche, tra cui AMD è il tipo più comune e la causa principale di cecità irreversibile negli anziani nei paesi sviluppati 1,2. Il processo patologico di AMD è associato con accumulazione "drusen" tra lo strato RPE e della membrana di Bruch sottostante, che a sua volta altera supporto RPE di fisiologia del fotoricettore, che conduce all'atrofia della retina neurale e visione perdita3, 4,5. Finora, non esiste una cura per avanzati (non neovascolare) DMLE secca. L'emergere della terapia con cellule staminali come un nuovo paradigma nella medicina rigenerativa porta la speranza di sostituire le cellule RPE disfunzionali o morte con cellule staminali derivate le cellule sane. Infatti, vasti studi preclinici di trapianto staminali (ad es., cellule staminali embrionali umane)-derivate cellule RPE in RPE-degenerativa modelli animali sono stati eseguiti6,7, alcuni dei quali hanno progredetto per studi clinici8,9 (NCT01344993, ClinicalTrials.gov). Recentemente, una fonte alternativa di cellule staminali residenti nel livello RPE umano, le cellule staminali umane di RPE (hRPESCs), è stata identificata dal nostro laboratorio e attualmente è utilizzata negli studi preclinici di terapia di trapianto cellulare (hRPESC-RPE) di hRPESC derivato-RPE per AMD 10 , 11 , 12 , 13.
La tecnica di iniezione subretinal è applicata negli studi preclinici citati sopra da più gruppi, tra cui il nostro gruppo. Ci sono due approcci generali per iniezione subretinal negli animali: trans-vitreal e trans-sclerale. L'approccio trans-vitreal ha il vantaggio del chirurgo essendo in grado di osservare direttamente l'estremità dell'ago come penetra l'occhio anteriore, attraversa la cavità intera vitreal adiacente alla lente e penetra la retina sul retro per l'occhio per raggiungere il subretinal spazio14,15,16. Tuttavia, occorre interrompere la retina in due posizioni (anteriore e posteriore), comporta il rischio di danneggiare la lente e può causare riflusso delle cellule nel corpo vitreo quando l'ago è ritirato. Al contrario, l'approccio trans-sclera, in linea di principio, evita il coinvolgimento della retina e vitreo e riflusso esce l'occhio. In roditori pigmentate, il chirurgo può osservare inizialmente penetrazione della sclera, ma dopo il passaggio in coroidico pigmentato, l'estremità dell'ago non è più visibile. Senza osservazione diretta, violando la retina è comune e può provocare dissezione retinica e consegna di cellule e/o sangue nel vitreo. Inoltre, poiché la superficie dell'occhio è curvo, è molto difficile sapere quali gli angoli dell'ago e la profondità sono più efficaci per iniezioni trans-sclerale.
In questo articolo visualizzato in quel momento, vi presentiamo un metodo di iniezione subretinal trans-sclerale informato mediante l'uso di valutazioni post-chirurgiche con tomografia a coerenza ottica (OCT), che consente un esame dettagliato del sito di iniezione. La nostra tecnica di iniezione trans-sclerale utilizza posizioni definite, angoli e profondità per aghi per iniezione per produrre trauma chirurgico molto basso e l'alta affidabilità. Qui, dimostriamo in particolare l'iniezione di cellule hRPESC-RPE nello spazio subretinal del ratto RCS, un modello preclinico di AMD umano. Con questo metodo di iniezione, correttamente e coerentemente consegnammo le cellule hRPESC-RPE nello spazio subretinal di occhi di topo RCS con un tasso di successo molto alta. Iniezione delle cellule precedentemente è stato trovato per causare nella conservazione dei fotorecettori RCS almeno 2 mesi dopo iniezione13. Questa procedura viene eseguita sotto il microscopio per dissezione ed è facile da imparare. Richiede due persone (un chirurgo e un assistente) per eseguire l'iniezione e il tempo medio di iniezione per ogni animale è meno di 5 minuti. Gli angoli definiti e le profondità per aghi per iniezione rendono possibile per i laboratori, dove non è disponibile, per ottenere successo iniezione subretinal OCT. Esso permette un accesso subretinal altamente riproducibile e può essere utilizzato non solo per trapianto di cellule, ma anche per terapie farmacologiche consegna e gene.

