Name: Un semplice metodo di estrazione frazionata per lanalisi completa dei metaboliti, dei lipidi e delle proteine da un singolo campione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: Scopri un metodo di estrazione frazionata con metil-terz-butil etere per analizzare lipidi, metaboliti e proteine da un singolo campione di tessuto Arabidopsis. Questa tecnica supporta studi multiomici in biologia dei sistemi.

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MS è supportato da una borsa di studio completa del programma GERLS-DAAD. Vorremmo ringraziare il dottor Andrew Wiszniewski per la lettura delle prove e commentare il manoscritto. Siamo molto grati a tutti i membri del laboratorio Giavalisco dell&#39;Istituto Max-Planck di Fisiologia delle Piante Molecolari, Golm, Germania per il loro aiuto.

Attenzione : Metanolo (MeOH) e metil tert- butil etere (MTBE), utilizzati durante l&#39;estrazione, sono infiammabili e possono avere irritazioni respiratorie, oculari o cutanee in caso di esposizione e / o contatto prolungato. Si prega di trattare con cura solo in un cappuccio e utilizzare le procedure di sicurezza appropriate durante l&#39;estrazione (cappotto di laboratorio, occhiali di protezione, guanti, ecc. ). L&#39;azoto liquido e il ghiaccio secco, utilizzati in varie fasi di questo protocollo, possono causare gravi ustioni da contatto prolungato della pelle. Si prega di trattare con cura con guanti e occhiali protettivi. Gli utenti possono utilizzare diversi prodotti chimici, reagenti o standard interni per l&#39;analisi del campione, alcuni dei quali possono essere tossici. Si prega di esaminare le schede tecniche di sicurezza chimiche per tutti i materiali utilizzati. 1. Raccolta e raccolta di campioni biologici <ol><li> Preparare i tubi di raccolta etichettati. NOTA: Qui raccogliere campioni biologici in etichetta, 2 mL, rotondo, sicuro, locK tubi di microcentrifuga contenenti due diametri di 5 mm, sfere metalliche per l&#39;omogeneizzatore tissutale. </li><li> Preparare un dewar di azoto liquido riempito. </li><li> Raccogliere il campione biologico e bloccare il tessuto in azoto liquido. Eseguire questo passo nel più breve tempo possibile in pochi secondi per evitare le alterazioni metaboliche indotte da ferite. Nota: Per scopi dimostrativi, utilizzare foglie di rosette da Arabidopsis thaliana (Col-0) di 30 giorni di selvaggina, coltivate nel terreno in condizioni di lunga giornata. </li><li> Conservare i campioni raccolti su ghiaccio secco per interruzioni brevi o conservarle a -80 ° C per periodi più lunghi. </li></ol> 2. Rettifica e disturbi del tessuto <ol><li> Pre-raffreddare i contenitori del tubo dell&#39;omogenizzatore tissutale in azoto liquido per almeno 10 min. Se non è disponibile un omogeneizzatore di tessuti, utilizzare malte e pestelli puliti e pre-raffreddati. </li><li> Prendete i campioni dall&#39;azoto liquido, dal ghiaccio secco o dal congelatore -80 ° C e posizionateli nel pre-raffreddatoPorta tubi. </li><li> Posizionare rapidamente i porta tubi nell&#39;indoganizzatore tissutale. </li><li> Macinare il materiale biologico in una polvere fine e omogenea. Utilizzare 20 Hz per 1 min per le foglie. Nota; Il tempo e la velocità di omogeneizzazione possono essere variati a seconda del tessuto, assicurarsi che il campione sia omogeneizzato in una polvere fine e che questa polvere sia mantenuta congelata ad ogni passo dell&#39;omogeneizzazione. </li><li> Prendete i campioni biologici dai porta tubi e tenerli congelati fino all&#39;estrazione. </li></ol> 3. Pesatura di tessuti <ol><li> Utilizzare un equilibrio analitico con precisione sufficiente per gli importi richiesti del campione. </li><li> Preparare un tubo di microcentrifuga sicuro a bloccaggio a 2 millimetri di etichetta. </li><li> Pre-raffreddare i tubi e spatole in azoto liquido. </li><li> Aliquota la quantità richiesta di polvere di tessuto nel tubo di microcentrifuga da 2 mL sicuro. Attenzione: Evitate eventuali sbrinamenti del materiale vegetale riducendo al minimo il tempo necessario a wI campioni. </li><li> Riportare i campioni aliquotati immediatamente dopo la pesatura in azoto liquido. </li><li> Registrare per ogni campione il peso esatto. Utilizzare 10-50 mg ± 10% per la maggior parte dei tessuti vegetali. </li><li> Conservare i campioni aliquotati a -80 ° C fino all&#39;estrazione. </li></ol> 4. Configurazione del reagente <ol><li> Utilizzare una miscela di estrazione di metil tert- butil etere (MTBE) / metanolo (MeOH). <ol><li> Per la preparazione di 100 mL di solvente di estrazione, aggiungere 75 mL di MTBE a 25 mL di MeOH per ottenere una miscela di MTBE: MeOH (3: 1, vol / vol). </li><li> Aggiungere standard interni per la normalizzazione post analisi secondo le esigenze analitiche. Tipicamente si aggiunge 50 μl di 1,2-diheptadecanoil- sn -glicero-3-foscololina (1 mg / ml in cloroformio) come standard interno per l&#39;analisi lipidica a base UPLC-MS, aggiungendo 50 μl di 13 C sorbitolo 1 mg / mL in acqua) come standard interni per l&#39;analisi del primario GC-MSmetaboliti. Gli standard interni per l&#39;analisi del metabolita UPLC-MS sono 50 μL di corticosterone (1 mg / ml in metanolo) e 25 μL di ampicillina (1 mg / ml in metanolo). </li><li> Trasferire il solvente in una bottiglia di vetro pulita che è stata lavata con miscela MTBE: MeOH. </li><li> Conservare la miscela di estrazione fino a 1 settimana a 4 ° C. NOTA: Non conservare la miscela di estrazione per periodi più lunghi per mantenere risultati riproducibili. </li></ol></li><li> Per indurre la separazione di fase, utilizzare acqua (H 2 O) / metanolo (MeOH). <ol><li> Per la preparazione di 100 ml di H 2 O: MeOH aggiungere 75 ml di H 2 O a 25 ml di MeOH per ottenere H 2 O: MeOH (3: 1, vol / vol). </li><li> Trasferire il solvente in una bottiglia di vetro pulita che è stata lavata con miscela di H 2 O: MeOH. Questo solvente