Sistemi HeLa cellule base libera espressione a manifestare Plasmodium Rhoptry Proteine

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di tradurre le proteine del plasmodio utilizzando sistemi di espressione cell-free basati su hela e di purificare le proteine da micro volumi di prodotto tradotto. Ciò si ottiene clonando i geni del plasmodio per preparare plasmidi ricombinanti per la traduzione in vitro in due fasi e in una fase, l'espressione libera da cellule delle proteine dell'albero RT ricombinante della malaria. Per tradurre le proteine ricombinanti, il plasmide preparato viene incubato con una miscela di trascrizione.

Quando si utilizza il sistema di espressione a due fasi, che trascrive l'mRNA, l'mRNA risultante viene quindi aggiunto al mix di traduzione per la traduzione delle proteine. Durante l'utilizzo del sistema di espressione in un solo passaggio, il plasmide ricombinante viene incubato con lisato di cellule hela per la trascrizione e la traduzione delle proteine ricombinanti. Le proteine ricombinanti vengono quindi purificate da micro volumi di prodotto di traduzione.

I risultati mostrano un'espressione e una purificazione di successo basate sull'analisi del western blotting. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altre, come il sistema di espressione del germe di grano e il sistema del lisato dei reticolociti di coniglio, è che questo sistema può esprimere le proteine in tre ore. Non è richiesta alcuna ottimizzazione della codifica.

È conveniente e facile da usare. È possibile eseguire lo screening di più antigeni su microarray, rendendo possibile il rilevamento di antigeni per la terapia e la diagnosi. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché si tratta di un'espressione priva di cellule, che esprime proteine in microvolumi, rendendo estremamente difficile la purificazione delle proteine.

All'inizio abbiamo avuto l'idea di utilizzare questo sistema in quanto non potevamo esplare le proteine espresse utilizzando l'e coli e trovavamo altri sistemi di espressione troppo costosi e dispendiosi in termini di tempo. Abbiamo deciso di esplorare il sistema di espressione cell-free basato su hela come sistema alternativo. Preparare 20 microlitri di miscela di trascrizione contenente DNA vettore plasmidico ricombinante come descritto nel protocollo di testo per l'espressione proteica umana in vitro in due fasi.

Utilizzo di modelli di DNA. Mescolare i componenti in una provetta da microcentrifuga e incubare per 75 minuti a 30 gradi Celsius a bagnomaria. Quindi prelevare due microlitri della miscela di trascrizione e aggiungerla a 23 microlitri di miscela di traduzione contenente lisato di cellule Hela.

Incubare la miscela risultante a 30 gradi Celsius per 90 minuti. Conserva i prodotti tradotti a meno 20 gradi Celsius. Successivamente, preparare 25 microlitri della miscela di trascrizione e traduzione contenente il vettore plasmidico ricombinante, il DNA e un lisato come descritto nel protocollo di testo per l'espressione di proteine di traduzione in vitro accoppiate umane in un solo passaggio per i modelli di DNA.

Incubare questa miscela di reazione per 90-6 ore a 30 gradi Celsius e conservare i prodotti di traduzione a meno 20 gradi Celsius. Per purificare le proteine ricombinanti espresse, aggiungere 75 microlitri di un tampone di purificazione X a 25 microlitri di prodotto di traduzione per ottenere 100 microlitri di miscela di purificazione. Lavare due volte la resina di nichel aggiungendo 300 microlitri di acqua distillata e 300 microlitri di tampone legante.

Risospendere la resina e centrifugare a 14.000 g per un minuto per rimuovere l'etanolo in eccesso. Quindi, aggiungere 100 microlitri della soluzione di purificazione preparata a 100 microlitri di resina chelante al nichel e incubare la miscela su un'estremità. Terminare l'agitazione per 60 minuti a temperatura ambiente.

Centrifugare la miscela a 14.000 g per un minuto e raccogliere il supernat in una provetta nuova etichettata come flusso. Lavare la resina con 100 microlitri di un tampone di lavaggio, quindi centrifugare a 14.000 GS per un minuto e raccogliere il super nominato in un tubo fresco etichettato con lavaggio. Ripetere questo passaggio due volte dopo il lavaggio.

