Sviluppo di un protocollo di raffinata per Trans-sclerale Subretinal trapianto delle cellule epiteliali del pigmento retinico umano negli occhi di topo

Iniezione subretinal è stato ampiamente applicato negli studi preclinici di terapia sostitutiva delle cellule staminali per degenerazione maculare senile. In questo articolo visualizzato in quel momento, descriviamo una tecnica di iniezione subretinal meno rischioso, riproducibile e precisamente modificati tramite l'approccio trans-sclerale per fornire cellule negli occhi del ratto.

L'obiettivo generale di questo video è quello di introdurre una tecnica di iniezione sottoretinica trans-sclerale riproducibile per fornire cellule epiteliali pigmentate retiniche umane, o RPE, nello spazio sottoretinico degli occhi del roditore con un rischio minimo di danni alla retina. Questo si ottiene praticando prima una piccola incisione nella congiuntiva temporale posteriore al limbus per esporre la sclera sottostante. Quindi, un ago da insulina smussato calibro 31 viene utilizzato per penetrare il complesso centrale della sclera inserendo l'ago a 500 micron o circa metà della punta nel tessuto con il lato smussato rivolto verso l'alto per creare un foro pilota.

Successivamente, un ago per iniezione smussato calibro 33 collegato a una siringa viene guidato nel foro pilota e inserito con un'angolazione e una profondità specifiche, il foro di iniezione si sigilla automaticamente dopo che l'ago è stato retratto e non è necessario alcun punto o colla per tessuti. Le retinopatie degenerative sono costituite da un ampio spettro di malattie che coinvolgono diversi tipi di cellule retiniche. In tutto il mondo la malattia più comune, la degenerazione maculare legata all'età, o AMD, si verifica tra gli anziani e porta alla cecità permanente.

I cambiamenti patologici che si verificano nell'AMD comportano una degenerazione iniziale delle cellule epiteliali pigmentate retiniche, o RPE. La perdita di RPE porta alla disfunzione o alla morte dei fluororecettori retinici. Gli attuali trattamenti farmacologici per la AMD in fase iniziale si limitano a rallentare la progressione o ad alleviare i sintomi.

Questo, unito a un limitato potenziale rigenerativo della retina, significa che non esiste un trattamento efficace per ripristinare la vista. Il Neural Stem Cell Institute ha recentemente identificato una popolazione di cellule staminali adulte nella popolazione di cellule RPE. Queste cellule possono essere utilizzate come fonte per la terapia sostitutiva con cellule staminali.

Attualmente il nostro istituto sta conducendo studi preclinici per studiare l'efficacia e la sicurezza della terapia di trapianto di cellule staminali RPE in un modello animale di ratto degenerativo RPE. In questo studio, utilizziamo una tecnica di iniezione trans-sclerale, sottoretinica, per fornire cellule staminali RPE negli occhi del ratto, tra gli strati retinico e RPE. Il nostro metodo è un mezzo semplice e affidabile per la consegna di cellule nello spazio sottoretinico.

Avrai bisogno dei seguenti reagenti e attrezzature. L'1% di tropicamide e il 2,5% di fenilefrina, appena realizzati con il 10% di fenilefrina, diluendola in soluzione salina sterile allo 0,9% il giorno dell'intervento, vengono utilizzati per dilatare la pupilla. Il lavaggio oculare viene utilizzato per sciacquare l'occhio e mantenere umido l'occhio non operato.

Un lubrificante oculare viene utilizzato per mantenere umido l'occhio destro non operato durante l'intervento chirurgico. La proparacaina allo 0,5% viene utilizzata come anestetico locale. Durante la scansione OCT viene utilizzato un lubrificante oculare sull'occhio sinistro operato.

Per questa tecnica è necessaria una quantità minima di materiale e attrezzature. Informazioni dettagliate sulle apparecchiature e sui reagenti utilizzati in questa tecnica sono descritte nel protocollo. Una siringa da 10 microlitri viene utilizzata per iniettare le cellule.

Prima dell'iniezione, assembliamo l'iniettore e lo sterilizziamo con etanolo. Inserire un ago smussato sterile calibro 33 nella siringa e avvitare saldamente per assemblare l'iniettore. Sciacquare l'iniettore con etanolo al 100%, poi con etanolo al 70% e quindi con acqua distillata deionizzata, in sequenza per cinque o sei volte ciascuno.

Contrassegnare l'ago dell'iniettore con un pennarello nero sterile in una posizione a 600 micron di distanza dalla punta dell'ago. Metti l'iniettore su un micro manipolatore per l'uso dell'iniezione. Le cellule RPE umane vengono preparate il giorno dell'intervento e conservate in una miscela di acqua ghiacciata.

Triturare delicatamente la sospensione cellulare e caricare l'iniettore con 1,2 microlitri, gli 0,2 microlitri in più vengono utilizzati per compensare il riflusso dell'iniezione, per garantire un volume di iniezione di un microlitro. Sostituire l'iniettore riempito con la sospensione cellulare sul micromanipolatore o chiedere a un assistente di tenerlo verticalmente, poiché le cellule RPE tendono ad affondare facilmente nelle soluzioni. Preparare l'area chirurgica sterile posizionando un cuscinetto chirurgico sterile con un cuscinetto riscaldante sottostante sul tavolino del microscopio da dissezione.

Tutte le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali presso la State University di New York ad Albany. Pesare l'animale e anestetizzarlo utilizzando il sistema di erogazione del vapore di isoflurano come mostrato qui. Trasferisci il ratto nell'area chirurgica una volta anestetizzato e posizionalo in un cono nasale collegato al sistema dell'isoflurano per mantenere l'anestesia.

