Name: Somministrazione sottoretinica di progenitori di fotorecettori derivati da cellule staminali embrionali umane in topi rd10 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-06T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Scopri la somministrazione sottoretinica di progenitori di fotorecettori derivati da hESC in topi rd10. Questo protocollo sviluppa terapie cellulari per degenerazioni retiniche e il ripristino visivo.

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Ringraziamo Wei Sheng Tan, Luanne Chiang Xue Yen, Xinyi Lee e Yingying Chung per aver fornito assistenza tecnica per la preparazione dei progenitori dei fotorecettori derivati da hESC del giorno 32 dopo la crioconservazione. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalle sovvenzioni del National Medical Research Council Young Investigator Research Grant Award (NMRC/OFYIRG/0042/2017) e dalla National Research Foundation24th Competitive Research Program Grant (CRP24-2020-0083) a H.G.T.

Gli esperimenti in vivo sono stati condotti in conformità con le linee guida e il protocollo approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee of SingHealth (IACUC) e dalla Dichiarazione dell'Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) per l'uso di animali nella ricerca oftalmica e sulla visione. I cuccioli sono stati immunodepressi da P17 (pre-trapianto) a P30 (post-trapianto) nutrendoli con acqua potabile contenente ciclosporina (260 g/L).
1. Preparazione dei progenitori dei fotorecettori derivati da hESC del giorno 32 dopo crioconservazione
<ol><li>Mezzo di differenziazione dei fotorecettori preriscaldati (PRDM) in un bagno d'acqua a 37 °C.</li>
	<li>Recupera dall'azoto liquido un crioviale contenente cellule progenitrici di fotorecettori derivate da hESC al giorno 32. Conservare con ghiaccio secco.</li>
	<li>Scongelare il crioviale a 37 °C a bagnomaria per 3-5 minuti. Risospendere il giorno 32 cellule in 1 mL di PRDM e centrifugare a 130 x g per 4 min.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 1 mL di PRDM.</li>
	<li>Rimuovere 10 μL della miscela per il conteggio delle cellule. Mescolare le celle utilizzando lo 0,2% di blu di tripano secondo le istruzioni del produttore. Pipettare la miscela di cellule nel vetrino della camera di conteggio delle cellule. Determina il numero di celle e la vitalità tramite il contatore automatico delle cellule.</li>
	<li>Procedere al passaggio successivo quando la vitalità cellulare è superiore al 70%. Centrifugare la sospensione cellulare rimanente a 130 x g per 4 min. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in PRDM alla concentrazione di 3 x 105 cellule/μL per il trapianto.</li>
	<li>Osservare la presenza di grumi cellulari visibili. Risospendere ripetutamente i grumi di cellule utilizzando un puntale di pipetta da 10 μL nella provetta per microfuge fino a quando non si osserva alcun grumo di cellule visibile. Caricare nella siringa per iniezione 33G per osservare l'estrusione della soluzione cellulare attraverso l'ago.</li>
</ol>2. Rilascio sottoretinico delle hESC nei topi rd10
