Un metodo di estrazione e analisi lipidica per la caratterizzazione dei microbi del suolo negli esperimenti con molti campioni

L'obiettivo di questo video è quello di descrivere un metodo che aumenta la produttività bilanciando lo sforzo e l'accuratezza per l'estrazione di lipidi dalle membrane cellulari di microrganismi per l'uso nella caratterizzazione sia dei lipidi totali che dell'abbondanza relativa di lipidi indicatori per determinare la struttura della comunità microbica del suolo e studi con molti campioni. Sul campo, è necessario tenere conto dell'eterogeneità del suolo raccogliendo campioni di terreno in modo da rappresentare il sito. Per preservare la comunità microbica al momento del campionamento, i campioni devono essere trasportati dal campo su ghiaccio.

Una volta tornati in laboratorio, rimuovere radici e noccioli e rompere le zolle mediante setacciatura grossolana. Questo serve anche per omogeneizzare il campione. Prepararsi per la liofilizzazione mettendo i campioni secondari in contenitori appropriati e liofilizzare il prima possibile.

Una volta che i terreni sono stati liofilizzati, conservarli in un contenitore sigillato con essiccante fino all'estrazione. È meglio conservare i terreni essiccati in congelatore a 80 gradi C.As una preparazione per l'estrazione, rimuovere i terreni liofilizzati dallo stoccaggio e macinare. I metodi per la macinazione includono mulino a sfere, misuratore a sfere o mortaio e pestello.

Dopo aver macinato il terreno, omogeneizza accuratamente i campioni di terreno e conservali nel congelatore. Tutti gli strumenti di laboratorio devono essere scrupolosamente puliti. Eventuali residui di detergente, grasso o sporco possono influire sui risultati apparendo come un picco nel cromatogramma GC finale.

Le estrazioni vengono effettuate in provette da centrifuga in teflon da 30 millilitri, che devono essere risciacquate con solvente. Aggiungere due o tre millilitri di esano ai tubi e agitare per alcuni secondi. Decantare l'esano in un altro tubo e vortice.

Due o tre millilitri di esano possono essere utilizzati per risciacquare in serie sei tubi. Conservare i tubi risciacquati con esano capovolti nella cappa aspirante e smaltire l'esano usato in un contenitore per rifiuti appropriato. La vetreria può essere ovattata o risciacquata con solvente immediatamente prima dell'uso.

L'ovattatura assicura che la vetreria sia pulita mediante ossidazione dei residui ad alta temperatura. Avvolgere la vetreria in due o tre strati di foglio di alluminio e metterla nel forno a muffola. Impostare a 450 gradi C e, una volta che il forno ha raggiunto il set point, cuocere per un minimo di 4 ore e mezza.

Attendere almeno un'ora per il raffreddamento prima di rimuoverlo dal forno. Etichettare e pesare i tubi di teflon risciacquati con esano. Aggiungere il terreno in provette centrifugate in teflon e pesare nuovamente per ottenere la massa del terreno.

Realizzare sempre almeno due pezzi grezzi per lotto e includere uno standard di controllo, preferibilmente un terriccio precedentemente estratto, se si vuole verificare che l'estrazione abbia funzionato correttamente. Estrazioni lipidiche. Preparare tre ripipette da 5 a 10 millilitri per tampone fosfato, cloroformio e metanolo.

Il cloroformio è un liquido molto denso con una bassa tensione superficiale. Fai attenzione che la quantità che eroghi sia accurata e costante. Conserva la bottiglia piena almeno per metà di liquido.

Nella cappa aspirante, aggiungere i reagenti al terreno nel tubo di teflon nel seguente ordine, tampone fosfato, cloroformio e metanolo. Questa è la prima estrazione fisica di lipidi dal materiale campione. Le ricette per le soluzioni di reagenti sono incluse nel protocollo scritto.

Le proporzioni del solvente e l'ordine di aggiunta sono importanti per una corretta separazione della fase organica e acquosa. Lasciare che i terreni si bagnino dopo l'aggiunta del tampone prima di aggiungere il cloroformio. Se necessario, gli estrattori possono essere combinati e aggiunti come un'unica aliquota per la seconda e per le successive estrazioni.

