Metodi per studiare epiteliale Trasporti funzione delle proteine ​​e di espressione in nativo Intestino e Caco-2 cellule coltivate in 3D

L'obiettivo generale di questo protocollo è coltivare cellule intestinali Caco-2 in tre dimensioni e dimostrare l'utilizzo della camera di Ussing negli studi sulla regolazione del trasportatore della serotonina. I metodi qui mostrati possono rispondere a domande fondamentali nel campo del trasporto epiteliale, come ad esempio in che modo il trasportatore intestinale della serotonina, SERT, viene regolato. Il principale vantaggio dei Caco-2 in 3D è che riflettono in modo più accurato le interazioni cellula-cellula e cellula-matrice extracellulare rispetto ai monociti.

La tecnica della camera di Ussing consente misurazioni precise della funzione di trasporto nell'epitelio intestinale. L'utilizzo di colture Caco in 3D si estende alla scoperta di terapie, poiché questi modelli permettono lo screening di agenti attivi contro malattie associate a una funzione di trasporto alterata. Sebbene questo metodo fornisca informazioni sulla regolazione del trasportatore della serotonina, può essere applicato anche a studi su altri trasportatori di elettroliti, come quelli del sodio e del cloro.

La dimostrazione visiva di queste tecniche è fondamentale, poiché rimuovere il layer sieromuscolare e montare la mucosa intestinale nelle camere di Ussing è difficile da imparare. La dimostrazione delle procedure con cellule Caco-2 in 3D sarà effettuata da Ishita Chatterjee, istruttore, e Anoop Kumar, ricercatore post-dottorato del nostro gruppo. La dimostrazione della rimozione del layer sieromuscolare dall’ileo di topo sarà effettuata da Sangeeta Tyagi, specialista senior in ricerca del mio laboratorio.

Inoltre, Shubha Priyamvada e Arivarasu Natarajan, docenti del mio laboratorio, mostreranno il montaggio della mucosa privata e il suo inserimento nelle camere di Ussing. Per iniziare, scongelare la soluzione proteica gelatinosa con fattori di crescita ridotti tutta la notte sul ghiaccio in un refrigeratore a quattro gradi Celsius. Una volta scongelata, preparare aliquote da un millilitro o da 500 microlitri.

Nel giorno della coltura, preraffreddare le camere di vetro sul ghiaccio. Quindi, aggiungere 30 microlitri della soluzione proteica gelatinosa in ogni pozzetto della camera di vetro a otto pozzetti ed estenderla uniformemente. Durante l'inoculo della miscela gelatinosa nella camera o nelle piastre, è necessario fare attenzione a evitare la formazione di bolle d'aria, poiché le cellule potrebbero staccarsi.

Posizionare la piastra colturale all'interno di un'incubatrice per colture cellulari a 37 gradi Celsius per 15-30 minuti, in modo da permettere alla soluzione di solidificarsi. Successivamente, utilizzare la tripsina per staccare le cellule Caco-2 confluenti da un'ampolla di coltura. Quindi, contare le cellule con un emocitometro e centrifugare a 500 ×g a quattro gradi Celsius per cinque minuti.

Sospendere nuovamente il pellet cellulare risultante nel mezzo 3D Caco-2 per ottenere una sospensione della densità desiderata. Utilizzando la sospensione cellulare preparata, seminare 4.000 cellule per pozzetto sui vetrini a camera e lasciarle crescere per 12-14 giorni in un incubatore umidificato con 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius. Per colorare le cellule, aspirare prima il mezzo e fissare le cellule con 400 microlitri di PFA al 2%.

Continuare la fissazione delle cellule per 20 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver lavato le cellule due volte in PBS, permeabilizzarle con una soluzione di Triton al 0,5% in PBS per non più di 15 minuti. Risciacquare le cellule due volte in tampone PBS contenente glicina, quindi lavare le cellule permeabilizzate in tampone IF per dieci minuti a temperatura ambiente.

Bloccare le cellule utilizzando siero di capra normale al 5% nel buffer IF. Successivamente, incubare le cellule con 200 microlitri di anticorpo primario diluito nel buffer IF integrato con siero di capra all'1% per una o due ore a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, lavare le cellule tre volte con il buffer IF.

Incubare le cellule lavate con 200 microlitri di anticorpo secondario diluito nel buffer IF integrato con siero di capra al 1% per un'ora a temperatura ambiente. Lavare le cellule con il buffer IF per tre volte, dieci minuti ciascuna. Per staccare la camera dal vetrino, posizionare prima il vetrino nel supporto porta-oggetti, quindi far scivolare il sollevatore bianco attraverso il supporto finché non entra in contatto con il bordo dei pozzetti.

Estrarre delicatamente la camera dalla lamella. Utilizzare una scatola nera coperta per proteggere le lamelle dalla luce. Montare le lamelle con un mezzo anti-sfalsamento lento e coprirle con coprioggetti.

Dopo aver lasciato asciugare i vetrini per dieci minuti a temperatura ambiente, sigillarli con lo smalto per unghie prima dell'acquisizione delle immagini. Isolare l'ileo del topo seguendo la procedura descritta nel protocollo testuale. Successivamente, utilizzando delle forbici, aprire l'intestino in senso longitudinale.