<ol><li>Preparazione degli animali<ol><li>Anestetizzare il topo (P20, maschio/femmina, 3-6 g) utilizzando una combinazione di ketamina (20 mg/kg di peso corporeo) e xilazina (2 mg/kg di peso corporeo) in una siringa di tubercolina da 1 mL collegata a un ago da 27G mediante approccio intraperitoneale. Somministrare un'iniezione sottocutanea di buprenorfina (0,05 mg/kg) al topo come analgesico preventivo.</li>
		<li>Dopo aver somministrato l'anestesia, instillare una goccia ciascuna di tropicamide all'1% e fenilefrina al 2,5% per la dilatazione della pupilla. Applicare un gel oftalmico sulla cornea per prevenire la secchezza dell'occhio e la cataratta correlata all'anestesia.</li>
		<li>Metti il topo in una gabbia vuota fino a quando non sarà completamente anestetizzato. Valutare il corretto livello di anestetico pizzicando il cuscinetto della zampa e verificare se l'animale non reagisce al forte pizzicotto.</li>
		<li>Quando il topo è completamente anestetizzato, posizionare l'animale su un tappetino caldo a 38 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Rilascio sottoretinico delle cellule<ol><li>Per utilizzare un approccio pars plana transvitreale a 1 porta, come fatto qui, eseguire l'iniezione sottoretinica in un ambiente sterile. Utilizzare un microscopio operativo verticale con un percorso di luce diretto per eseguire l'iniezione.</li>
		<li>Preparare la siringa di vetro da 10 μL rimuovendo il mozzo dell'ago. Montare l'ago smussato da 33G sulla siringa di vetro. Prenda il coperchio metallico del mozzo e fissi con cura l'ago sulla siringa.</li>
		<li>Sciacquare con acqua distillata per verificare la presenza di eventuali segni di perdite e pervietà dell'ago. Svuotare la siringa e metterla da parte con cura.</li>
		<li>Posizionare il topo anestetizzato su un cuscino, con l'occhio di trattamento rivolto verso l'alto verso l'obiettivo del microscopio. Applicare il cloridrato di proparacaina allo 0,5% e attendere 30 s. Applicare 150 μL di gel oftalmico sull'occhio e posizionare su di esso un vetrino coprioggetto rotondo.</li>
		<li>Eseguire un esame approssimativo dell'occhio osservando la cornea, l'iride, la pupilla, il cristallino e la congiuntiva. Attraverso la pupilla, visualizza il fondo oculare dell'occhio del topo regolando il piano focale. Regolare la testina fino a quando la testa ottica non è posizionata al centro della pupilla e ridurre al minimo il movimento della testa posizionandola correttamente sul cuscino.</li>
		<li>Picchiettare delicatamente la base del tubo con le hESC più volte per ottenere una sospensione cellulare uniforme. Utilizzando la siringa da microlitri di vetro da 10 μL con un ago smussato da 33 G, prelevare 2 μL di cellule/terreni. Prelevare le cellule subito prima dell'iniezione per evitare l'assestamento/aggregazione delle cellule nella siringa.</li>
		<li>Utilizzando un ago monouso da 30 G, praticare una ferita da sclerectomia 2 mm dietro il limbus. Mantenere l'angolo dell'ago a ~45° per evitare di toccare l'obiettivo. Una volta visualizzata la punta dell'ago nell'occhio, ritirare delicatamente l'ago. Gettare l'ago nel contenitore appuntito dopo l'uso per evitare lesioni da puntura dell'ago.</li>
		<li>Prendere la siringa di vetro e inserire l'ago smussato nella ferita della sclerectomia. Senza toccare la lente, far avanzare l'ago smussato fino a raggiungere la retina opposta alla ferita d'ingresso. Assicurarsi che l'area di iniezione sia libera dai principali vasi sanguigni della retina per evitare sanguinamento.</li>