può essere conservato per diverse settimane a temperatura ambiente. </li></ol></li></ol> 5. Estrazione dei campioni <ol><li> Pre-raffreddare l&#39;estrazione m(MTBE: MeOH, 3: 1, vol / vol) a -20 ° C utilizzando un sistema di raffreddamento liquido o un congelatore a -20 ° C. </li><li> Togliere i campioni aliquotati uno ad uno e aggiungere 1 ml della miscela di estrazione pre-raffreddata ad ogni tubo di campione. Attenzione: eseguire rapidamente questo passo a causa della bassa viscosità di MTBE. </li><li> Mescolare immediatamente su un miscelatore vortex finché il tessuto è ben omogeneizzato all&#39;interno della miscela di estrazione. NOTA: Questo passo è molto importante, poiché è necessario precipitare le proteine ​​e inattivare le loro attività enzimatiche. </li><li> Incubare tutti i campioni su un agitatore orbitale a 100 giri / min per 45 minuti a 4 ° C. </li><li> Sonicare i campioni per 15 minuti in un bagno di sonicazione raffreddato al ghiaccio. </li></ol> 6. Frazionamento per separazione di fase <ol><li> Aggiungere a ciascun tubo di campione 650 μl di H 2 O: MeOH (3: 1, vol / vol). </li><li> Mescolare bene vortexando per 1 minuto. </li><li> Centrifugare i campioni ad una velocità di 20.000 x g per 5 minuti a 4 ° C. NOTA: Dopo questo passaggio, ci sono due fasi liquide immiscibili con un solido pellet nella parte inferiore del tubo. Attenzione: Maneggiare con cura i tubi per evitare di mescolare le due fasi liquide e evitare di interrompere il pellet precipitato. </li></ol> 7. Aliquotazione delle frazioni polari e idrofobiche <ol><li> Trasferire 500 μL del solvente dalla fase superiore contenente lipidi in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml etichettato. NOTA: I campioni lipidici aliquotati possono essere direttamente concentrati per l&#39;analisi UPLC-MS immediata (fase 8.1) o conservati per diverse settimane a -80 ° C. </li><li> Una volta rimossi i 500 μL dal campione, rimuovere la restante fase lipidica usando una pipetta da 200 μL. </li><li> Trasferire 400 μL del solvente dalla fase inferiore (polarità e semipolarità) in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml etichettato. I campioni polari aliquotati possono essere direttamente concentrati per l&#39;immediata analisi UPLC-MS (fase 8.2) o memorizzatiR settimane a -80 ° C. </li><li> Prendere un&#39;aliquota aggiuntiva di 200 μL per eseguire ulteriori analisi, ad esempio l&#39;analisi del metabolita a base di gas cromatografica come descritto in modo preciso 16 . </li><li> Rimuovere il resto della fase acquosa pipettando fuori il volume in eccesso. </li><li> Lavare la proteina ottenuta, l&#39;amido, il pellet di parete cellulare con 500 μl di metanolo accuratamente vortexandolo per 1 minuto. </li><li> Centrifugare i campioni ad una velocità di 10.000 x g per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Eseguire l&#39;estrazione e la digestione proteica (fase 11) o l&#39;analisi della parete di amido / cellula come descritto in precedenza 16 . NOTA: Se non vengono utilizzati immediatamente, questi pellet possono essere conservati per diverse settimane a -80 ° C. </li></ol> 8. Concentrazione e conservazione delle frazioni <ol><li> Evaporare il solvente dai campioni lipidici (dal punto 7.1) in un concentratore a vuoto senza riscaldamento (per 1-2 ore) o preferibilmente utilizzare un nitrOgen flusso evaporatore per evitare modificazioni ossidative dei lipidi. NOTA: I campioni seccati devono essere analizzati immediatamente. Per la conservazione, lasciare campioni in soluzione MTBE, idealmente in flaconi di vetro (passo 7.1). </li><li> Evaporare il solvente dai campioni acquosi (dal punto 7.3 o da 7.4) per notte in un concentratore di vuoto senza riscaldamento. NOTA: i campioni secchi possono essere conservati per diverse settimane a -80 ° C prima dell&#39;analisi. </li></ol> 9. Analisi dei lipidi usando UPLC-MS 24 <ol><li> Riposizionare le frazioni lipidiche secche (dal punto 8.1) in 400 μl di acetonitrile: 2-propanolo (7: 3, vol / vol). </li><li> Portare liquido sufficiente a flaconcini di vetro e tappo stretto. </li><li> Mettere le fiale di vetro in un autosampler raffreddato (4 ° C). </li><li> Iniettare 2 μL per campione e separare i lipidi su una colonna Reverse Phase (RP) C 8 mantenuta a 60 ° C utilizzando un sistema UPLC in esecuzione a una portata di 400 μL / min. </li><li> Usa il cellulareFasi descritte nella tabella 1 per la separazione cromatografica. </li><li> Acquisisci gli spettri di massa in modalità di ionizzazione positiva e negativa usando uno strumento MS appropriato che copre la gamma di massa tra 150 e 1.500 m / z. </li></ol> 10. Analisi di metadati polari e semi-polari usando UPLC-MS 25 . <ol><li> Riposizionare la fase polare (dal punto 8.2) in 200 μl di metanolo UPLC: acqua (1: 1, vol / vol). </li><li> Portare liquido sufficiente a flaconcini di vetro e tappo stretto. </li><li> Mettere le fiale di vetro in un autosampler raffreddato (4 ° C). </li><li> Iniettare 2 μL da ogni campione e separare i metaboliti su una colonna RP C 18 mantenuta a 40 ° C utilizzando un sistema UPLC in esecuzione a una portata di 400 μL / min. </li><li> Utilizzare le fasi mobili per la separazione cromatografica con i parametri indicati nella tabella 2 . </li><li> Acquisiti spettri di massa di scansione completa in modalità di ionizzazione positiva e negativaUno spettrometro di massa adatto che copre una fascia di massa compresa tra 50 e 1.500 m / z. </li></ol> 11. Estrazione proteica, digestione e analisi 16 <ol><li> Riassemblare la pellicola lavata della proteina / amido / cellulare (dal punto 7.8) in 200 μl del tampone di estrazione proteica di scelta. Nota: Usiamo buffer urea / tiourea (5 M urea, 2 mM tiourea, 15 mM DTT, 2% CHAPS e proteasi e inibitori della fosfatasi) 27 . </li><li> Sonicare i campioni per 10 minuti in un bagno sonico raffreddato al ghiaccio. </li><li> Incubare i