Un metodo di estrazione e analisi lipidica per la caratterizzazione dei microbi del suolo negli esperimenti con molti campioni

L'obiettivo di questo video è descrivere un metodo che aumenta la produttività mantenendo un equilibrio tra sforzo e accuratezza nell'estrazione dei lipidi dalle membrane cellulari di microorganismi, al fine di caratterizzare sia i lipidi totali che l'abbondanza relativa dei lipidi indicatore per determinare la struttura della comunità microbica del suolo e per studi con un elevato numero di campioni. In campo, è necessario tenere conto dell'eterogeneità del suolo raccogliendo i campioni in modo da rappresentare adeguatamente l'area di studio. Per preservare la comunità microbica al momento del campionamento, i campioni devono essere trasportati dal campo su ghiaccio.

Una volta rientrati in laboratorio, rimuovere le radici e le pietre e spezzare i grumi mediante setacciatura grossolana. Questa operazione serve anche ad omogeneizzare il campione. Preparare il campione per la liofilizzazione ponendo le sottocampionature in contenitori adeguati e procedere alla liofilizzazione il più presto possibile.

Dopo che i suoli sono stati liofilizzati, conservarli in un contenitore sigillato con disidratante fino all'estrazione. È preferibile conservare i suoli liofilizzati a -80 gradi C. Come preparazione per l'estrazione, rimuovere i suoli liofilizzati dallo stoccaggio e macinarli. I metodi di macinazione includono il mulino a sfera, il misuratore a sfera o il mortaio e pestello.

Dopo aver macinato nuovamente il suolo, omogeneizzare accuratamente i campioni di suolo e conservarli nel congelatore. Tutta l'apparecchiatura di laboratorio deve essere accuratamente pulita. Eventuali residui di detersivo, grasso o sporcizia possono influenzare i risultati, comparando come picchi nel cromatogramma finale di gascromatografia (GC).

Le estrazioni vengono effettuate in provette in centrifuga in teflon da 30 millilitri, che devono essere risciacquate con solvente. Aggiungere due o tre millilitri di esano alle provette e vorticare per alcuni secondi. Decantare l'esano in un'altra provetta e vorticare.

Da due a tre millilitri di esano possono essere utilizzati per risciacquare in serie sei provette. Conservare le provette risciacquate con esano capovolte nella cappa e smaltire l'esano usato in un contenitore per rifiuti appropriato. La vetreria può essere riscaldata in muffola o risciacquata con solvente immediatamente prima dell'uso.

La muffolatura garantisce la pulizia della vetreria mediante l'ossidazione dei residui ad alta temperatura. Avvolgere la vetreria in due o tre strati di carta d'alluminio e posizionarla nel forno muffola. Impostare a 450 gradi C e, una volta raggiunta la temperatura desiderata, mantenere la cottura per un minimo di 4 ore e mezza.

Attendere almeno un'ora per il raffreddamento prima di rimuovere il campione dal forno. Etichettare e pesare i tubi in Teflon risciacquati con esano. Aggiungere il suolo nei tubi in Teflon per centrifuga e pesarli nuovamente per determinare la massa del suolo.

Preparare sempre almeno due bianchi per ogni lotto ed includere un campione di controllo, preferibilmente un suolo precedentemente estratto, se si desidera verificare che l'estrazione abbia funzionato correttamente. Estrazioni lipidiche. Preparare tre pipette ricaricabili da cinque a 10 millilitri rispettivamente per il tampone fosfato, il cloroformio e il metanolo.

Il cloroformio è un liquido molto denso con una bassa tensione superficiale. Prestare attenzione affinché la quantità erogata sia accurata e costante. Mantenere la bottiglia almeno per metà piena di liquido.

Nella cappa, aggiungere i reagenti al suolo nel tubo in teflon seguendo quest'ordine: tampone fosfato, cloroformio e metanolo. Questa è la prima estrazione fisica dei lipidi dal materiale del campione. Le ricette per le soluzioni dei reagenti sono incluse nel protocollo scritto.

Le proporzioni dei solventi e l'ordine di aggiunta sono importanti per una corretta separazione delle fasi organica e acquosa. Lasciare il tempo ai suoli di bagnarsi dopo l'aggiunta del buffer prima di aggiungere il cloroformio. Se conveniente, gli estrattori possono essere combinati e aggiunti come un singolo aliquota per la seconda estrazione e per eventuali estrazioni successive.

