Metodi per studiare epiteliale Trasporti funzione delle proteine ​​e di espressione in nativo Intestino e Caco-2 cellule coltivate in 3D

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di far crescere cellule Caco-2 intestinali in tre dimensioni e di dimostrare l'uso della camera di Ussing negli studi sulla regolazione del trasportatore della serotonina. I metodi qui mostrati possono rispondere a domande chiave nel campo del trasporto epiteliale, come ad esempio come viene regolato il trasportatore intestinale della serotonina, il SERT. Il vantaggio principale del Caco-2 3D è che riflette le interazioni cellula-cellula e cellula-matrice extracellulare in modo più accurato rispetto ai monostrati.

E la tecnica della camera di Ussing consente misurazioni precise della funzione di trasporto nell'epitelio intestinale. L'implicazione del 3D, le colture Caco si estendono verso la scoperta di terapie perché questi modelli consentono lo screening di agenti contro malattie associate a una funzione di trasporto alterata. Sebbene questo metodo fornisca informazioni sulla regolazione del trasportatore della serotonina, può anche essere applicato a studi su altri trasportatori di elettroliti come il sodio e il cloruro.

La dimostrazione visiva di queste tecniche è fondamentale, poiché lo stripping dello strato sieromuscolare e il montaggio della mucosa intestinale nelle camere di Ussing sono difficili da imparare. A dimostrare le procedure cellulari 3D Caco-2 saranno Ishita Chatterjee, istruttore, e Anoop Kumar, un borsista postdoc del nostro gruppo. A dimostrare lo stripping dello strato sieromuscolare dall'ileo di topo sarà Sangeeta Tyagi, uno specialista di ricerca senior del mio laboratorio.

A dimostrare il montaggio della mucosa sverniciata e il loro inserimento nelle camere di Ussing saranno anche Shubha Priyamvada e Arivarasu Natarajan, istruttori del mio laboratorio. Per iniziare, scongelare la soluzione proteica gelatinosa ridotta del fattore di crescita durante la notte su ghiaccio in un frigorifero a quattro gradi Celsius. Una volta scongelato, preparare un millilitro, ovvero 500 microlitri di aliquote.

Nella giornata della cultura, preraffreddare gli scivoli a camera sul ghiaccio. Quindi, aggiungere 30 microlitri di soluzione proteica gelatinosa a ciascun pozzetto del vetrino a otto pozzetti e distribuirlo uniformemente. Durante la placcatura della miscela gelatinosa nel vetrino della camera o nelle piastre, prestare attenzione per evitare la formazione di bolle poiché le cellule potrebbero staccarsi.

Posizionare il piatto coltivato all'interno di un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius per 15-30 minuti per consentire alla soluzione di solidificarsi. Successivamente, utilizzando la tripsina, staccare le cellule Caco-2 confluenti da un pallone di coltura. Quindi, conta le cellule in un emocitometro e centrifugale a 500 volte g a quattro gradi Celsius per cinque minuti.

Risospendere il pellet di cella risultante in terreno 3D Caco-2 per ottenere la sospensione della densità desiderata. Utilizzando la sospensione cellulare preparata, seminare 4.000 cellule per pozzetto sui vetrini della camera e lasciarle crescere per 12-14 giorni in un incubatore umidificato al 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius. Per colorare le cellule, aspirare prima il terreno e fissare le cellule con 400 microlitri di PFA al 2%.

Continuare a fissare le celle per 20 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver lavato due volte le cellule in PBS, permeabilizzarle con una soluzione di Triton allo 0,5% in PBS per non più di 15 minuti. Sciacquare le cellule due volte nel tampone di glicina PBS e quindi lavare le cellule permeabilizzate nel tampone IF per dieci minuti a temperatura ambiente.

Bloccare le cellule utilizzando il 5% di siero di capra normale nel tampone IF. Quindi, incubare le cellule con 200 microlitri di anticorpi primari diluiti in tampone IF integrato con siero di capra all'1% per una o due ore a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, lavare le cellule tre volte con tampone IF.

Incubare le cellule lavate con 200 microlitri di anticorpo secondario diluito in tampone IF integrato con siero di capra all'1% per un'ora a temperatura ambiente. Lavare le celle con tampone IF tre volte per dieci minuti. Per staccare la camera del vetrino in vetro, posizionare prima il vetrino nel supporto della base del vetrino, quindi far scorrere il sollevatore bianco attraverso il supporto fino a quando non tocca il bordo dei pozzetti.

Tirare delicatamente la camera per rimuoverla dal vetrino. Utilizzare una scatola nera coperta per proteggere i vetrini dalla luce. Montare i vetrini con un mezzo anti-sbiadimento lento e coprirli con vetrini.

Dopo aver lasciato asciugare i vetrini per dieci minuti a temperatura ambiente, sigillarli con smalto per unghie prima dell'imaging. Isolare l'ileo di topo seguendo la procedura descritta nel protocollo di testo. Quindi, usando le forbici, apri l'intestino longitudinalmente.