campioni per 30 minuti su un agitatore orbitale (100 rpm) a temperatura ambiente. </li><li> Centrifugare le proteine ​​disciolte a 10.000 x g per 5 min. </li><li> Raccogliere il surnatante proteico in un nuovo tubo. </li><li> Determinare la concentrazione proteica dal supernatante raccolto 28 . </li><li> Digest 50 μg di proteina in soluzione con un protocollo di scelta. Tipicamente, utilizzare il mix di mix Trypsin / Lys-CIl manuale di istruzioni. </li><li> Dopo la digestione, eseguire la discioltazione dei peptidi prima della spettrometria di massa usando le punte C 18 e eluire i peptidi digeriti 29 . </li><li> Concentrare i campioni in prossimità di secchezza in un concentratore di vuoto senza riscaldamento. </li><li> Riassemblare i campioni in un appropriato tampone di carico (es. 5% acetonitrile, 0,5% acido formico) e analizzare le miscele peptide mediante LC-MS / MS utilizzando uno spettrometro di massa ad alta risoluzione collegato ad un sistema nano LC. NOTA: nell&#39;esempio di set di dati proteomici presentati in questo protocollo, abbiamo utilizzato un gradiente come descritto nella tabella 3 . </li><li> Impostare lo spettrometro di massa utilizzando una strategia di top 15, in cui una scansione completa (FS) è stata seguita da fino a 15 scansioni MS / MS dipendenti dai dati, ai seguenti parametri: Il FS era nella gamma di massa 200-2000 m / z Una risoluzione di 70.000 con un valore target di 3x10 6 ioni. Ottieni le scansioni MS / MS dipendenti dai dati da un livello superioreLa dissociazione collettiva (HCD). Impostare i valori di destinazione per MS / MS a 1e 5 ioni, con un tempo di riempimento ioni massimo massimo di 50 ms, una finestra di isolamento di 4,0 m / z, energia di collisione normalizzata (NCE) del 30% e un rapporto di riempimento dell&#39;1%. Misura gli ioni MS / MS ad una risoluzione 17.500 e l&#39;esclusione dinamica è stata impostata a 60 s. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno niente da rivelare

In questo articolo descriviamo e illustriamo un semplice e estremamente applicabile protocollo di estrazione per una completa analisi lipidomica, metabolomica e proteomica da un singolo campione di foglie da 50 mg. Il metodo è stato precedentemente utilizzato in diversi studi, che sono stati pubblicati in diversi articoli 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 E dimostrato, oltre al suo diretto avanzamentoFlusso di lavoro e alta applicabilità per essere robusti e riproducibili. Le applicazioni qui fornite mostrano alcuni metodi di routine per lo screening iniziale di un campione biologico complesso. Questi set di dati metabolomici e lipidomi su larga scala illustrati possono fornire informazioni complete sulle variazioni ampie o specifiche del metabolismo del sistema biologico analizzato, mentre i dati ottenuti dall&#39;analisi delle proteine ​​forniscono approfondimenti sulle quantità (abbondanti) e qualitative (modifiche ) Cambiamenti di enzimi, proteine ​​strutturali o fattori di trascrizione (TFs) che controllano funzioni cellulari e macchinari. Di conseguenza, i dati omic integrativi hanno il potenziale per rivelare le informazioni iniziali su possibili cambiamenti indotti da perturbazioni genetiche o biotiche e / o abiotiche di un sistema biologico, illustrando i cambiamenti molecolari di molecole diverse associate a percorsi metabolici specifici o processi cellulari. Ovviamente, A lungo termine, è abbastanza essenziale per un&#39;analisi della biologia dei sistemi di successo per massimizzare il numero di entità molecolari analizzate e annotate, permettendo il più possibile il monitoraggio delle funzioni e delle attività cellulari. A tal fine, le frazioni ottenute possono essere applicate in aggiunta a metodi analitici diversi, mirando a ulteriori composti o classi composti ( Figura 4 ). Detto questo, va ricordato che la strategia di analisi globale dei dati ottenuti può essere seguita da due diverse strategie: da un lato abbiamo sottolineato la spiegazione delle funzioni cellulari mediante la quantificazione di composti noti. D&#39;altra parte, molti dei metaboliti misurati ei lipidi non sono ancora noti o annotati. Queste, tuttavia, le misurazioni composte non annotate contengono anche molte informazioni significative, che possono essere utilizzate con metodi statistici per la classificazione o discriminazione bTra gruppi o trattamenti 20 , 21 , 22 . Tuttavia, questi composti sconosciuti, in particolare quelli rilevanti per la classificazione del gruppo o che servono come biomarcatori, devono essere identificati. Questo processo di identificazione è purtroppo abbastanza noioso e non può essere raggiunto senza ulteriori misurazioni analitiche o strategie 38 . Come si può vedere dalla figura 4 , il numero di composti non annotati è abbastanza elevato (in realtà la stragrande maggioranza). Tuttavia, come sopra ricordato, questi picchi cromatografici possono essere gestiti all&#39;interno dell&#39;analisi dei dati e quindi le entità significativamente interessate possono essere chiarite e sottoposte a ulteriori strategie di identificazione. In sintesi, possiamo concludere che il protocollo qui introdotto offre diversi vantaggi per la biologia dei sistemi sperimentali e per applicazioni statistiche classichezioni. In primo luogo, poiché tutte le frazioni vengono estratte da un singolo campione, la variazione tra i diversi set di dati sperimentali (lipidi, metaboliti, proteine) è significativamente ridotta poiché ogni set di dati è derivato dalla stessa aliquota del campione. Ciò porta chiaramente alla maggiore comparabilità dei risultati ottenuti. In secondo luogo, il metodo è facilmente scalabile e lo rende quindi altamente compatibile con quantità di campioni da piccole a grandi dimensioni. Utilizziamo regolarmente 10-100 mg di campioni di tessuti, ma sono stati eseguiti anche studi lipidomiali su un numero di soli 20 semi