<table><tbody><tr><td>0,25% Tripsina-EDTA (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>DNAsi I</td><td>Sigma</td><td>DN-25</td><td></td></tr><tr><td>1xDulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato senza calcio e Magnesio (1xDPBS-CMF)</td><td>Corning Cellgro</td><td>431219</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina bilanciata sterile (BSS)</td><td>Alcon</td><td>00065079550</td><td></td></tr><tr><td>Lavaocchi sterile</td><td>Moore Medical</td><td>75519</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione fisiologica sterile 0,9%</td><td>Hospira</td><td>488810</td><td></td></tr><tr><td>Proparacaina cloridrato Soluzione oftalmica (0,5%)</td><td>Akorn</td><td>17478026312</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione oftalmica Tropicamide, USP (1%)</td><td>Bausch & Lomb</td><td>24208058559</td><td></td></tr><tr><td>Fenileferina Soluzione Oftalmica, USP (10%) stock</td><td>Bausch & Lomb</td><td>42702010305</td><td>Questo è usato per produrre 2,5% fenileferina</td></tr><tr><td>Buprenex</td><td>Patterson</td><td>433502</td><td></td></tr><tr><td>desametasone</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td>63323051610</td><td></td></tr><tr><td>100% etanolo</td><td>Thermo Scientific</td><td>615090040</td><td></td></tr><tr><td>70% etanolo</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>2546.70-5</td><td></td></tr><tr><td>Sterile GenTeal Lubricant Eye Gel</td><td>Novartis</td><td>78042947</td><td></td></tr><tr><td>Gocce oculari sterili Systane Ultra Lubricant Alcon</td><td></td><td>00065143105</td><td></td></tr><tr><td>cellule hRPESC-RPE</td><td>Non disponibile in</td><td></td> commercio <td>Fare riferimento al "Riferimento #12" per l'isolamento e la manutenzione delle cellule.</td></tr><tr><td>Piastre a 24 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche (15 ml)</td><td>Sarstedt</td><td>62554002</td><td></td></tr><tr><td>Tappo per microcentrifuga con o-ring</td><td>LPS inc</td><td>L233126</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga senza tappo (1,7 ml)</td><td>LPS inc</td><td>L233041</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>Salvietta sterile imbevuta di alcol</td><td>McKesson</td><td>58-204</td><td></td></tr><tr><td>Applicatori sterili per punte in cotone</td><td>McKesson</td><td>24-106-2S</td><td></td></tr><tr><td>lance sterili Weck-Cel</td><td>Beaver-Visitec International&nbsp;</td><td></td><td></td>0008680</tr><tr><td>Teli chirurgici sterili</td><td>McKesson</td><td>25-515</td><td></td></tr><tr><td>Garza</td><td>McKesson</td><td>16-4242</td><td></td></tr><tr><td>Siringa Nanofil (10 ul)</td><td>World Precision Instruments</td><td>Nanofil</td><td></td></tr><tr><td>Ago smussato calibro 33</td><td>World Precision Instruments</td><td>NF33BV-2</td><td></td></tr><tr><td>Aghi per siringhe da insulina calibro 31</td><td>Becton Dickinson</td><td>328418</td><td></td></tr><tr><td>Pinze dentate per topi</td><td>World Precision Instruments</td><td>555041FT</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Micro Forbici a molla per dissezione</td><td>Roboz</td><td>RS-5602</td><td></td></tr><tr><td>Pompa a T per circolazione dell'acqua&nbsp;</td><td>Stryker</td><td>TP700</td><td></td></tr><tr><td>Termoforo</td><td>Kent Scientific</td><td>TPZ-814</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di anestesia animale</td><td>World Precision Instruments</td><td>EZ-7000</td><td></td></tr><tr><td>Bilancia</td><td>Ohaus</td><td>PA1502</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Sorgente luminosa per microscopio</td><td>Schott</td><td>serie</td><td></td></tr> <tr><td>ACEBioptigen Envisu Spectral Domain Ophthalmic Imaging System</td><td>Bioptigen</td><td>R2210</td><td></td></tr><tr><td>Pennarello nero sterile</td><td>Viscot Industries</td><td>1416S-100</td><td></td></tr><tr><td>Scala di misurazione in miniatura</td><td>Ted Pella Inc</td><td>13623</td><td></td></tr><tr><td>Lampada spot a infrarossi per crogiolarsi&nbsp;</td><td>EXO-TERRA</td><td>PT2144</td><td>Viene utilizzata come lampada riscaldante per gli animali durante la fase di recupero post-chirurgico</td></tr></tbody></table>