Aggiungere 100 microlitri di un tampone di eluizione alla resina e incubare su un agitatore per 15 minuti. Quindi centrifugare a 14.000 g per un minuto. Esegui il passo Elluciano due volte ogni volta.

Raccogliere il surnatante in una nuova provetta per microcentrifuga ed etichettare come eluato dopo l'elluciano. Lavare la resina due volte come prima e poi conservarla a quattro gradi Celsius. Conservare il flusso attraverso i lavaggi e i campioni di eluizione a una temperatura di meno 20 gradi Celsius o inferiore per eseguire il western blotting.

Per prima cosa, preparare provette separate di estratti di schon da P falsy parum e coli, le proteine R tre ricombinanti espresse, le proteine ricombinanti preparate e i prodotti proteici purificati utilizzando il metodo dell'affinità. Successivamente, aggiungere un tampone per campioni di elettroforesi contenente mercaptoetanolo a ciascuna provetta per un volume finale di 20 microlitri. Per preparare campioni di proteine solubilizzate, far bollire le provette per due minuti.

Caricare i campioni di proteine solubilizzate su gel di pagina 10% SDS per separare le proteine dopo aver eseguito i gel. Trasferire le proteine separate dai gel della pagina SDS alla carta di nitrocellulosa mediante elettroforesi a 35 milliampere di corrente per gel in una camera di blotting occidentale semi-asciutta per due ore dopo il trasferimento e il blocco della carta di nitrocellulosa con il 2% di latte scremato. Incubare la carta di nitrocellulosa con gli anticorpi policlonali elencati nel protocollo di testo per i controlli negativi.

Incubare anche la carta di nitrocellulosa in uno a 100 siero normale diluito di topo e coniglio e coltura superata denominata da SB due cellule di mieloma. Dopo l'incubazione della carta di nitrocellulosa a quattro gradi Celsius durante la notte, lavata quattro volte con tampone blot e incubata con anticorpi secondari specie-specifici, coniugati alla perossidasi di rafano, diluiti da uno a 1000 in latte al 2%. Quindi lavare nuovamente la carta nitrocellulosica quattro volte con tampone blot.

Infine incubare la carta nitrocellulosica lavata con una soluzione di sviluppo del colore, A più B per 30 minuti al buio, l'espressione riuscita delle proteine del plasmodio utilizzando sistemi di espressione liberi da cellule umane in vitro è stata confermata da RT albero specifico di coniglio antier come mostrato le proteine ricombinanti precedentemente espresse non sono state riconosciute dagli antisieri contro le proteine vae della parassitosi da p FAL parem e P Yoi Lee, dimostrando la specificità degli antisieri di coniglio 6 76 contro le proteine espresse. Il siero di coniglio normale non ha reagito con le proteine ricombinanti. Tradotto utilizzando il sistema di espressione libera da cellule umane in vitro in due fasi e il sistema di traduzione in vitro accoppiato in una fase.

Qui viene mostrata la purificazione riuscita delle proteine tradotte da 25 microlitri di prodotti proteici tradotti. In particolare, è stata dimostrata una purificazione efficace della proteina transmembrana della schisi di mara. Viene anche dimostrato il successo della purificazione di un'ipotetica proteina da geni codificanti per proteine dell'albero del plasmodio RT.

Infine, viene dimostrato il successo della purificazione delle ripetizioni di armadillo contenenti la proteina dell'albero plasmodium RT. La resa di proteine dopo la purificazione è di 3,5 microgrammi per 25 microlitri dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della parassitologia per la caratterizzazione delle proteine nei parassiti, le interazioni proteina-proteina, gli studi inibitori degli anticorpi e lo sviluppo di vaccini nel campo della parassitologia.

Dopo aver visto questo video, dovresti capire come utilizzare il sistema di espressione cellulare basato su cellule libere del guaritore per esprimere le proteine del plasmodio in tre ore. Avrai anche una comprensione di come purificare le proteine da micro volumi di prodotto tradotto.