di Arabidopsis 31 . Soprattutto la compatibilità con piccole quantità di campioni rende questo metodo applicabile se sono disponibili quantità limitate di tessuti o campioni biologici. Tuttavia, anche se è sufficiente un materiale sufficiente per il campione, il metodo qui presentato offre il vantaggio di utilizzare questi campioni in un numero maggiore di replicazioni sperimentali anziché uLi canta per diverse procedure di estrazione. Ciò consente un&#39;analisi statistica migliore e raffinata dei dati statistici. In terzo luogo, dal momento che il metodo si basa su una frazionamento liquido-liquido di molecole polari e non polari, esso fornisce, in contrasto con semplici metodi di estrazione di una fase ( es. Estrazioni di metanolo), un significativo processo di decompletamento nella procedura. Questo decompletamento efficiente del campione porta ad una purificazione parziale delle singole frazioni a causa della separazione delle molecole interferenti chimicamente l&#39;una dall&#39;altra. Di conseguenza, il processo di partizione chimica non solo fornisce un vantaggio pratico per l&#39;aliquota sistematica dei campioni estratti in classi chimiche diverse ma migliora anche le singole misurazioni analitiche, in quanto rimuove i composti contaminanti dalle diverse frazioni. Chiaramente, possiamo notare che soprattutto i lipidi, che sono partizionati alla fase organica e che di solito influenzano negativamente ilL&#39;analisi cromatografica dei composti polari sarà quasi assente dalla frazione polare. Lo stesso vale per l&#39;analisi dei lipidi idrofobici, che saranno esauriti dai composti polari. Oltre alla purificazione di composti polari e non polari l&#39;uno dall&#39;altro, esauriremo e raccogliamo proteine ​​e altre macro-molecole dal campione, che non solo fornisce una frazione separata che può essere utilizzata per l&#39;analisi della proteina, dell&#39;amido e della parete cellulare 16 ma anche Porta ad un campione più pulito all&#39;interno delle singole frazioni. Ciò è particolarmente rilevante, poiché è noto che la presenza di grandi macromolecole porta a danni oa vita di almeno la durata delle colonne analitiche. Ultimo ma non meno importante, il metodo di estrazione MTBE descritto, che si basa sul solvente di sostituzione cloroformio meno rischioso 15 , è già stato dimostrato da diversi studi del nostro gruppo, per essere ampiamente applPer i campioni biologici diversi dalle piante 16 , le alghe 17 , 18 , le mosche 19, ma anche diversi tessuti, organi o cellule di mammiferi 20 , 21 , 22 .

La biologia dei sistemi, emersa nella metà del secolo scorso 1 ed è stata avanzata dall&#39;analisi su larga scala di set di dati genomici e trascrizionali 2 , 3 , si è sviluppata in un approccio nuovo e indispensabile per l&#39;analisi di sistemi biologici complessi 4 , 5 . L&#39;obiettivo principale della biologia dei sistemi è quello di decifrare le interazioni di componenti e le dipendenze nei sistemi biologici e di colmare il legame tra i genotipi, la loro realizzazione, le trasformazioni molecolari ei fenotipi che ne derivano. Di conseguenza, l&#39;integrazione di set di dati completi, prodotti dai vari approcci analitici su larga scala, quali la genomica, la trascrizione, la metabolomica, la lipidomica e la proteomica e la loro analisi computazionale, è diventata un prerequisito per la descrizione e la comprensione di sistemi biologici complessi. Bas<html> Sull&#39;enorme diversità chimica e la complessità dei componenti biologici in qualsiasi sistema vivente, la produzione di set di dati &quot;omici&quot; grandi e completi si basa fortemente sulla qualità del metodo di estrazione applicato 9 . Oltre alla qualità del metodo di estrazione, l&#39;economia del metodo è importante; Ciò significa che sarebbe auspicabile ottenere tutte le informazioni molecolari dal minor numero possibile di campioni. Spesso gli importi del campione possono limitare e pertanto è estremamente auspicabile far uso di un metodo di estrazione che può derivare tante classi molecolari da una singola estrazione di un determinato campione. Ciò significa che, invece di utilizzare diversi metodi di estrazione specializzati per l&#39;estrazione di diverse classi composto da diverse aliquote di campione dello stesso campione, viene utilizzato un metodo di estrazione sequenziale che fraziona i costituenti molecolari di una singola aliquota in frazioni molecolari differenti. Il metodo comune impiegato per questi metodi di estrazione frazionati si basa sul metodo di estrazione lipidica a due fasi di Folch et al. Sviluppato nel 195710. Questo metodo si basa su una suddivisione di cloroformio: metanolo / acqua di metaboliti polari e idrofobici ed è stata Con l&#39;evoluzione della biologia dei sistemi multi-omici, il metodo Folch è stato ulteriormente gradualmente migliorato usandolo per il partizionamento del campione di proteine ​​e metaboliti polari e lipidi per Le metabolomiche a base di gas e liquido e le lipidomiche dei composti polari e idrofobici, oltre alla proteomica a base di cromatografia a liquido 11 , 12 , 13 , 14. Purtroppo, tutti questi metodi si basano su un metodo di estrazione a base di cloroformi che non solo Porta al fo non desideratoRmation del pellet proteico come interfaase tra la polare e la fase lipidica, ma che è anche un solvente indesiderato da una prospettiva chimica verde 15 , 16 . Tuttavia, il solvente metil tert- butil etere (MTBE) supera entrambi questi problemi e rappresenta un adeguato sostituto per il cloroformio. Sulla base di questi requisiti, abbiamo deciso di stabilire un metodo di estrazione MTBE: metanolo: a base di acqua, che soddisfa tutte le specifiche di cui sopra e quindi funge da punto di partenza ideale per un&#39;analisi completa multi-omics 16 . Questo protocollo guida l&#39;utente passo-passo attraverso il flusso di lavoro semplice, rapido e riproducibile della