Chiudere ermeticamente i tubi in teflon e coprirli per proteggerli dalla luce. Posizionarli sullo shaker in posizione orizzontale, assicurandosi che siano ben fissati. Agitare a velocità elevata per un'ora.

Mentre i tubi vengono agitati, preparare due tubi di vetro lunghi per ogni campione come segue. Etichettare il tubo, aggiungere lo stesso volume di cloroformio aggiunto al suolo e un volume uguale di tampone fosfato. Dopo aver rimosso i tubi in teflon dall'agitatore, centrifugare i tubi a 25 gradi C per 10 minuti a 2.500 giri al minuto.

Quindi, in cappa con le luci spente, versare delicatamente il soprannatante dal tubo in teflon in uno dei tubi lunghi. La separazione delle fasi dovrebbe essere visibile nel tubo di vetro. Lo strato inferiore contiene il solvente organico, principalmente cloroformio, e i lipidi.

Questa estrazione viene ripetuta. Versare il soprannatante nel secondo tubo preparato in precedenza. A questo punto, i lipidi sono stati estratti fisicamente dal suolo due volte.

Per la maggior parte dei suoli, questo è sufficiente. Chiudere ermeticamente tutti i tubi lunghi con tappi rivestiti in teflon e capovolgere 10 volte per mescolare. Separare le fasi per gravità durante la notte.

Lasciare riposare i campioni indisturbati per tutta la notte per completare la separazione delle due fasi. A tale scopo, mantenere i campioni in un armadio al buio o coperti con carta d'alluminio a temperatura ambiente. È accettabile lasciare che gli estratti si separino anche durante il fine settimana.

Giorno due, isolamento dei lipidi. Nel secondo giorno, il livello acquoso viene aspirato e i lipidi vengono concentrati rimuovendo il solvente mediante un sistema di evaporazione sotto vuoto. I campioni possono anche essere essiccati ponendoli in un bagno d'acqua o di sabbia ed applicando un flusso delicato di azoto.

Il liquido nei tubi ora dovrebbe essere ben separato e in gran parte limpido. In caso contrario, o se l'interfaccia tra i due strati è particolarmente spessa, lasciare continuare la separazione per un altro giorno. Preparare un aspiratore a vuoto nella cappa.

Questo è un matraccio con ramo laterale collegato a una pompa per vuoto mediante un tubo in Tygon a forma di foglia e una pipetta di Pasteur. Con la pompa in funzione, utilizzare la pipetta per aspirare la fase acquosa nel matraccio. Aspirare lo strato superiore e l'interfaccia.

Questo sarà all'incirca a due terzi della profondità. Eseguire questa operazione su due o tre serie di provette di vetro. Lo strato superiore potrebbe contenere alcune particelle di suolo.

Rimuoverli, se possibile. Combinare l'estratto dal secondo e/o dal terzo set di provette con quello dei primi due versando con attenzione. Evitare di versare materiale solido e risciacquare le pareti della provetta ruotandola.

Utilizzare una pipetta pulita per ogni campione e ripetere questa procedura per i campioni rimanenti. Una volta che gli estratti di cloroformio sono stati combinati e sono rimasti a riposo per alcuni minuti, ispezionare la superficie del liquido. Spesso si forma uno strato sottile di acqua residua.

Se presente, aspirare prima di procedere. L'acqua residua potrebbe attaccare i doppi legami degli acidi grassi, ma una quantità molto piccola dovrebbe co-evaporare con i solventi durante l'essiccazione dei campioni. Essiccare tutti i campioni utilizzando l'apparato di evaporazione sotto vuoto.

Chiudere ermeticamente i tubi e conservarli in congelatore a 80 °C. Terzo giorno, saponificazione e metilazione. Per prima cosa, accendere i bagni termostatici. Controllare il livello dell'acqua e impostare il primo bagno a 95 °C e il secondo a 80 °C. Utilizzando una ripipetta, aggiungere un millilitro del reagente di saponificazione, Reagente 1, ai lipidi essiccati.

Chiudere saldamente, vortexare brevemente e posizionare su un supporto. Al termine di questo passaggio, inserire il supporto con le provette nel bagnomaria a 95 °C e attendere cinque minuti. Rimuovere il supporto con le provette dal bagnomaria e controllare le provette per verificare la presenza di perdite.