Chiudere bene i tubi di teflon e coprirli per proteggerli dalla luce. Posizionarli sullo shaker orizzontalmente assicurandosi che siano ben fissati. Con un'impostazione di velocità alta, agitare per un'ora.

Mentre le provette tremano, preparare due lunghe provette di vetro per ogni campione come segue. Etichettare il tubo, aggiungere lo stesso volume di cloroformio che è stato aggiunto al terreno e un volume uguale di tampone fosfato. Dopo aver rimosso le provette di teflon dall'agitatore a 25 gradi C, centrifugare le provette per 10 minuti a 2, 500 giri/min.

Quindi, nella cappa aspirante con le luci spente, decantare il surnatante dal tubo di teflon in uno dei tubi lunghi. La separazione di fase deve essere visibile nel tubo di vetro. Lo strato inferiore contiene il solvente organico, principalmente il cloroformio, e i lipidi.

Questa estrazione viene ripetuta. Versare il surnatante nel secondo tubo preparato in precedenza. Ora hai estratto fisicamente i lipidi dal terreno due volte.

Per la maggior parte dei terreni, questo è adeguato. Tappare saldamente tutte le provette di classe lunga con tappi rivestiti in teflon e capovolgere 10 volte per mescolare. Fasi separate per gravità durante la notte.

Lasciare riposare i campioni indisturbati per una notte per completare la separazione delle due fasi. Per fare ciò, conservare i campioni in un armadio buio o coperti con un foglio di alluminio a temperatura ambiente. Va bene lasciare che gli estratti si separino durante il fine settimana.

Secondo giorno, isolamento dei lipidi. Il secondo giorno, lo strato acquoso viene aspirato e i lipidi concentrati rimuovendo il solvente in un sistema di evaporazione sottovuoto. I campioni possono anche essere essiccati mettendoli in un bagno d'acqua o di sabbia e applicando un leggero getto di azoto.

Il liquido nelle provette dovrebbe ora essere ben separato e in gran parte limpido. In caso contrario, o se l'interfaccia tra i due strati è particolarmente spessa, lasciare che la separazione continui per un altro giorno. Installare un aspiratore a vuoto nella cappa.

Si tratta di un pallone a braccio laterale collegato a una pompa a vuoto con un tubo Tygon a foglia e una pipetta per pascolo. Con la pompa in funzione, utilizzare la pipetta per aspirare la fase acquosa nel pallone. Aspirare lo strato superiore e l'interfaccia.

Questo sarà a circa 2/3 del percorso di discesa. Fallo con i due o tre set di tubi di vetro. Lo strato superiore può contenere alcune particelle di terreno.

Rimuovili se possibile. Unire l'estratto della seconda e/o terza serie di provette con quello delle prime due decantando accuratamente. Cercare di escludere dal versare qualsiasi materiale solido e risciacquare le pareti del tubo ruotandolo.

Utilizzare una pipetta pulita per ogni campione e ripetere questo processo per i campioni rimanenti. Una volta che gli estratti di cloroformio sono stati combinati e sono rimasti seduti per alcuni minuti, ispezionare la superficie del liquido. Spesso si forma un sottile strato di acqua residua.

Se questo è presente, aspirare prima di procedere. L'acqua residua può attaccare i doppi legami degli acidi grassi, ma una quantità molto piccola dovrebbe co-evaporare con i solventi quando i campioni vengono asciugati. Asciugare tutti i campioni utilizzando l'apparecchio di evaporazione sottovuoto.

Tappare bene le provette e conservarle in congelatore a 80 gradi C.Giorno tre, saponificazione e metilazione. Per prima cosa, accendi i bagni d'acqua. Controllare il livello dell'acqua e impostare il bagno uno a 95 gradi C e il bagno due a 80 gradi C.Utilizzando una ripipetta, aggiungere un millilitro del reagente di saponificazione, Reagente 1, ai lipidi essiccati.

Tappare bene, agitare brevemente e posizionare su una griglia. Una volta sceso con questo passaggio, posizionare la rastrelliera di provette nel bagnomaria a 95 gradi C e attendere cinque minuti. Rimuovere il rack di tubi dalla vasca e controllare che i tubi non presentino perdite.