preparazione del campione, compresa la risoluzione dei problemi comunemente osservati. Inoltre, illustreremo brevemente dati analitici esemplari da cromatografia liquida a ultrasuoni a spettrometria di massa (UPLC-MS) -basI lipidomi, la metabolomica e la proteomica da campioni di tessuti vegetali. Anche se gli esempi sono stati derivati ​​da 50 mg di un campione di tessuti a foglia Arabidopsis thaliana , questo protocollo è stato utilizzato per diversi altri campioni e tessuti biologici, tra cui le alghe 17 , 18 , gli insetti 19 e le cellule dei mammiferi, gli organi e i tessuti 20 , 21 , 22 . L&#39;ambito del protocollo di estrazione presentato è quello di fornire una descrizione chiara e dettagliata del trattamento dei campioni di pre-estrazione e della stessa procedura di estrazione. Anche se forniamo tre brevi esempi di applicazione analitica, informazioni dettagliate sul trattamento dei dati pre- e post-analitico possono essere ottenute dalle nostre precedenti pubblicazioni 16 , 23 , 24 , <supClass = &quot;xref&quot;&gt; 25 , 26 .

<table><tbody><tr><td><forte>Reagenti e standard</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9393-5G</td><td>Standard interno per metaboliti</td></tr><tr><td>Corticosterone&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>27840-500MG</td><td>Standard interno per metaboliti, grado HPLC</td></tr><tr><td>13C Sorbitolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>605514</td><td>Standard interno per metaboliti, ISOTEC&reg; &nbsp; Isotopi stabili</td></tr><tr><td>1,2-dieptadecanoyl-sn-glicero-3-fosfocolina (17:0 PC)&nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850360P</td><td>Standard interno per lipidi</td></tr><tr><td>Metanolo (MeOH)&nbsp;</td><td>Biosolve Chemicals</td><td>13684102</td><td>acqua di grado ULC-MS</td></tr><tr><td></td><td>Biosolve Chemicals</td><td>23214102</td> etere metil-terz-butilico <td>di grado ULC-MS</td></tr><tr><td>(MTBE)&nbsp;</td><td>Biosolve Chemicals</td><td>13890602</td> miscela di tripsina/Lys-C <td>di grado HPLC</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Promega</td><td>V5072</td><td>Digestione enzimatica delle proteine</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balance&nbsp;</td><td>Sartorius Corporation&nbsp;</td><td>14 557 572</td><td></td></tr><tr><td>Mulino miscelatore per la macinazione dei tessuti&nbsp;</td><td>Retsch, Vibromulino MM 300</td><td>20.746.0001</td><td></td></tr><tr><td>Mortaio e pestello&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z247464-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Miscelatore a vortice&nbsp;</td><td>Vortex-Genie 2, Modello G560</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Concentratore sottovuoto</td><td>Velocità di scansione Maxi Vac Alpha Evaporatori</td><td>7.008.500.002</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga Safe-lock da 2 mL&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>30120094</td><td>Utilizzato per l'estrazione di campioni</td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga da 1,5 mL con blocco sicuro&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td>utilizzato per l'agitatore di frazioni</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf Thermomixer 5436</td><td>2050-100-05</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator&nbsp;</td><td>USC 300&nbsp;TH</td><td>142-0084</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuga refrigerata</td><td>Eppendorf, modello 5427R</td><td>22620701</td><td></td></tr><tr><td>sistema UPLC&nbsp;</td><td>Sistema Waters Acquity UPLC (Waters, Machester, Regno Unito)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Sistema MS&nbsp;</td><td>Exactive, tipo Orbitrap, MS (Exactive, Thermo-Fisher, Brema, Germania).</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colonna C8 ibrida etilica a ponte (BEH) a fase inversa (RP) (100 mm & volte; 2,1 mm contenente 1,7 &mu; Acque</td><td>, Machester, Regno Unito</td><td>186002878</td><td>Analisi dei lipidi</td></tr><tr><td>RP High Strength Silica (HSS) colonna T3 (100 mm &times; 2,1 mm contenente 1,8 &mu; particelle di diametro m)&nbsp;</td><td>Waters, Machester, Regno Unito</td><td>186003539</td><td>Analisi dei metaboliti</td></tr><tr><td>Q Spettrometro di massa ad alta risoluzione ExactivePlus collegato ad un sistema EASY-nLC 1000.</td><td>Thermo-Fisher, Brema, Germania</td><td></td><td>Analisi dei peptidi</td></tr></tbody></table>

un semplice metodo di estrazione frazionata per l&#39;analisi completa dei metaboliti, dei lipidi e delle proteine ​​da un singolo campione

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

La comprensione di sistemi biologici complessi richiede la misura, l&#39;analisi e l&#39;integrazione di più classi composti della cellula vivente, di solito determinate da transcrizioni, proteomiche, metabolomiche e lipidomiche. In questo protocollo, introduciamo un metodo semplice per l&#39;estrazione riproducibile di metaboliti, lipidi e proteine ​​dai tessuti biologici utilizzando una singola aliquota per campione. Il metodo di estrazione è basato su un metodo di metile di terzo - butile: metanolo: acqua per liquido: suddivisione liquida di metaboliti idrofobici e polari in due fasi immiscibili insieme alla precipitazione di proteine ​​e di altre macromolecole come pellet solido. Questo metodo fornisce quindi tre diverse frazioni di composizione molecolare specifica, che sono pienamente compatibili con le tecnologie comuni ad alta trasmissione &quot;omics&quot; come la cromatografia liquida (LC) o la gascromatografia (GC) accoppiata a spettrometri di massa. Anche se il metodo era initSviluppata per l&#39;analisi di diversi campioni di tessuti vegetali, si è dimostrata pienamente compatibile per l&#39;estrazione e l&#39;analisi di campioni biologici provenienti da sistemi diversi come alghe, insetti, tessuti e colture cellulari di mammiferi.

