Rimodellamento della membrana di vescicole giganti in risposta a gradienti di ioni calcio localizzata

Presentiamo una tecnica per la manipolazione di vescicole giganti utilizzando gradienti localizzati di ioni calcio. Il vantaggio principale di questa tecnica è la stimolazione completamente senza contatto della superficie della vescicola e la visualizzazione diretta del rimodellamento della membrana lipidica in seguito all'interazione con gli ioni calcio. Il nostro approccio introduce un mezzo per affrontare i dettagli delle interazioni tra le membrane degli ioni calcio, fornendo nuove sedi per studiare i meccanismi di rimodellamento della membrana cellulare in seguito ai cambiamenti nel microambiente cellulare.

Per iniziare questa procedura, preparare una soluzione di lipidi in cloroformio. La concentrazione finale di lipidi nel cloroformio è di un milligrammo per millilitro e la massa finale è di 0,6 milligrammi. Avvolgere la fiala di vetro contenente la miscela lipidica con un foglio di metallo per proteggere il contenuto dalla luce ambientale.

Posizionare la fiala del campione avvolta in un foglio di metallo all'interno di un becher di vetro. Per rimuovere il cloroformio, far evaporare il solvente in un evaporatore rotante per tre ore con la pressione che raggiunge i sette kilopascal di vuoto a 80 giri/min. Dopo l'evaporazione si forma un film lipidico secco sul fondo della fiala di vetro.

Aggiungere lentamente 600 microlitri di soluzione salina tamponata con fosfato sopra il film lipidico essiccato. Dopo l'aggiunta del tampone, aggiungere delicatamente sei microlitri di glicerolo per proteggere il campione dalla completa disidratazione durante la formazione di una vescicola unilamellare gigante collegata a una vescicola multilamellare, o GUV-MLV. Sigillare il flaconcino di vetro con Parafilm.

E copri con un foglio di metallo per proteggerlo dalla luce ambientale. Conservare il flaconcino a quattro gradi Celsius per una notte. Il giorno seguente, sonicare la fiala di vetro contenente la soluzione per un minuto utilizzando un bagno ad ultrasuoni a temperatura ambiente.

Rimuovere il Parafilm e pipettare fino a formare una soluzione visivamente uniforme di piccole vescicole lipidiche. Aliquotare 30 microlitri della soluzione ottenuta di piccole vescicole lipidiche in provette di plastica individuali da 0,5 millilitri. Scongelare una provetta di plastica contenente un'aliquota della sospensione congelata di piccole vescicole lipidiche a temperatura ambiente.

Agitare il tubo quattro volte per uno o due secondi utilizzando un miscelatore a vortice alla massima velocità. Posizionare cinque microlitri della sospensione di piccole vescicole lipidiche sulla superficie di un vetrino coprioggetti per formare una piccola gocciolina rotonda. Utilizzare un vetrino coprioggetti in vetro senza alcuna fase di pre-pulizia.

A questo punto, mettere il vetrino coprioggetto in un essiccatore sottovuoto per 20 minuti. Conservare il film lipidico essiccato a temperatura ambiente per quattro minuti. Quindi, pipettare lentamente 50 microlitri di tampone HEPES da 10 millimolari sopra il film lipidico secco per la reidratazione.

Attendere cinque minuti per formare i complessi GUV-MLV. Centrare un vetrino coprioggetti sul tavolino del microscopio. Quindi, pipettare 300 microlitri di tampone HEPES su di esso e posizionare il centro della gocciolina sopra l'obiettivo.

Trasferire i 50 microlitri di soluzione preformata di GUV-MLV nella soluzione HEPES. Attendere 25 minuti per consentire ai complessi GUV-MLV scarsamente formati di aderire saldamente alla superficie del vetrino coprioggetti. Arrotondare i bordi dei capillari in vetro borosilicato posizionando delicatamente le estremità dei capillari nella fiamma di una candela per evitare che la micropipetta si rompa mentre la si collega al supporto della micropipetta.

Estrarre almeno tre capillari di vetro utilizzando un estrattore laser automatico. Utilizzare i capillari in vetro borosilicato a cui si fa riferimento nel testo per ottenere una micropipetta con un'apertura della punta di circa 0,3 micron di diametro. Per evitare di intasare il puntale della pipetta, filtrare una soluzione di cloruro di calcio da cinque millimolari in una soluzione tampone HEPES utilizzando un filtro per siringa da 0,2 a 0,5 micron prima dell'uso.

Quindi, riempire nuovamente ogni micropipetta con otto microlitri di soluzione di cloruro di calcio utilizzando un Microloader. Collegare un supporto per micropipette a un micromanipolatore. Montare saldamente la micropipetta nel supporto della micropipetta.

Quindi collegare la pompa di iniezione e il supporto capillare utilizzando il tubo di alimentazione. Dopo aver avviato la pompa di iniezione, regolare le impostazioni della pompa di iniezione su una pressione di iniezione di 20 ettopascali. Impostare anche una pressione di compensazione di cinque ettopascali.

Impostare il microscopio in modalità campo chiaro. Configuralo per il contrasto interferenziale differenziale. Utilizzare il micromanipolatore grossolano per posizionare la micropipetta sopra la gocciolina contenente i complessi GUV-MLV.

Posizionare la punta della micropipetta sopra l'obiettivo e portare la pipetta fino alla gocciolina utilizzando il micromanipolatore grossolano. Impostare il microscopio in modalità fluorescenza. Posizionare la punta della micropipetta a una distanza di tre micron dalla superficie della membrana mentre si inietta la soluzione di cloruro di calcio dalla micropipetta per consentire la formazione di MTP.

Per tradurre l'MTPS lungo la superficie GUV, spostare lentamente la punta della pipetta attorno alla superficie GUV utilizzando il micromanipolatore fine. Mantenere approssimativamente la stessa distanza tra la superficie del GUV e la punta della micropipetta mentre si continua l'iniezione di ioni calcio. Per interrompere la microiniezione, spegnere la pompa di iniezione.

Di seguito è mostrata un'immagine rappresentativa al microscopio a fluorescenza di un complesso GUV-MLV immobilizzato sulla superficie di un vetrino coprioggetti. In queste immagini si possono vedere le sporgenze tubulari della membrana generate dall'iniezione localizzata di ioni calcio sulla superficie del GUV. La traslazione della punta della micropipetta attorno alla superficie della membrana, come indicato dalla freccia, innesca il movimento delle sporgenze tubulari della membrana in direzione della sorgente di ioni calcio.

Per riassumere, proponiamo una tecnica che consente il rimodellamento della membrana senza contatto di vescicole lipidiche giganti che ha portato alla formazione di sporgenze tubulari di membrana dopo stimolazione localizzata con ioni calcio. Le applicazioni future di questo metodo includono la transizione dalle vescicole lipidiche sintetiche alle membrane biologiche native o l'applicazione di questo approccio ai sistemi polimerici con lo scopo di sviluppare piattaforme di micromanipolazione senza contatto.