Incubare la sezione di tessuto risultante in tampone KBR gassato e freddo contenente un micromolare di indometacina per dieci minuti. Fissare una sezione intestinale lunga circa un centimetro, con il lato mucoso verso il basso, su una piastra contenente agarosio al 7% spesso 0,5 centimetri o un elastomero di silicone polimerizzato. Utilizzando un microscopio stereoscopico da dissezione con illuminazione inferiore, rimuovere gli strati sieromuscolari.

Quindi, tagliare il strato sieromuscolare con una lama a scalpello a forma di piuma. Utilizzare pinzette fini per sollevare il margine del strato lungo l'asse longitudinale dell'intestino. Infine, montare con attenzione la mucosa sui perni dello slider.

Tenere il tessuto mucoso scollato dai bordi per evitare strappi. Durante il montaggio della mucosa ileale scollata sui perni del supporto, è necessario adottare precauzioni per evitare di strappare il tessuto in corrispondenza delle teste dei perni e per ridurre al minimo i danni ai bordi del tessuto. Prima del trattamento del tessuto, preparare la soluzione di Krebs saturata con 95%ossigeno, 5%anidride carbonica.

Quindi, versare la soluzione in una camera di Ussing. Aggiungere 10 micromoli di glucosio come substrato energetico nel bagno sieroso e 10 micromoli di mannitolo per mantenere l'equilibrio osmotico nel bagno mucoso. Successivamente, inserire lo slider con la mucosa montata nella camera, in modo da esporre sia il lato apicale che quello basolaterale del tessuto alla soluzione di Krebs.

Equilibrare il tessuto ileale nel bagno per dieci minuti. Successivamente, pretrattare il lato apicale con fluoxetina 10 micromolare per 30 minuti per la misurazione del flusso dalla mucosa alla sierosa. Infine, trattare il lato basolaterale del tessuto con TGF beta 1 a 10 nanogrammi per millilitro per un'ora, quindi incubare il lato apicale con 5-HT triziato a 20 nanomolare per 30 minuti.

Per calcolare le velocità di flusso dalla mucosa alla sierosa, raccogliere aliquote di 0,75 millilitri dal serbatoio sieroso, sostituendole con volumi identici del mezzo di bagnatura per prevenire differenze di pressione idrostatica attraverso la mucosa. Per quantificare la 5-HT triziata accumulata nel tessuto, rimuovere la mucosa dallo slider. Lavarla una volta con tampone KRB freddo di ghiaccio e posizionarla in un tubo di cultura in vetro.

Incubare la mucosa in 0,5 millilitri di KOH al 10% per tutta la notte a 37 gradi Celsius per lisare il tessuto. Successivamente, misurare la radioattività in aliquote da 150 microlitri dei lisati in triplice replicato mediante un contatore a scintillazione liquida. Mediante il metodo di Bradford, misurare la concentrazione proteica in aliquote da tre a cinque microlitri dei lisati.

Qui sono mostrati cisti di Caco-2 coltivati in coltura 3D, colorati per l'actina, e cisti 3D di Caco-2 colorati contemporaneamente per l'actina, i nuclei e la proteina SERT. SERT è visibile nella membrana luminale e nei compartimenti subapicali. Per confermare ulteriormente il vantaggio delle sfere 3D di Caco-2 rispetto ai monociti 2D di Caco-2, è stata eseguita un'analisi mediante western blot dell'espressione proteica di SERT.

I risultati hanno mostrato un'espressione aumentata della proteina SERT nelle sferoidi tridimensionali di Caco-2 rispetto alle cellule Caco-2 in coltura bidimensionale. Infine, è stato utilizzato un sistema di camera di Ussing per dimostrare che il TGF beta aumenta il flusso dalla mucosa alla sierosa, indicando un incremento dell'assorbimento di 5-HT dalla membrana luminale e un maggiore accumulo di 5-HT osservato nella mucosa ileale. Questi risultati sono confermati dalla sensibilità osservata dell'assorbimento di 5-HT al trattamento con fluoxetina, che corrisponde all'espressione di SERT sulla membrana luminale.

Una volta padroneggiata, questa tecnica di dissottrazione e montaggio della mucosa ileale può essere completata in 15 minuti. Durante l'adozione di questa procedura, è importante ricordare che, dopo il prelievo dall'animale, il preparato intestinale extravivo ha una vitalità limitata e può durare fino a tre ore. Cisti 3D di Caco-2 possono essere utilizzate per diversi studi, come eventi di traffico della membrana, espressione genica o interazioni proteina-proteina di trasportatori epiteliali.

Dopo il suo sviluppo, la tecnica 3D con Caco-2 apre la strada ai ricercatori nel campo del trasporto intestinale per esplorare il movimento dei fluidi e studiare la patofisiologia delle malattie intestinali. Non dimenticare che lavorare con radioattività può essere estremamente pericoloso, e precauzioni, come l'uso di dispositivi di protezione individuale (DPI) e adeguate procedure di decontaminazione, devono essere sempre adottate. Dopo aver visto questo video, sarai in grado di coltivare cellule Caco-2 in colture tridimensionali e di utilizzare queste colture per indagare l'espressione dei trasportatori epiteliali.

Sarà inoltre possibile utilizzare la camera di Ussing per studiare la funzione di trasporto della serotonina nell'intestino nativo del topo.