I set di dati multi-omici completi sono preziosi per la comprensione di sistemi biologici complessi. La strategia di un esperimento biologico riuscito inizia normalmente da un design sperimentale, da un set-up e da una serie di esperimenti, seguito da raccolta di campioni, estrazione, acquisizione di dati analitici, elaborazione dei dati grezzi, analisi dei dati statistici, identificazione del metabolismo rilevante e interpretazione dei dati biologici Tra cui la mappatura e la visualizzazione del percorso ( Figura 1 ). Nel protocollo di estrazione introdotto qui, ci concentriamo sui passaggi di raccolta, di gestione e di estrazione del campione, che sono rappresentati nella panoramica dettagliata del flusso di lavoro in Figura 2 . Per scopi dimostrativi, è stato selezionato 50 mg di tessuto a foglie Arabidopsis. Questo materiale è stato raccolto, macinato e estratto prima di sottoporlo a trePiattaforme UPLC-MS analitiche esemplari, che forniscono dati che possono essere utilizzati per l&#39;analisi lipidomica, metabolomica e proteomica mirata e non mirata. Le figure 2 e 6 comprendono inoltre immagini rappresentative di come, in condizioni standard, il solvente di estrazione dovrebbe essere simile. Inoltre, sono mostrati esempi di campioni contenenti quantità eccessive di macromolecole precipitate (proteine ​​e amido) e campioni con omogeneizzazione del campione inadeguato ( Figura 3 ). La risoluzione dei problemi per questi due problemi comuni è riportata in breve nella Figura 3, ma è anche discussa più in dettaglio nella nostra precedente pubblicazione 16 . Le figure 4 e 5 illustrano esempi di tre cromatogrammi analitici derivanti dal lipido, il polare / semMetaboliti ipolari e analisi proteica. I lipidi, prelevati dalla fase MTBE superiore ( Figura 2 ), sono stati analizzati mediante cromatografia liquida di ultrasuoni a fase inversa (RP) C 8 accoppiata a spettrometria di massa ad alta risoluzione. I lipidi possono essere acquisiti utilizzando modalità di ionizzazione positive e negative ( Figura 4 , pannello superiore) 16 , 24 . Polar e semipolari metabolici primari e secondari sono stati analizzati dalla fase polare (acqua / metanolo) ( figura 2 ) per fase reversa (RP) C 18 UPLC-MS 25 . Il metodo illustrato, utilizzando la cromatografia in fase inversa, è altamente compatibile con l&#39;analisi dei metaboliti semipolari (ossia metaboliti del metabolismo secondario vegetale), che possono essere analizzati utilizzando modalità di ionizzazione positive e negative nella MS( Figura 4 , pannello inferiore) 16 . Altri metaboliti idrofili di questa frazione (zuccheri, amminoacidi polari ecc.) Che non mostrano una buona ritenzione sul materiale di fase inversa possono essere analizzati con altri metodi analitici quali GC-MS 16 o cromatografia liquida di interazione idrofile 30 . Le proteine, prelevate dalla pellet solida nella parte inferiore del tubo di estrazione ( Figura 2 ), sono state digerite e analizzate in soluzione utilizzando la pistola LC-MS ( Figura 5 ), mentre il protocollo di estrazione di amido e parete cellulare Il materiale può essere ottenuto dal nostro protocollo 16 precedentemente pubblicato. In sintesi, più di 200 specie lipidiche, 50 metaboliti semipolari annotati e diverse migliaia di proteiNs possono essere identificati abitualmente da campioni del tipo utilizzato nel nostro esempio. Inoltre, il metodo ha mostrato un&#39;ampia applicabilità utilizzando diversi tessuti, organi e materiale di coltura cellulare ( Figura 6 ). <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55802/55802fig1.jpg" /> Figura 1: Flusso di lavoro generale per analisi di Omics non targetizzati in scala larga. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55802/55802fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55802/55802fig2.jpg" /> Figura 2 : Flusso di lavoro di preparazione e estrazione del campione per l&#39;analisi dei lipidi, dei metaboliti e delle proteine ​​da un singolo aliquota di un campione biologico.<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55802/55802fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55802/55802fig3.jpg" /> Figura 3 : Esempi illustrativi di problemi comunemente osservati che utilizzano protocolli di estrazione a partizione a due fasi. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55802/55802fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55802/55802fig4.jpg" /> Figura 4 : Chromatogrammi rappresentativi di metaboliti lipidici e semipolari da estratti di foglie Arabidopsis thaliana . Cromatogramma di picco baseS di lipidi (pannello superiore) e metaboliti semipolari (pannello inferiore) analizzati in modalità di ionizzazione positiva 16 . I grafici a torta nell&#39;angolo in alto a destra di ciascun cromatogramma mostrano il numero di lipidi e metaboliti identificati assegnati a diverse classi chimiche. Chl, clorofille; DAG, diacilgliceride; DGDG, digalactosyldiacylglycerol; FA, acido grasso; LysoPC, lisofosfatidilcolina; MGDG, monogalactosyldiacylglycerol; PC, fosfatidilcolina; PE, fosfatidiletanolamina; PG, fosfatidilglicerolo; PI, fosfatidilinositolo; PS, fosfatidilcerina; SP, sphingolipide; SQDG, sulfoquinovosyldiacylglycerol; TAG, tricilgliceride. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55802/55802fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55802/55802fig5.jpg" /> Figura 5 <s<html> Trong&gt;: Cromatogramma di picco base rappresentativo dei peptidi da estratto di foglie di Arabidopsis thaliana . Il grafico a torta mostra nell&#39;angolo superiore destro indica il numero di proteine ​​identificate assegnate a diversi processi biologici 16 . <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55802/55802fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55802/55802fig6.jpg" /> Figura 6 : Esempi rappresentativi di estrazione di diversi tipi di tessuti da Arabidopsis thaliana di tipo selvaggio . Tutti i campioni sono stati estratti utilizzando 50 mg di peso fresco dai tessuti indicati.&quot;&gt; Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Tempo (min) </td><td> % Buffer A al Buffer B </td><td></td></tr><tr><td> Da 0 a 1 min </td><td> 45% A </td><td> Tampone A: 1% 1M NH4-Acetato, 0,1% acido acetico in UPLC MS di grado acqua </td></tr><tr><td> Da 1 a 4 min </td><td> Gradiente lineare dal 45% A al 25% A </td><td> Buffer B: 1% 1M NH4-Acetato, 0,1% acido acetico in acetonitrile / isopropanolo 7: 3, (v: v) </td></tr><tr><td> 4 a 12 min </td><td> Gradiente lineare dal 25% A all&#39;11% A </td><td> Portata 400 μL / min </td></tr><tr><td> 12 a 15 min </td><td> Gradiente lineare da 11% A a 0% A </td><td> Volume di iniezione 2 μL </td></tr><tr><td> Da 15 a 19,5 min </td><td> Lavare la colonna per 4,5 min con 0% A </td><td></td></tr><tr> &lt;Td&gt; 19,50 a 19,51 min </td><td> Ritornare al 45% A </td><td></td></tr><tr><td> 19,51 a 24 min </td><td> Equilibrare con il 45% A </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 1: Parametri di gradiente per la separazione dei lipidi RP-UPLC. RP, fase inversa. UPLC, cromatografia liquida a ultrasuoni. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Tempo (min) </td><td> % Buffer A al Buffer B </td><td></td></tr><tr><td> Da 0 a 1 min </td><td> 99% A </td><td> Tampone A: 0,1% acido formico nell&#39;acqua UPLC </td></tr><tr><td> Da 1 a 11 min </td><td> Gradiente lineare dal 99% A al 60% A </td><td> Tampone B: 0,1% acido formico in acetonitrile di UPLC grad </td></tr><tr><td> 11 a 13 min </td><td> Gradiente lineare dal 60% A al 30% A </td><td> Portata 4001; L / min </td></tr><tr><td> Da 13 a 15 min </td><td> Gradiente lineare dal 30% A al 1% A </td><td> Volume di iniezione 2 μL </td></tr><tr><td> 15 a 16 min </td><td> Lavare la colonna per 1 min con 1% A </td><td></td></tr><tr><td> 16 a 17 min </td><td> Gradiente lineare da1% A a 99% A </td><td></td></tr><tr><td> Da 17 a 20 min </td><td> Equilibrare per 3 min al 99% A </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 2: Parametri di gradiente per la separazione RP-UPLC di metaboli polari e semipolari. RP, fase inversa. UPLC, cromatografia liquida a ultrasuoni. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Tempo (min) </td><td> % Buffer B al Buffer A </td><td></td></tr><tr><td> Da 0 a 5 min </td><td> Gradiente lineare da 0 a 10% </td><td> Tampone A: 0,1% acido formico nell&#39;acqua UPLC </td></tr><tr><td> Da 5 a 80 min </td><td> Gradiente lineare dal 10% al 40% </td><td> Tampone B: 0,1% acido formico in acetonitrile di grado UPLC del 60% </td></tr><tr><td> 80 a 85 min </td><td> Gradiente lineare dal 40% al 60% </td><td> Portata 300 nL / min </td></tr><tr><td> 85 a 86 min </td><td> Gradiente lineare dal 60 al 95% </td><td> Volume di iniezione 5 μL </td></tr><tr><td> Da 86 a 91 min </td><td> Lavare la colonna per 5 min con il 95% </td><td></td></tr><tr><td> 91 a 92 min </td><td> Gradiente lineare dal 95% allo 0% </td><td></td></tr><tr><td> Da 93 a 110 min </td><td> Equilibrare la colonna per 17 minuti allo 0% </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 3: Parametri di gradiente per la separazione dei peptidi Nano-LC. LC, cromatografia liquida.

Viene presentato un protocollo per l&#39;estrazione totale dei lipidi, dei metaboliti e delle proteine ​​dai tessuti biologici utilizzando un campione.