Ciò sarà indicato da bolle che salgono nel tubo come una schiuma. Riavvitare o sostituire i tappi dei tubi che perdono. Continuare a riscaldare i tubi nel bagnomaria per altri 10 minuti.

Ridurre la temperatura impostata sul bagnomaria a 80 gradi C e continuare l'incubazione per altri 15 minuti. Togliere i tubi e raffreddare mettendo la griglia in una pentola di acqua corrente. Non usare acqua ghiacciata.

Una volta che i campioni si sono raffreddati, aggiungere due millilitri del reagente di metilazione, Reagente 2, a ciascun campione. Ancora una volta, chiudi bene e agita per cinque-10 secondi. I sali granulari possono diventare visibili come precipitante nella soluzione, cosa che a volte accade a causa dell'eccesso di reagenti.

Posizionare il rack nel bagnomaria a 80 gradi C e incubare per 10 minuti. Togliete la griglia di tubi dal bagnomaria e mettetela in una pentola di acqua del rubinetto per farla raffreddare. Agitare la griglia per accelerare il processo di raffreddamento.

Utilizzando una ripipetta, aggiungere 1,25 millilitri di esano e metil terziario butil etere, reagente 3, a ciascuna provetta per estrarre la fase. Sigillare bene i tappi e mettere i tubi su uno shaker per 10 minuti. Dopo l'agitazione, lasciare riposare il rack di provette per 10 minuti affinché le fasi si separino.

Trasferire la fase organica, che ora è lo strato superiore, in una provetta di vetro corta utilizzando una pipetta da pascolo. È meglio recuperare la maggior parte del liquido. Piccolissime quantità di fase acquosa non compromettono l'estrazione.

Ripetere l'estrazione in fase acquosa aggiungendo il reagente 3, agitando, lasciando che le fasi si separino e trasferendo la fase superiore. A seconda delle condizioni della fase inferiore, è possibile ripetere l'operazione ancora una volta per un totale di tre trasferimenti. Aggiungere 3 millilitri di detergente base, Reagente 4, che è una soluzione diluita di idrossido di sodio, agli estratti nei tubi corti.

Tappare bene le provette e agitare per 20-30 secondi, quindi centrifugare per tre minuti a 2.000 giri/min. Una volta centrifugata, utilizzando una pipetta da pascolo pulita, aspirare la fase organica superiore e trasferire in una fiala ambrata da quattro millilitri. Fare molta attenzione a non aspirare nessuna delle fasi acquose.

Il passo successivo consiste nell'evaporare il solvente fino a secchezza in un apparecchio di evaporazione sottovuoto. Quarto giorno, preparazione degli estratti per l'analisi GC. Utilizzando il pipettatore, aggiungere 100 microlitri di Reagente 3 a ciascuna delle fiale da 4 millilitri contenenti la fase essiccata.

Agitare il campione e lasciarlo riposare per 10 minuti. Utilizzando il secondo pipettatore, trasferire con cura i FAME sospesi in una fiala GC. Aggiungere un'altra aliquota di solvente alla fiala da quattro millilitri e agitare brevemente.

Arrotolare il flaconcino per assicurarsi che i FAME residui sulle pareti del flaconcino siano disciolti. Utilizzando nuovamente il secondo pipettatore, trasferire il solvente nella fiala GC. Completare il trasferimento aggiungendo una terza aliquota di solvente al flaconcino, agitando e trasferendo nel flaconcino GC.

Tappare il flaconcino di GC e conservare nel congelatore. Conservare le fiale di GC sigillate nel congelatore prima dell'analisi. Analisi GC.

Per utilizzare questo sistema, l'analisi deve essere effettuata utilizzando una colonna GC specifica. Il gascromatografo è dotato di un ingresso splitless diviso dotato di un rivestimento di ingresso in vetro ID da quattro millimetri con un tappo in lana di vetro disattivato. L'ingresso è impostato a 250 gradi C e funziona in modalità a pressione costante.

Il gas di trasporto è l'idrogeno. L'azoto e l'aria sono necessari come gas di supporto del rivelatore. Viene utilizzata una colonna Agilent Ultra 2.