sviluppo di un protocollo di raffinata per trans-sclerale subretinal trapianto delle cellule epiteliali del pigmento retinico umano negli occhi di topo

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Malattie degenerative retiniche come la degenerazione maculare senile (AMD) sono la principale causa di perdita irreversibile di visione in tutto il mondo. AMD è caratterizzata dalla degenerazione delle cellule epiteliali del pigmento retinico (RPE), che sono un monostrato di cellule funzionalmente sostenendo e anatomicamente avvolgendo intorno alla retina neurale. Gli attuali trattamenti farmacologici per non neovascular AMD (AMD secca) solo rallentano la progressione della malattia ma non possono ripristinare la visione, che necessitano di studi finalizzati ad individuare nuove strategie terapeutiche. Sostituendo le cellule RPE degenerative con cellule sane detiene promessa per il trattamento di AMD secca in futuro. Vasti studi preclinici di terapie di sostituzione della cellula staminale per AMD prevedono il trapianto di cellule staminali derivate cellule RPE nello spazio subretinal di modelli animali, in cui viene applicata la tecnica di iniezione subretinal. L'approccio più frequentemente utilizzato in questi studi sugli animali preclinici è attraverso la via trans-sclerale, che è reso difficile dalla mancanza di visualizzazione diretta dell'estremità dell'ago e spesso può provocare danni alla retina. Un approccio alternativo attraverso il vitroso consente per l'osservazione diretta della posizione di estremità dell'ago, ma trasporta un alto rischio di traumi chirurgici come altri tessuti dell'occhio sono disturbati. Abbiamo sviluppato un metodo di iniezione trans-sclerale modificate meno rischioso e riproducibile che utilizza aghi definito diverse angolazioni e profondità correttamente e costantemente fornire cellule RPE nello spazio subretinal ratto ed evitare eccessivi danni alla retina. Trasportati in questo modo le cellule sono state dimostrate in precedenza per essere efficace nel ratto Royal College of Surgeons (RCS) per almeno 2 mesi. Questa tecnica può essere utilizzata non solo per trapianto di cellule, ma anche per la consegna di piccole molecole o terapie geniche.

Utilizzando la tecnica descritta in questo articolo, abbiamo consegnato costantemente le cellule hRPESC-RPE nello spazio subretinal dei ratti RCS con precisione il controllo della posizione, angolo e profondità dell'inserimento dell'ago dell'iniettore nel tessuto (Figura 1B-D ). Immediatamente dopo trapianto, un esame OCT è stato effettuato per osservare il sito di iniezione e la vescichetta subretinal creato dalle cellule trapiantate. Valutazione post-ch...

Iniezione subretinal è stato ampiamente applicato negli studi preclinici di terapia sostitutiva delle cellule staminali per degenerazione maculare senile. In questo articolo visualizzato in quel momento, descriviamo una tecnica di iniezione subretinal meno rischioso, riproducibile e precisamente modificati tramite l'approccio trans-sclerale per fornire cellule negli occhi del ratto.