		<li>Penetrare delicatamente nella retina fino a quando non si vede un ramo di pressione sulla sclera. Tenere l'estremità smussata dell'ago parallela alla sclera per evitare la fuoriuscita delle cellule nello spazio vitreo.</li>
		<li>Iniettare lentamente 2 μL di sospensione cellulare o terreno PRDM (controllo) nello spazio sottoretinico mantenendo una leggera pressione sulla siringa. Con un'iniezione riuscita, nel sito di iniezione deve formarsi una bolla visibile (cioè retina sollevata con la sospensione/terreno cellulare al suo interno). NOTA: Durante l'iniezione deve essere esercitata solo una leggera pressione per evitare la lacerazione della retina e il blocco delle cellule sulla punta dell'ago.</li>
		<li>Dopo aver confermato la bolla, attendere 10 secondi per lasciare che le cellule si stabilizzino. Ritrarre delicatamente l'ago dalla cruna di ritiro.</li>
	</ol></li>
	<li>Tomografia a coerenza ottica (OCT) intraoperatoria del bleb (opzionale)<ol><li>Posiziona l'occhio del mouse per visualizzare il bollo sotto il microscopio muovendo lentamente la testa. Fissare la posizione tenendo delicatamente la testa. Non è necessaria alcuna dilatazione aggiuntiva della pupilla. Non rimuovere il vetrino coprioggetto e il gel sull'occhio. Fornisce un chiaro supporto ottico per visualizzare l'ebola.</li>
		<li>Eseguire l'OCT intraoperatorio utilizzando la funzione iOCT integrata del microscopio operatorio.</li>
		<li>Premere l'opzione Cubo nella schermata dello Strumento di personalizzazione di Office e posizionare l'area di scansione sul bleb premendo i pulsanti freccia . Regolare l'OCT facendo scorrere Centratura e Messa a fuoco per ottenere la migliore qualità OCT. Premere Acquisisci/Scansione per acquisire la scansione OCT dell'area bleb. Esaminare le immagini per verificare la qualità delle scansioni.</li>
	</ol></li>
	<li>Guarigione<ol><li>Rimuovere il vetrino coprioggetto e pulire il gel dall'occhio con una garza. Applicare un unguento antibiotico una volta dopo l'iniezione per prevenire l'infezione.</li>
		<li>Lasciare che l'animale si riprenda dall'anestesia sotto una luce calda fino a quando non riacquista sufficiente coscienza per mantenere il decubito sternale e tornare alla gabbia di casa. Monitorare l'animale per almeno 3 giorni dopo l'iniezione per segni di infiammazione, infezione e angoscia. NOTA: La luce calda da 150 W deve trovarsi ad almeno 30 cm di distanza dalla gabbia dell'animale e prestare attenzione per evitare ustioni.</li>
		<li>Somministrare un'iniezione sottocutanea di buprenorfina (0,05 mg/kg) 8 ore per 1 giorno o secondo le raccomandazioni del veterinario. Se si osserva un'infiammazione o un'infezione dell'occhio, consultare un veterinario per un trattamento appropriato.</li>
	</ol></li>
	<li>Pulizia e sterilizzazione degli strumenti<ol><li>Sciacquare la siringa da microlitro di vetro da 10 μL e l'ago smussato da 33G con etanolo al 100% 10x. Lavare via l'etanolo facendo lampeggiare la siringa con acqua distillata.</li>
		<li>Smontare la siringa di vetro e l'ago. Asciugare la siringa per la conservazione.</li>
	</ol></li>
</ol>