Questo sarà indicato dalla formazione di bolle che salgono nel tubo come una schiuma. Ristringere nuovamente o sostituire i tappi dei tubi che perdono. Continuare a scaldare i tubi nel bagnomaria per altri 10 minuti.

Abbassare l'impostazione della temperatura del bagnomaria a 80 gradi C e proseguire l'incubazione per altri 15 minuti. Rimuovere le provette e raffreddarle ponendo il portaprovette in una vasca contenente acqua corrente. Non utilizzare acqua ghiacciata.

Una volta che i campioni si sono raffreddati, aggiungere due millilitri del reagente di metilazione, Reagent 2, a ciascun campione. Chiudere nuovamente ermeticamente e vortexare per cinque-dieci secondi. Sali granulari possono diventare visibili come precipitato nella soluzione, il che accade talvolta a causa dell'eccesso di reagenti.

Posizionare il rack nel bagnomaria a 80 gradi C e incubare per 10 minuti. Rimuovere il rack dei tubi dal bagnomaria e collocarlo in un contenitore con acqua del rubinetto per il raffreddamento. Agitare il rack per accelerare il processo di raffreddamento.

Utilizzando una ripipetta, aggiungere 1,25 millilitri di esano ed etere metil-ter-butilico, Reagente 3, in ogni tubo per estrarre la fase. Chiudere bene i tappi e posizionare i tubi su un agitatore per 10 minuti. Dopo l'agitazione, lasciare riposare il portatubi per 10 minuti in modo che le fasi si separino.

Trasferire la fase organica, che ora è lo strato superiore, in un tubo di vetro corto utilizzando una pipetta Pasteur. È preferibile recuperare la maggior parte del liquido. Quantità molto piccole della fase acquosa non comprometteranno l'estrazione.

Ripetere l'estrazione della fase acquosa aggiungendo il Reagente 3, agitando, lasciando separare le fasi e trasferendo la fase superiore. A seconda delle condizioni della fase inferiore, è possibile ripetere questa operazione ancora una volta per un totale di tre trasferimenti. Aggiungere 3 millilitri della soluzione basica di lavaggio, Reagente 4, che è una soluzione diluita di idrossido di sodio, agli estratti nei tubi corti.

Chiudere ermeticamente le provette e vortexare per 20-30 secondi, quindi centrifugare per tre minuti a 2.000 giri al minuto. Dopo la centrifugazione, utilizzando una pipetta Pasteur pulita, aspirare la fase organica superiore e trasferirla in un vial ambrato da quattro millilitri. Prestare molta attenzione a non aspirare alcuna parte della fase acquosa.

Il passaggio successivo consiste nell'evaporare il solvente a secco mediante un apparecchio per l'evaporazione sotto vuoto. Giorno quattro: preparazione degli estratti per l'analisi con GC. Utilizzando la pipetta, aggiungere 100 microlitri del Reagente 3 a ciascuna delle provette da 4 millilitri contenenti la fase essiccata.

Vortexare il campione e quindi lasciarlo in riposo per 10 minuti. Utilizzando il secondo pipettatore, trasferire con attenzione i FAME sospesi in un vial per GC. Aggiungere un altro aliquota del solvente al vial da quattro millilitri e vortexare brevemente.

Ruotare il vial per assicurarsi che i FAME residui sulle pareti del vial siano disciolti. Utilizzando nuovamente la seconda pipetta, trasferire il solvente nel vial per GC. Completare il trasferimento aggiungendo un terzo aliquota di solvente al vial, vortexare e trasferire nel vial per GC.

Chiudere il vial del GC e conservarlo in congelatore. Conservare i vial del GC sigillati in congelatore prima dell'analisi. Analisi del GC.

Per utilizzare questo sistema, l'analisi deve essere eseguita utilizzando una specifica colonna GC. Il cromatografo a gas è dotato di un'iniettore split/splitless equipaggiato con un rivestimento in vetro da quattro millimetri di diametro interno, contenente un tappo in lana di vetro disattivata. L'iniettore è impostato a 250 gradi C e funziona in modalità di pressione costante.

Il gas trasportatore è l'idrogeno. Sono necessari azoto e aria come gas di supporto per il rivelatore. Si utilizza una colonna Agilent Ultra 2.