Sviluppo di un protocollo di raffinata per Trans-sclerale Subretinal trapianto delle cellule epiteliali del pigmento retinico umano negli occhi di topo

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

L'obiettivo generale di questo video è presentare una tecnica riproducibile di iniezione trans-sclerale sotto-retinica per somministrare cellule epiteliali pigmentate retiniche umane, o cellule RPE, nello spazio sotto-retinico degli occhi di roditori con rischio minimo di danni alla retina. Questo viene ottenuto innanzitutto praticando un piccolo taglio nella congiuntiva temporale posteriore al limbo per esporre la sclera sottostante. Successivamente, un ago da insulina beccuccio da 31 gauge viene utilizzato per penetrare il complesso sclera-core inserendo l'ago di 500 micrometri o circa metà della punta nel tessuto, con il lato smussato rivolto verso l'alto, al fine di creare un foro guida.Successivamente, un ago da iniezione conico da 33 gauge collegato a una siringa viene guidato nel foro pilota e inserito a un angolo e profondità specifici; il foro di iniezione si sigilla autonomamente dopo il ritiro dell'ago e non è necessario alcun punto di sutura o colla tissutale. Le retinopatie degenerative comprendono un ampio spettro di malattie che coinvolgono diversi tipi cellulari retinici. A livello mondiale, la malattia più comune è la degenerazione maculare legata all'età, o AMD, che si verifica negli anziani e porta a cecità permanente.I cambiamenti patologici che si verificano nel DMLA coinvolgono una degenerazione iniziale delle cellule epiteliali pigmentate retiniche, o RPE. La perdita di RPE porta a disfunzione o morte dei fluororecettori retinici. I trattamenti farmacologici attuali per la fase iniziale del DMLA si limitano a rallentare la progressione o alleviare i sintomi.Questo, unito a un potenziale rigenerativo limitato della retina, significa che non esiste un trattamento efficace per ripristinare la vista. L'Istituto di Ricerca sulle Cellule Staminali Neurali ha recentemente identificato una popolazione di cellule staminali adulte all'interno della popolazione di cellule dell'epitelio pigmentato retinico (RPE). Queste cellule possono essere utilizzate come fonte per la terapia di sostituzione con cellule staminali.Attualmente il nostro istituto sta conducendo studi preclinici per valutare l'efficacia e la sicurezza della terapia tramite trapianto di cellule staminali dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) in un modello animale di ratto con degenerazione dell'RPE. In questo studio, utilizziamo una tecnica di iniezione trans-sclerale e sottoretinica per somministrare le cellule staminali dell'RPE negli occhi del ratto, tra i livelli retinico e dell'RPE. Il nostro metodo rappresenta un mezzo semplice e affidabile per ottenere una corretta somministrazione delle cellule nello spazio sottoretinico.Saranno necessari i seguenti reagenti e attrezzature. La tropicamide all'1% e la fenilefrina al 2,5%, appena preparate diluendo la fenilefrina al 10% in soluzione salina sterile allo 0,9% il giorno dell'intervento chirurgico, vengono utilizzate per dilatare la pupilla. La soluzione fisiologica per occhi viene usata per risciacquare l'occhio e mantenere umido l'occhio non operato.Un lubrificante oculare viene utilizzato per mantenere umido l'occhio destro non operato durante l'intervento chirurgico. La proparacaina allo 0,5% viene utilizzata come anestetico locale. Un lubrificante oculare viene applicato sull'occhio sinistro operato durante la scansione OCT.Per questa tecnica è necessaria una quantità minima di materiale e attrezzature. Le informazioni dettagliate sull'attrezzatura e sui reagenti utilizzati in questa tecnica sono descritte nel protocollo. Una siringa da 10 microlitri viene utilizzata per iniettare le cellule.Prima dell'iniezione, assembliamo innanzitutto l'injector e lo sterilizziamo con etanolo. Inserire un ago sterile da 33 gauge con estremità smussata nella siringa e avvitare saldamente per assemblare l'injector. Sciacquare l'injector con etanolo al 100%, quindi con etanolo al 70% e infine con acqua distillata deionizzata, rispettivamente