Copri il corpo del topo con una garza e pizzica il dito del ratto per confermare l'anestesia completa. Applicare una goccia di lubrificante per gli occhi sull'occhio destro del ratto, posizionare il ratto sul lato destro, con l'occhio sinistro rivolto verso il soffitto per l'iniezione, la testa verso la mano destra del chirurgo ed è indietro verso il chirurgo. Taglia via i baffi che coprono l'occhio.

Sgocciolare una piccola quantità di collirio per il lato temporale dell'occhio sinistro e raccogliere l'eccesso sul lato nasale con un applicatore di cotone per risciacquare l'occhio. Dilatare la pupilla con l'1% di tropicamide, il 2,5% di fenilefrina, per una tomografia a coerenza ottica post-iniezione, o esame OCT, applicando una goccia di ciascuno. Applicare una goccia di collirio per mantenere l'occhio umido.

Applicare una goccia di Proparacaina sull'occhio e rimuovere l'eccesso con un applicatore di cotone. Massaggiare delicatamente la pelle che circonda l'occhio da quattro a sei volte per aprire la palpebra, in modo che l'occhio fuoriesca temporaneamente e leggermente dalla sua orbita per consentire un facile accesso all'ago dell'iniettore. Usa le forze per afferrare la congiuntiva posteriore al limbus e ruota l'occhio per trovare un punto migliore per l'intervento chirurgico senza danneggiare i muscoli oculari.

Sollevare delicatamente la congiuntiva per creare una tenda e ruotare l'occhio nasale. Quindi usa le forbici per tagliare la parte superiore della tenda, per fare una piccola apertura nella congiuntiva ed esporre la sclera. Quindi, usa una pinza per afferrare il bordo dell'apertura della congiuntiva vicino al limbus e ruota l'occhio nasale, in modo che l'asse pupillare sia ad un angolo di circa 30 gradi rispetto al suolo.

Un ago da insulina sterile smussato calibro 31 viene utilizzato per penetrare il complesso centrale della sclera con uno smusso rivolto verso l'alto e metà della punta, o circa 500 micron che si inserisce nel tessuto, per creare un foro pilota per l'iniezione. Estrarre con cautela l'ago da insulina e si può vedere un piccolo versamento di sangue. È possibile applicare una lancia oculare per pulire il foro e fermare l'emorragia, se necessario.

Guidare l'ago dell'iniettore caricato con cellule RPE nel foro pilota con un angolo di circa 10-15 gradi rispetto alla superficie locale della sclera per raggiungere lo spazio sottoretinico inserendo l'ago con una lunghezza di 500 micron completamente nel tessuto e lasciando una distanza di 100 micro tra il punto sull'ago coperto dal tessuto e il punto del marcatore nero sull'ago. Dica all'assistente di premere lo stantuffo della siringa, per iniettare il volume appropriato di cellule. Tenere l'iniettore in posizione per 25-30 secondi dopo l'iniezione, quindi ritrarre lentamente l'iniettore.

Il foro di iniezione si sigilla automaticamente e si osserva comunemente una piccola quantità di circa 0,2 microlitri di riflusso. Sciacquare tre volte il sito di iniezione con un collirio sterile e raccogliere l'eccesso con un applicatore di cotone. Applicare una goccia di lubrificante sull'occhio operato e trasferire il ratto alla stazione OCT, per esaminare la posizione delle cellule trapiantate e le dimensioni della bolla sottoretinica.

Rimetti il ratto nella gabbia di recupero sotto una lampada termica per mantenere la sua temperatura corporea una volta terminato l'OCT. Osserva il ratto per assicurarti che esca dall'anestesia e monitora quotidianamente eventuali segni di angoscia. Avvisare immediatamente il veterinario in caso di dubbi.

Utilizzando la nostra tecnica, abbiamo consegnato in modo coerente e con successo cellule RPE umane nello spazio sottoretinico. Subito dopo il trapianto, abbiamo eseguito l'esame OCT per osservare il sito di iniezione e la bolla sottoretinica creata dalle cellule trapiantate. Questo serve come un buon strumento di screening per valutare la qualità delle iniezioni e il grado di danno retinico o emorragia.

La riflessione della luce intensa intorno al sito di iniezione e una bolla sottoretinica riempita con la sospensione cellulare potevano essere viste sotto la scansione OCT. Non vi è sanguinamento, perdita di liquido interoculare o distacco di retina, osservati intorno al sito di iniezione o nello spazio intravitreale in un'iniezione riuscita, dimostrando il minimo trauma causato dall'iniezione. Gli occhi di ratto operati sono stati nucleati, fissati e sezionati per l'analisi immunoistologica a sette giorni dal trapianto.

Il marcatore nucleare umano, Hunu, e il marcatore cellulare RPE, OTX2, sono stati utilizzati per rilevare le cellule trapiantate. Un'affermazione positiva di entrambi i marcatori ha mostrato che le cellule RPE umane trapiantate si trovavano nello spazio sottoretinico degli occhi del ratto. Questa tecnica di iniezione sottoretinica trans-sclerale è semplice e facile da imparare.

Provoca meno traumi chirurgici e lascia intatta la retina facendo passare l'ago per iniezione attraverso gli strati esterni della parete dell'occhio, senza rompere la retina neurale. Le gocce quantificate per l'ago pilota e l'ago per iniezione da inserire nel tessuto e l'angolo utilizzato durante l'iniezione consentono la consegna affidabile delle cellule nello spazio sottoretinico con una precisione e un tasso di successo molto più elevati. Con questo metodo di iniezione, abbiamo consegnato in modo coerente e con successo cellule RPE derivate da cellule staminali RPE umane nello spazio sottoretinico dei ratti RCS.

Questa procedura può essere facilmente ripetuta da chiunque guardi il video.