La colonna è lunga 25 metri, con un diametro interno di 2 millimetri e uno spessore del film della fase stazionaria di 33 micrometri. La fase stazionaria presente in questa colonna è costituita da polisilossano al 5% fenile e 95% metile, nota anche come colonna di tipo DB-5. Per analizzare gli estratti lipidici, viene iniettato un aliquota di due microlitri con un rapporto di split di 100:1 e una temperatura del forno impostata a 170 gradi C. Dopo l'iniezione, il forno è programmato per aumentare di cinque gradi al minuto fino a 300 gradi C, mantenendo poi questa temperatura per 12 minuti.

Vengono effettuate una serie di iniezioni dello standard MIDI e i risultati vengono utilizzati per apportare regolazioni secondo le istruzioni riportate nel manuale MIDI. Una volta calibrato in questo modo, il sistema potrebbe richiedere occasionalmente piccoli aggiustamenti, ma in generale dovrebbe raggiungere buoni risultati utilizzando questi parametri. Il sistema MIDI produce un rapporto per ogni campione contenente una tabella con una riga per ogni picco rilevato.

Il software riporta il tempo di ritenzione del picco, l'area del picco, l'identificazione del picco, insieme all'ECL (lunghezza della catena stimata) o lunghezza stimata della catena, un parametro utilizzato per l'identificazione dei picchi, e un fattore di risposta, un parametro impiegato per normalizzare le variazioni e la risposta del rivelatore rispetto al tempo di ritenzione. L'ECL indica tra quali FAME a catena lineare eluisce ciascun FAME sconosciuto. Ad esempio, se il tempo di ritenzione di un FAME sconosciuto corrisponde al punto intermedio tra quelli di una catena di 12 e 13 atomi di carbonio, l'ECL viene riportato come catena di 12,5 atomi di carbonio.

Il software confronta l'ECL di ciascun picco con quelli degli FAME presenti in un database e, quando trova corrispondenze, assegna il nome corrispondente all'ignoto. Nei casi in cui due FAME nel database presentano ECL molto simili, il software riporta entrambi i nomi, elencando per primo quello più vicino. Le tabelle dati dei rapporti possono essere raccolte in un foglio di calcolo o in un database.

Dopo aver corretto per il fattore di risposta, le aree dei picchi possono essere confrontate con l'area del picco di uno standard esterno o interno per determinare la concentrazione dell'estratto. Dividendo per la massa di suolo estratta, i dati possono essere espressi come massa di FAME per grammo di suolo oppure, utilizzando anche il peso molecolare di ciascun FAME, come nanomoli per grammo di suolo. I FAME biomarcatori possono quindi essere sommati per ottenere la biomassa dei gruppi microbici, e questi gruppi possono essere ulteriormente analizzati.

Ad esempio, qui osserviamo praterie non fertilizzate con una maggiore biomassa di FAME rispetto alle praterie fertilizzate. Entrambe presentano una biomassa superiore rispetto ai campi di mais circostanti. Inoltre, i FAME sono associati a gruppi funzionali specifici come funghi o batteri.

Queste associazioni sono specifiche per l'ecosistema, quindi è importante non generalizzarle eccessivamente. Questo tipo di analisi mostra se determinati gruppi sono più abbondanti in certi ambienti. Qui, i funghi sono più abbondanti nella prateria non fertilizzata rispetto al campo di mais.

Infine, un altro modo per analizzare la composizione complessiva della comunità microbica consiste nel confrontare l'abbondanza relativa di tutti i FAME simultaneamente, utilizzando metodi di ordinamento come il scaling multidimensionale non metrico (NMDS) o l'analisi delle componenti principali (PCA). In un ordinamento, le comunità microbiche più simili risulteranno più vicine tra loro. Pertanto, dai nostri dati di esempio, il mais e la prateria non fertilizzata risultano molto distanti, mentre alcuni campioni di prateria fertilizzata presentano comunità microbiche che ricordano quelle del mais e altri quelle della prateria non fertilizzata.

Le comunità microbiche sono spesso altamente variabili anche all'interno di uno stesso ambiente, pertanto non sempre si separano in modo netto. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione del processo mediante il quale i biomarcatori lipidici provenienti dalle membrane cellulari dei microrganismi vengono estratti dal suolo. L'estrazione degli acidi grassi fosfolipidici rappresenta un metodo efficace, rapido ed economico per valutare i gruppi microbici e la biomassa microbica totale attraverso l'identificazione di biomarcatori microbici specifici.