La colonna è lunga 25 metri con un diametro interno di 2 millimetri e uno spessore del film in fase stazionaria di 33 micrometri. La fase stazionaria in questa colonna è 5% fenile, 95% metilpolisilossano, nota anche come colonna di tipo DB-5. Per analizzare gli estratti lipidici, viene iniettata un'aliquota di due microlitri a un rapporto di divisione 100:1 con la temperatura del forno a 170 gradi C.Post l'iniezione, il forno è programmato per aumentare a cinque gradi al minuto fino a 300 gradi C e poi mantenere per 12 minuti.

Vengono effettuate una serie di iniezioni dello standard MIDI e i risultati vengono utilizzati per effettuare regolazioni secondo le istruzioni nel manuale MIDI. Una volta calibrato in questo modo, il sistema potrebbe aver bisogno di piccole regolazioni occasionali, ma in genere dovrebbe ottenere buoni risultati utilizzando questi parametri. Il sistema MIDI produce un report per ogni campione contenente una tabella con una riga per ogni picco realizzato.

Il software riporta il tempo di ritenzione del picco, l'area del picco, l'identificazione del picco, insieme all'ECL o lunghezza stimata della catena, un parametro utilizzato per l'identificazione del picco, e un fattore di risposta, un parametro utilizzato per normalizzare le variazioni e la risposta del rivelatore rispetto al tempo di ritenzione. L'ECL esprime dove, tra una serie di FAME a catena lineare, ogni FAME sconosciuto eluisce. Quindi, ad esempio, se il tempo di ritenzione di un'incognita eluisce a metà strada tra quelli di una catena di carbonio 12 e 13, l'ECL viene riportato come una catena di carbonio 12,5.

Il software confronta l'ECL di ogni picco con quelli dei FAME in un database e, dove si verificano corrispondenze, assegna il nome corrispondente all'ignoto. Per i casi in cui due FAME nel database hanno ECL molto vicini, il software riporta entrambi i nomi elencando per primi il più vicino. Le tabelle di dati dei report possono essere raccolte in un foglio di calcolo o in un database.

Dopo l'aggiustamento per il fattore di risposta, le aree di picco possono quindi essere confrontate con l'area di picco di uno standard esterno o interno per arrivare a una concentrazione dell'estratto. Dividendo per la massa di suolo estratta, i dati possono essere espressi come massa di FAME per grammo di suolo o, utilizzando anche il peso molecolare di ciascun FAME, come nanomoli per grammo di suolo. I FAME dei biomarcatori possono quindi essere sommati per produrre biomassa di gilde microbiche e queste gilde possono essere ulteriormente analizzate.

Ad esempio, qui vediamo praterie non fertilizzate con più biomassa FAME rispetto alle praterie fertilizzate. Entrambi hanno più biomassa dei vicini campi di mais. Inoltre, i FAME sono associati a particolari gruppi funzionali come funghi o batteri.

Queste associazioni sono specifiche dell'ecosistema, quindi è importante non generalizzarle eccessivamente. Questo tipo di analisi mostra se alcuni gruppi sono più abbondanti in determinati ambienti. Qui, i funghi sono più abbondanti nella prateria non fertilizzata che nel campo di mais.

Infine, un altro modo per osservare la composizione complessiva della comunità microbica è quello di confrontare l'abbondanza relativa di tutti i FAME contemporaneamente utilizzando metodi di ordinazione come la scala multidimensionale non metrica, NMDS, o l'analisi dei componenti principali, PCA. In un'ordinazione, le comunità microbiche che sono più simili saranno più vicine tra loro. Quindi, dai nostri dati di esempio, il mais e la prateria non fertilizzata sono molto distanti, mentre alcuni campioni di prateria fertilizzata hanno comunità microbiche che assomigliano a quelle del mais e altri assomigliano alla prateria non fertilizzata.

Le comunità microbiche sono spesso molto variabili anche all'interno di un ambiente, quindi non sempre si separano in modo netto. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione del processo mediante il quale i biomarcatori lipidici dalle membrane cellulari dei microrganismi vengono estratti dal suolo. L'estrazione degli acidi grassi fosfolipidi è un modo efficace, rapido ed economico per valutare le gilde microbiche e la biomassa microbica totale attraverso l'identificazione di biomarcatori microbici unici.