Vista rivitalizzante: terapia con cellule staminali per la degenerazione retinica

Hwee Goon Tay è co-fondatore di Alder Therapeutics AB. Altri autori dichiarano di non avere interessi contrastanti.

L'iniezione sottoretinica è stata utilizzata per il trapianto di sospensione cellulare per il trattamento di RPE e malattie retiniche 23,25,26,27,28,31,40. Questo approccio è molto essenziale negli studi sui roditori non solo per il trapianto di cellule e gli approcci di terapia genica, ma a...

Le malattie ereditarie della retina e la degenerazione maculare legata all'età portano alla perdita di cellule fotorecettrici e alla cecità. Il fotorecettore retinico è lo strato del segmento esterno della retina composto da cellule specializzate responsabili della fototrasduzione (cioè la conversione della luce in segnali neuronali). Le cellule fotorecettrici dei coni e dei bastoncelli sono adiacenti allo strato pigmentato retinico (RPE)1. La terapia sostitutiva cellulare con fotorecettori per compensare la perdita cellulare è stato un approccio terapeutico emergente e in via di sviluppo. Le cellule staminali embrionali (ESCs)2,3,4, le cellule RPE derivate da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) e le cellule progenitrici retiniche (RPC)4,5,6,7,8 sono state utilizzate per ripristinare le cellule fotorecettrici danneggiate. Lo spazio sotto-retinico, uno spazio confinato tra la retina e l'RPE, è un luogo attraente per depositare queste cellule per sostituire le cellule fotorecettrici danneggiate, l'RPE e le cellule di Mueller a causa della sua vicinanza 9,10,11.
Le terapie geniche e cellulari hanno utilizzato lo spazio sottoretinico per la medicina rigenerativa per varie malattie della retina in studi preclinici. Ciò include la consegna di copie funzionali del gene o degli strumenti di editing genetico sotto forma di terapia oligonucleotidica antisenso12,13 o CRISPR/Cas9 o editing di base tramite la strategia basata su virus adeno-associati (AAV) 14,15,16, l'impianto di materiali (ad esempio, foglio RPE, protesi retiniche 17,18,19) e organoidi retinici derivati da cellule staminali differenziate 20,21,22 per il trattamento delle malattie retiniche e correlate all'RPE. Studi clinici che utilizzano hESC-RPE31 nello spazio sottoretinico per il trattamento dell'amaurosi congenita di Leber (LCA) associata a RPE6523,24, acromatopsia legata a CNGA325, retinite pigmentosa associata a MERTK26, coroideremia 27,28,29,30 si sono dimostrati efficaci. L'iniezione diretta di cellule in prossimità dell'area danneggiata migliora notevolmente la possibilità di insediamento cellulare nella regione appropriata, l'integrazione sinaptica e l'eventuale miglioramento visivo.
Anche se è stata stabilita l'iniezione sub-retinica in modelli umani e con occhi grandi (cioè maiale 32,33,34,35, coniglio 36,37,38,39,40 e primate non umano 41,42,43), tale iniezione nel modello murino è ancora impegnativa a causa del vincolo delle dimensioni del bulbo oculare e dell'enorme lente che occupa l'occhio del topo 44,45,46. Tuttavia, i modelli geneticamente modificati sono prontamente disponibili solo in piccoli animali e non in animali di grandi dimensioni (ad esempio, conigli e primati non umani), pertanto l'iniezione sottoretinica nei topi attira l'attenzione per studiare nuovi approcci terapeutici nelle malattie genetiche retiniche. Per veicolare cellule o AAV nello spazio sottoretinico vengono utilizzati tre approcci principali, vale a dire la via transcorneale, la via trans-sclerale e la via pars plana (vedere la Figura 2). Le vie transcorneali e transsclerali sono associate alla formazione di cataratta, alle sinechie, al sanguinamento coroideale e al reflusso dal sito di iniezione 11,44,45,47,48,49. Abbiamo adottato l'approccio pars plana come visualizzazione diretta del processo di iniezione e il sito di iniezione può essere raggiunto in tempo reale al microscopio.
Recentemente abbiamo descritto un metodo in grado di differenziare le cellule staminali embrionali umane (hESC) in progenitori fotorecettori in condizioni xenolibere, chimicamente definite, utilizzando l'isoforma di laminina ricombinante LN523 specifica per la retina umana. Poiché è stato scoperto che LN523 è presente nella retina, abbiamo ipotizzato che la nicchia della matrice extracellulare della retina umana potesse essere ricapitolata in vitro e quindi supportare la differenziazione dei fotorecettori dalle hESC36. L'analisi trascrittomica a singola cellula ha mostrato che i progenitori dei fotorecettori che co-esprimono l'omeobox cono-bastoncino e la recoverina sono stati generati dopo 32 giorni. Un modello murino mutante di degenerazione retinica 10 (rd10) che imita la retinite pigmentosa umana autosomica è stato utilizzato per valutare l'efficacia dei progenitori dei fotorecettori derivati da hESC al giorno 32 in vivo. Le cellule progenitrici dei fotorecettori derivate da hESC sono state iniettate nello spazio sub-retinico di topi rd10 a P20, dove la disfunzione e la degenerazione dei fotocettori sono in corso36. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per la preparazione dei progenitori dei fotorecettori derivati da hESC post-crioconservati e la consegna nello spazio sotto-retinico di topi rd10 . Questo metodo può essere utilizzato anche per somministrare AAV, sospensioni cellulari, peptidi o sostanze chimiche nello spazio sottoretinico nei topi.