per cinque o sei volte ciascuno.Contrassegnare l'ago della siringa con un pennarello nero sterile in una posizione distante 600 micron dalla punta dell'ago. Posizionare la siringa su un micromanipolatore per l'uso in iniezione. Le cellule di RPE umane vengono preparate il giorno dell'intervento chirurgico e mantenute in una miscela di ghiaccio e acqua.Triturare delicatamente la sospensione cellulare e caricare l'iniettore con 1,2 microlitri; i 0,2 microlitri aggiuntivi servono per compensare il reflusso durante l'iniezione, garantendo così un volume effettivo di iniezione pari a un microlitro. Sostituire l'iniettore riempito con la sospensione cellulare sul micromanipolatore, oppure farlo tenere verticalmente da un assistente, poiché le cellule dell'epitelio pigmentato retinico tendono facilmente a sedimentare nelle soluzioni. Preparare l'area chirurgica sterile posizionando un tappetino chirurgico sterile con un termo-riscaldatore al di sotto sul piano del microscopio stereoscopico.Tutte le procedure che coinvolgono animali sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della State University of New York di Albany. Pesare l'animale e anestetizzarlo utilizzando il sistema di somministrazione di vapore di isoflurano come mostrato qui. Trasferire il ratto nell'area chirurgica una volta che è anestetizzato e posizionarlo in un cono nasale collegato al sistema di isoflurano per mantenere l'anestesia.Coprire il corpo del ratto con una garza e pizzicare l'alluce del ratto per confermare l'anestesia completa. Applicare una goccia di lubrificante oculare sull'occhio destro del ratto, posizionare il ratto sul fianco destro, con l'occhio sinistro rivolto verso l'alto per l'iniezione, la testa rivolta verso la mano destra del chirurgo e la schiena verso il chirurgo. Rimuovere eventuali vibrisse che coprono l'occhio.Applicare una piccola quantità di soluzione lavante oculare sul lato temporale dell'occhio sinistro e raccogliere l'eccesso sul lato nasale con un bastoncino di cotone per sciacquare l'occhio. Dilatare la pupilla con tropicamide 1% e fenilefrina 2,5%, per un esame di tomografia a coerenza ottica (OCT) post-iniezione, applicando una goccia di ciascun farmaco. Applicare una goccia di soluzione lavante per mantenere l'occhio umido.Applicare una goccia di Proparacaina sull'occhio e rimuovere l'eccesso con un applicatore di cotone. Massaggiare delicatamente la pelle circostante l'occhio da quattro a sei volte per aprire la palpebra, in modo che l'occhio sporga temporaneamente e leggermente dalla sua orbita, consentendo un facile accesso dell'ago della siringa. Usare le pinze per afferrare la congiuntiva posteriore al limbo e ruotare l'occhio per individuare un punto migliore per l'intervento chirurgico, senza danneggiare i muscoli oculari.Sollevare delicatamente la congiuntiva per formare una tenda e ruotare l'occhio in direzione nasale. Quindi utilizzare le forbici per tagliare la parte superiore della tenda, creando un piccolo foro nella congiuntiva ed esponendo la sclera. Successivamente, utilizzare la pinzetta per afferrare il bordo dell'apertura nella congiuntiva vicino al limbo ed ruotare l'occhio in direzione nasale, in modo che l'asse pupillare formi un angolo di circa 30 gradi rispetto al piano orizzontale.Un ago sterile per insulina da 31 gauge con bevel viene utilizzato per penetrare il complesso sclerale con il bevel rivolto verso l'alto e metà della punta, pari a circa 500 micrometri, inserita nel tessuto, al fine di creare un foro guida per l'iniezione. Ritirare con attenzione l'ago per insulina, e potrebbe essere visibile una piccola effusione di sangue. Se necessario, si può applicare un puntale oftalmico per pulire il foro e arrestare l'emorragia.Guidare l'ago dell'iniettore caricato con cellule RPE nel foro pilota con un angolo di circa 10-15 gradi rispetto alla superficie locale della sclera, per raggiungere lo spazio subretinico inserendo l'ago per una lunghezza di 500 micron completamente nel tessuto e lasciando una distanza di 100 micron tra il punto dell'ago ricoperto dal tessuto e il punto del contrassegno nero sull'ago. Chiedere