Incubare la sezione di tessuto risultante in un tampone KBR gassoso ghiacciato contenente un indometacina micromolare per dieci minuti. Appuntare una sezione intestinale lunga circa un centimetro, con la mucosa rivolta verso il basso, su una piastra contenente agarosio al 7% di spessore 0,5 centimetri o elastomero siliconico polimerizzato. Utilizzando uno stereomicroscopio da dissezione con illuminazione inferiore, rimuovere gli strati sieromuscolari.

Quindi, tagliare lo strato sieromuscolare con una lama di bisturi a forma di piuma. Usa una pinza fine per sollevare il bordo dello strato lungo l'asse longitudinale dell'intestino. Infine, montare con cura la mucosa sui perni del cursore.

Tenere il tessuto mucoso spogliato per i bordi per evitare strappi. Durante il montaggio della mucosa iliale spogliata sui perni del cursore, è necessario prendere precauzioni per evitare di strappare il tessuto in corrispondenza delle capocchie dei perni e per ridurre al minimo il danneggiamento dei bordi del tessuto. Prima del trattamento tissutale, preparare la soluzione di Krebs gassata con il 95% di ossigeno e il 5% di anidride carbonica.

Quindi, versare la soluzione in una camera di Ussing. Aggiungere 10 micromolari di glucosio come substrato energetico al bagno sieroso e 10 micromolari di mannitolo per mantenere l'equilibrio osmotico al bagno mucoso. Successivamente, inserire il cursore con la mucosa montata nella camera per esporre sia il lato apicale che quello basolaterale del tessuto alla soluzione di Krebs.

Equilibrare il tessuto ileale nella vasca da bagno per dieci minuti. Quindi, pretrattare il lato apicale con 10 micromolari di fluoxetina per 30 minuti per la misurazione del flusso da mucoso a sieroso. Infine, trattare il lato basolaterale del tessuto con 10 nanogrammi per millilitro di TGF beta 1 per un'ora, quindi incubare il lato apicale con 20 nanomolari triziati 5-HT per 30 minuti.

Per calcolare le velocità di flusso da mucosa a sieroso, raccogliere aliquote da 0,75 millilitri dal serbatoio sierosa, sostituendole con volumi identici del mezzo del bagno per evitare differenze di pressione idrostatica attraverso la mucosa. Per quantificare la 5-HT triziata accumulata nel tessuto, rimuovere la mucosa dal cursore. Lavalo una volta con un tampone KRB ghiacciato e mettilo in una provetta di vetro.

Incubare la mucosa in 0,5 millilitri di 10%KOH durante la notte a 37 gradi Celsius per lisare il tessuto. Quindi, misurare la radioattività in aliquote da 150 microlitri di lisati in triplicato utilizzando un contatore a scintillazione liquida. Utilizzando il metodo Bradford, misurare la concentrazione proteica in aliquote da tre a cinque microlitri di lisati.

Qui sono mostrate cisti di Caco-2 cresciute in coltura 3D colorate per actina e cisti Caco-2 3D colorate contemporaneamente per actina, nuclei e proteina SERT. Il SERT è visibile nella membrana luminale e nei compartimenti subapicali. Per confermare ulteriormente il vantaggio delle sfere 3D di Caco-2 rispetto ai monostrati di Caco-2 2D, è stata eseguita l'analisi western blot dell'espressione della proteina SERT.

I risultati hanno mostrato una maggiore espressione della proteina SERT nelle sfere Caco-2 3D rispetto alle cellule Caco-2 2D. Infine, è stato utilizzato un sistema a camera di Ussing per dimostrare che il TGF beta aumenta il flusso da mucosa a sieroso, riflettendo l'aumento dell'assorbimento di 5-HT dalla membrana luminale e l'aumento dell'accumulo di 5-HT osservato nella mucosa ileale. Tali risultati sono supportati dalla sensibilità osservata dell'assorbimento della 5-HT al trattamento con fluoxetina che corrisponde all'espressione di SERT sulla membrana luminale.

Una volta padroneggiata, questa tecnica di stripping e montaggio della mucosa ileale può essere completata in 15 minuti. Nell'adottare questa procedura, è importante ricordare che al momento della rimozione dall'animale, il preparato extravio intestinale ha una vitalità limitata e può durare fino a tre ore. Le cisti 3D Caco-2 potrebbero essere utilizzate per vari studi come gli eventi di traffico di membrana, l'espressione genica o l'interazione proteina-proteina dei trasportatori epiteliali.

Dopo il suo sviluppo, la tecnica 3D Caco-2 apre la strada ai ricercatori nel campo del trasporto intestinale per esplorare il movimento dei fluidi e studiare la fisiopatologia delle malattie dariali. Non dimenticare che lavorare con la radioattività può essere estremamente pericoloso e che è necessario prendere sempre precauzioni, come l'uso di DPI e adeguate procedure di decontaminazione. Dopo aver visto questo video, sarai in grado di coltivare cellule Caco-2 in colture 3D e di utilizzare queste colture per studiare l'espressione del trasportatore epiteliale.

Sarai anche in grado di utilizzare la camera di Ussing per studiare la funzione di trasporto della serotonina nell'intestino nativo del topo.