<table><tbody><tr><td>0,3% Tobramicina</td><td>Novartis</td><td>NDC 0078-0813-01</td><td>Tobrex (3,5 g)</td></tr><tr><td>0,3% Tobramicina e 0,1% Desametasone</td><td>Novartis</td><td>NDC 0078-0876-01</td><td>Tobradex (3,5 g)</td></tr><tr><td>0,5% Proparacaina cloridrato</td><td>Alcon</td><td>NDC 0998-0016-15</td><td>0,5% Alcaine (15 mL)</td></tr><tr><td>1 mL Siringa per tubercolina</td><td>Turemo</td><td>SS01T2713</td><td></td></tr><tr><td>1% Tropicamide</td><td>Alcon</td><td>NDC 0998-0355-15</td><td>1% Mydriacyl (15 mL)</td></tr><tr><td>2,5% Fenilefrina cloridrato</td><td>Alcon</td><td>NDC 0998-0342-05</td><td>2,5% Mydfrin (5 mL)</td></tr><tr><td>Piastra per coltura tissutale a 24 pozzetti</td><td>Costar</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>30 G Ago monouso</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td>33 G, 20 mm di lunghezza aghi smussati</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td></td></tr><tr><td>Contatore di cellule automatizzato</td><td>NanoEnTek</td><td>Modello: Eve</td><td></td></tr><tr><td>B27 senza vitamina A</td><td>Life Technologies</td><td>12587001</td><td>2%36</td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Ceva</td><td></td><td>Vetergesic vet (0,3 mg/mL)</td></tr><tr><td>CKI-7</td><td>Sigma</td><td>C0742</td><td>5 &; M36</td></tr><tr><td>Ciclosporina</td><td>Novartis</td><td></td><td>260 g/L in acqua potabile</td></tr><tr><td>Giorno 32 cellule progenitrici dei fotorecettori derivate da hESC</td><td>DUKE-NUS-US Medical School</td><td></td><td>Le cellule staminali embrionali umane sono differenziate per 32 giorni. Vedi protocollo in Rif. 36.</td></tr><tr><td>Vincitore della garza</td><td>Industries Co., Ltd.</td><td>1SNW475-4</td><td></td></tr><tr><td>Glasgow Minimo Essenziale Medio</td><td>Gibco</td><td>11710&ndash; 035</td><td></td></tr><tr><td>linea cellulare hESC H1</td><td>WiCell Research Institute</td><td>WA01</td><td></td></tr><tr><td>Fattore neurotrofico derivato dal cervello umano (BDNF)</td><td>Peprotech</td><td>450-02-50</td><td>10 ng/mL36</td></tr><tr><td>Fattore neurotrofico ciliare umano (CNTF)</td><td>Prospec-Tany Technogene</td><td>CYT-272</td><td>10 ng/mL36</td></tr><tr><td>Ketamina cloridrato (100 mg/mL)</td><td>Ceva Sant&eacute; Animale</td><td>KETALAB03</td><td></td></tr><tr><td>LN-521</td><td>Biolamina</td><td>LN521-02</td><td>1 &micro; g36</td></tr><tr><td>mFreSR</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5854</td><td></td></tr><tr><td>Siringa in vetro per microlitri (10 mL)</td><td>Hamilton</td><td>7653-01</td><td></td></tr><tr><td>N-[N-(3,5-difluorofenacetil-L-alanil)]-S-fenilglicina t-butil estere (DAPT)</td><td>Selleckchem</td><td>S2215</td><td>10 &; Integratore M36</td></tr><tr><td>N-2</td><td>Life Technologies</td><td>A13707-01</td><td>1%36</td></tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140&ndash; 050</td><td>1x36</td></tr><tr><td>NutriStem XF Media</td><td>Satorius</td><td>05-100-1A</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio operatorio</td><td>Zeiss</td><td>OPMI LUMERA 700</td><td>Con funzione iOCT integrata</td></tr><tr><td>PRDM (Mezzo di differenziazione dei fotorecettori, 50ml)</td><td>DUKE-NUS Medical School</td><td></td><td>Vedi composizione dei supporti36. Medio basale, 10 & micro; M DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0,5 &micro; M Acido retinoico, 2% B27 e 1% N2. Terreno basale: 1x GMEM, 1 mM di piruvato di sodio, 0,1 mM di B-mercaptoetanolo, 1x aminoacidi non essenziali (NEAA).</td></tr><tr><td>Piruvato</td><td>Gibco</td><td>11360&ndash; 070</td><td>1 mM36</td></tr><tr><td>Rd10 topi</td><td>Jackson Laboratory</td><td>B6. Topi CXB1-Pde6brd10/J</td><td>Sesso: maschio/femmina, Età: P20 (iniezione), Peso: 3-6 g</td></tr><tr><td>Acido retinoico</td><td>Tocris Bioscience</td><td>0695/50</td><td>0,5 &micro; M36</td></tr><tr><td>Coprioggetto rotondo (12 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-80</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Sigma</td><td>S4317</td><td>0.5 &; M36</td></tr><tr><td>Vidisic Gel (10 g)</td><td>Dr. Gerhard Mann Xilazina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cloridrato (20 mg/mL)</td><td>Troy Laboratories</td><td>LI0605</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanolo</td><td>Life Technologies</td><td>21985&ndash; 023</td><td>0,1 mM36</td></tr></tbody></table>