all'assistente di premere lo stantuffo della siringa per iniettare il volume appropriato di cellule. Mantenere l'iniettore in posizione per 25-30 secondi dopo l'iniezione, quindi ritrarre lentamente l'iniettore.Il foro di iniezione si sigilla automaticamente e comunemente si osserva un piccolo rigurgito di circa 0,2 microlitri. Sciacquare la sede di iniezione con soluzione fisiologica sterile per tre volte e raccogliere l'eccesso con un applicatore di cotone. Applicare una goccia di lubrificante sull'occhio operato e trasferire il ratto alla stazione OCT per esaminare la localizzazione delle cellule trapiantate e le dimensioni della bolla subretinica.Riportare il ratto nella gabbia di recupero sotto una lampada a infrarossi per mantenere la temperatura corporea una volta terminata l'OCT. Osservare il ratto per assicurarsi che esca dall'anestesia e monitorarlo quotidianamente per eventuali segni di malessere. Avvertire immediatamente il veterinario in caso di preoccupazioni.Utilizzando la nostra tecnica, abbiamo impiantato in modo costante e con successo cellule epiteliali pigmentate retiniche umane nello spazio sottoretinico. Immediatamente dopo il trapianto, abbiamo eseguito un'esame mediante tomografia a coerenza ottica (OCT) per osservare il sito di iniezione e la bolla sottoretinica creata dalle cellule trapiantate. Questo esame rappresenta uno strumento di screening efficace per valutare la qualità delle iniezioni e il grado di danno retinico o di emorragia.Una riflessione luminosa intensa intorno al sito di iniezione e una bolla subretinica riempita con la sospensione cellulare erano visibili durante la scansione OCT. Non si osservano emorragie, perdite di liquido intraoculare o distacchi della retina intorno al sito di iniezione o nello spazio intravitreale in caso di iniezione riuscita, dimostrando il minimo trauma provocato dall'iniezione. Gli occhi dei ratti operati sono stati prelevati, fissati e sezionati per l’analisi immunostorica a sette giorni dal trapianto.Il marcatore nucleare umano, Hunu, e il marcatore delle cellule dell'epitelio pigmentato della retina (RPE), OTX2, sono stati utilizzati per rilevare le cellule trapiantate. Una positività per entrambi i marcatori ha dimostrato che le cellule umane dell'epitelio pigmentato della retina trapiantate si trovavano nello spazio sottoretinico degli occhi dei ratti. Questa tecnica di iniezione sottoretinica trans-sclerale è semplice e facile da apprendere.Provoca meno trauma chirurgico e lascia intatta la retina facendo passare l'ago di iniezione attraverso gli strati esterni della parete oculare, senza ledere la retina neurale. Le gocce quantificate per l'ago pilota e per l'ago di iniezione durante la penetrazione nel tessuto e l'angolo utilizzato durante l'iniezione permettono un rilascio affidabile delle cellule nello spazio subretinico con un'accuratezza e un tasso di successo molto più elevati. Con questo metodo di iniezione, abbiamo consegnato in modo costante e con successo cellule RPE derivate da cellule staminali RPE umane nello spazio subretinico di ratti RCS.Questa procedura può essere facilmente ripetuta da chiunque guardi il video.

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Qui presentiamo un protocollo accettato dalla comunità in formato multimediale per l'iniezione sottoretinica di un bolo di cellule RPE in ratti e topi. Questo approccio può essere utilizzato per determinare i potenziali di salvataggio, i profili di sicurezza e le capacità di sopravvivenza delle cellule RPE trapiantate dopo l'impianto in modelli animali di degenerazione retinica.

Esecuzione sottoretinico Iniezioni in roditori di agire cellule retiniche epitelio pigmentato in sospensione

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Sviluppo di un protocollo di raffinata per Trans-sclerale Subretinal trapianto delle cellule epiteliali del pigmento retinico umano negli occhi di topo (Video) | JoVE Journal

Sviluppo di un protocollo di raffinata per Trans-sclerale Subretinal trapianto delle cellule epiteliali del pigmento retinico umano negli occhi di topo

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