somministrazione sottoretinica di progenitori di fotorecettori derivati da cellule staminali embrionali umane in topi rd10

Sub-Retinal Delivery of Human Embryonic Stem Cell Derived Photoreceptor Progenitors in rd10 Mice

La rigenerazione di cellule fotorecettrici utilizzando cellule staminali pluripotenti umane è una terapia promettente per il trattamento di malattie retiniche ereditarie e di invecchiamento in fase avanzata. Abbiamo dimostrato che la matrice isoforme di laminina retina-specifica ricombinante umana è in grado di supportare la differenziazione delle cellule staminali embrionali umane (hESC) in progenitori dei fotorecettori. Inoltre, l'iniezione sottoretinica di queste cellule ha anche mostrato un ripristino parziale nei modelli di roditore e coniglio rd10 . L'iniezione sottoretinica è nota per essere un metodo consolidato che è stato utilizzato per fornire composti farmaceutici alle cellule fotorecettrici e allo strato epiteliale pigmentato retinico (RPE) dell'occhio a causa della sua vicinanza allo spazio bersaglio. È stato anche utilizzato per fornire vettori virali adeno-associati nello spazio sottoretinico per trattare le malattie della retina. La somministrazione sottoretinica di composti farmaceutici e cellule nel modello murino è impegnativa a causa del vincolo delle dimensioni del bulbo oculare murino. Questo protocollo descrive la procedura dettagliata per la preparazione di cellule progenitrici fotorecettrici derivate da hESC per l'iniezione e la tecnica di somministrazione sottoretinica di queste cellule in topi mutanti genetici di retinite pigmentosa, rd10. Questo approccio consente la terapia cellulare nell'area bersaglio, in particolare lo strato nucleare esterno della retina, dove si verificano malattie che portano alla degenerazione dei fotorecettori.

La siringa di vetro da 10 μL è stata assemblata secondo le istruzioni del produttore (Figura 1) e l'ago smussato utilizzato per erogare la sospensione/il terreno cellulare è mostrato nella Figura 1B. I diversi approcci per l'iniezione sottoretinica sono illustrati nella Figura 2. Descriviamo l'approccio pars plana in questo protocollo (Figura 2C). L'ago smussato montato su una siringa di vetro è stato i...

Descriviamo un protocollo dettagliato per la preparazione di cellule progenitrici fotorecettrici derivate da hESC post-crioconservate e la somministrazione sub-retinica di queste cellule in topi rd10 .

Somministrazione sottoretinica di progenitori di fotorecettori derivati da cellule staminali embrionali umane in topi rd10

Regeneration of photoreceptor cells using human pluripotent stem cells is a promising therapy for the treatment of both hereditary and aging retinal ...

La mia ricerca si concentra sullo sviluppo di una terapia basata sulle cellule staminali per gli stadi avanzati delle malattie retiniche che causano la degenerazione dei fotorecettori. L'obiettivo della nostra ricerca è quello di sostituire la perdita di fotorecettori nei pazienti con progenitori fotorecettori clinicamente sicuri e funzionali con l'obiettivo di migliorare la loro acuità visiva o addirittura ripristinare la loro vista. Il principale modello preclinico sono i topi, ma il loro bulbo oculare di piccole dimensioni rende difficile l'iniezione di materiali, specialmente sotto la retina.Sviluppare l'abilità di eseguire iniezioni sottoretiniche di successo richiede pazienza e perseveranza. Abbiamo sviluppato con successo una base di laminina per il metodo di differenziazione dei recettori che è in grado di generare progenitori fotorecettori in 32 giorni. I trapianti sottoretinici di sospensioni cellulari progenitrici di questo fotorecettore nei roditori hanno provocato la connettività sinaptica tra i fori e l'innesto negli occhi.Questo ha portato a un parziale restauro visivo. Il nostro approccio è semplice, la giusta visualizzazione aiuta il chirurgo a gestire l'ago nell'area di interesse.

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Questa tecnica chirurgica illustra l'iniezione di vettori di terapia genica e cellule staminali nello spazio sottoretinico dell'occhio mouse.

Iniezione sottoretinico di vettori di terapia genica e cellule staminali nel Eye mouse

Il trapianto cellulare rappresenta una strategia per il trattamento della degenerazione retinica caratterizzata dalla perdita di fotorecettore. Qui descriviamo un metodo per l'arricchimento dei fotorecettori trapiantabili e il loro innesto subretinale in topi adulti.

Trapianto subretinale di cellule precursori del fotorecettore purificato MACS nella retina del topo adulto

Qui presentiamo un protocollo accettato dalla comunità in formato multimediale per l'iniezione sottoretinica di un bolo di cellule RPE in ratti e topi. Questo approccio può essere utilizzato per determinare i potenziali di salvataggio, i profili di sicurezza e le capacità di sopravvivenza delle cellule RPE trapiantate dopo l'impianto in modelli animali di degenerazione retinica.

Esecuzione sottoretinico Iniezioni in roditori di agire cellule retiniche epitelio pigmentato in sospensione

Iniezione subretinal è stato ampiamente applicato negli studi preclinici di terapia sostitutiva delle cellule staminali per degenerazione maculare senile. In questo articolo visualizzato in quel momento, descriviamo una tecnica di iniezione subretinal meno rischioso, riproducibile e precisamente modificati tramite l'approccio trans-sclerale per fornire cellule negli occhi del ratto.

Sviluppo di un protocollo di raffinata per Trans-sclerale Subretinal trapianto delle cellule epiteliali del pigmento retinico umano negli occhi di topo

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Subretinal trapianto delle cellule epiteliali del pigmento retinico derivato di cellule staminali embrionali umane in un modello di atrofia geografica gran-eyed

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Qui viene presentata una tecnica chirurgica per il trapianto di tessuto retinico derivato da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) nello spazio sottoretinico di un grande modello animale.

Trapianto sottoretinico di tessuto retinico derivato da cellule staminali embrionali umane in un modello animale felino di grandi dimensioni

Questo protocollo presenta un approccio trans-sclerale guidato dalla visione transpupillare per fornire in modo sicuro e preciso innesti cellulari sottoretinici, con un basso tasso di complicanze chirurgiche, in riceventi murini con o senza degenerazione retinica.

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Un metodo è descritto per propagare i tumori retinoblastoma umano nei topi. Le cellule tumorali sono direttamente iniettate negli occhi di topi privi di sistema immunitario. Tumori secondari sono state stabilite con successo utilizzando sia le cellule raccolte direttamente da tumori umani e tumorspheres colta.

Istituzione e Propagazione dei Tumori retinoblastoma umani in topi privi di sistema immunitario

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Scopri la somministrazione sottoretinica di progenitori di fotorecettori derivati da hESC in topi rd10. Questo protocollo sviluppa terapie cellulari per degenerazioni retiniche e il ripristino visivo.

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