Un semplice metodo di estrazione frazionata per l&#39;analisi completa dei metaboliti, dei lipidi e delle proteine ​​da un singolo campione

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

L'obiettivo generale di questo metodo è recuperare e analizzare tutte le principali entità molecolari, inclusi metaboliti polari e semi-polari, lipidi e proteine, da un singolo campione mediante una semplice estrazione frazionata con metil-ter-butil etere. In generale, gli scienziati riscontrano difficoltà nell'analizzare più classi di composti da un unico campione. Utilizzando l'estrazione con MTBE qui presentata, è possibile estrarre e analizzare più classi di composti, come lipidi, metaboliti e proteine, da un singolo campione.Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente di estrarre in modo robusto tutte le classi di composti molecolari da una piccola quantità di aliquota di un singolo campione. Questo metodo aiuta a rispondere a domande fondamentali nella biologia dei sistemi, poiché fornisce la base sperimentale per l'analisi multiomica, fornendo frazioni che possono essere utilizzate per analisi mediante proteomica, lipidomica e metabolomica. Il seguente protocollo viene dimostrato utilizzando tessuto fogliare di Arabidopsis.Arabidopsis sono piccole piante fiorite della famiglia Brassicaceae, imparentate con il cavolo. Iniziare questa procedura pre-raffreddando i portacampioni del disomogeneizzatore in azoto liquido per almeno 10 minuti. Rimuovere i campioni dall'azoto liquido e posizionarli nei portacampioni.E quindi rimuovere i portaprovette dall'azoto liquido. Posizionare rapidamente i portaprovette nel frantumatore tissutale e impostare il frantumatore per macinare il materiale biologico in una polvere fine ed omogenea. Per le foglie, utilizzare 20 hertz per un minuto.Il tempo e la velocità di omogeneizzazione possono variare a seconda del tessuto. Assicurarsi di omogeneizzare fino a quando il campione risultante non diventa una polvere molto fine. Il campione deve essere mantenuto congelato in ogni fase dell'omogeneizzazione.Omogeneizzare i campioni, quindi rimuovere i campioni biologici dai portaprovette. Se non verranno utilizzati immediatamente, collocarli in un congelatore a meno 80 gradi Celsius fino all'estrazione successiva. Etichettare quattro microprovette con fondo rotondo da due millilitri con chiusura di sicurezza con il numero del campione.Raffreddare preventivamente le provette e alcune spatole immergendole in azoto liquido. Una volta che provette e spatole sono fredde, posizionare una delle provette su una bilancia analitica e utilizzare una spatola per prelevare 25 milligrammi di polvere di tessuto all'interno di una provetta da microcentrifuga. Registrare il peso esatto di ciascun campione, quindi posizionare immediatamente i campioni aliotiquotati in azoto liquido.Eseguire rapidamente questo passaggio per evitare lo scongelamento del materiale vegetale. Conservare i campioni aliquotati a meno 80 gradi Celsius fino all'estrazione successiva. Per prepararsi all'estrazione, pre-raffreddare l'etere metil-tert-butile, o miscela di estrazione metanolo MTBE, preparata come descritto nel documento allegato, in un congelatore a meno 20 gradi Celsius.Prelevare i campioni aliquote e aggiungere un millilitro della miscela di estrazione pre-raffreddata in ogni provetta. Eseguire questo passaggio rapidamente. L'etere metil-ter-butilico ha una bassa viscosità e può gocciolare dalla punta della pipetta.Mescolare immediatamente ogni campione su un agitatore vortex fino a quando il tessuto non è ben omogeneizzato all'interno della miscela di estrazione. Mantenere le provette in un portaprovette sul banco fino a quando tutti i campioni non sono stati estratti. Questo passaggio è fondamentale.Qui precipitiamo le proteine e ne inattiviamo le attività enzimatiche. Incubare tutti i campioni su un agitatore orbitale a 100 RPM per 45 minuti a quattro gradi Celsius. Successivamente, sottoporre i campioni a sonicazione per 15 minuti in un bagno di sonicazione ghiacciato.Successivamente, per frazionare mediante separazione in fase, aggiungere 650 microlitri di una soluzione tre a uno di acqua e metanolo a ogni provetta del campione. Mescolare quindi mediante vortex per un minuto. Centrifugare i campioni a una velocità di 20.000 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Dopo questo passaggio, maneggiare le provette con attenzione per evitare il mescolamento delle due fasi liquide e per non disturbare il pellet precipitato. A questo punto, sono presenti due fasi liquide ammissibili con un pellet solido sul fondo della provetta. La fase superiore apolare contiene i lipidi.La fase acquosa inferiore contiene metaboliti polari e semi-polari. Il pellet contiene proteine, amidi e la parete cellulare. Trasferire 500 microlitri di solvente dalla fase superiore contenente lipidi in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri etichettato.Quindi, utilizzando una pipetta da 200 microlitri, rimuovere con attenzione la fase lipidica residua e scartarla. Successivamente, trasferire 400 microlitri del solvente dalla fase inferiore in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri opportunamente etichettato. Trasferire un’ulteriore aliquota di 200 microlitri in un tubo microcentrifuga per eseguire ulteriori analisi, come l’analisi dei metaboliti mediante cromatografia gassosa.Rimuovere e scartare il resto della fase acquosa asportando con pipetta il volume in eccesso. Quindi, per lavare il pellet proteina-amido-parete cellulare ottenuto, aggiungere 500 microlitri di metanolo e successivamente vortexare per un minuto. Centrifugare i campioni a una velocità di 10.000 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Evaporare il solvente dai campioni lipidici utilizzando un evaporatore a flusso di azoto per evitare modifiche ossidative dei lipidi. I campioni secchi risultanti devono essere analizzati immediatamente. Evaporare il solvente dai campioni acquosi durante la notte in un concentratore sotto vuoto senza riscaldamento.I campioni acquosi essiccati possono essere conservati per diverse settimane a meno 80 gradi Celsius prima dell'analisi. Ri-sospendere le frazioni lipidiche essiccate in 400 microlitri di una soluzione di acetonitrile e 2-propanolo nel rapporto sette a tre. Trasferire un volume sufficiente del liquido in vial di vetro e chiudere ermeticamente.Quindi, posizionare i vial di vetro in un campionatore automatico refrigerato a quattro gradi Celsius. Iniettare due microlitri per campione e separare i lipidi su una colonna a fase inversa C8 mantenuta a 60 gradi Celsius utilizzando un sistema UPLC operante a una portata di 400 microlitri al minuto. Utilizzare le fasi mobili descritte nella Tabella 1 del documento allegato per la separazione cromatografica.Acquisire gli spettri di massa in modalità di ionizzazione positiva e negativa utilizzando uno strumento di spettrometria di massa adeguato che copra un intervallo di massa compreso tra 150 e 1500 rapporto carica-massa. Ri-sospendere la fase polare in 200 microlitri di una soluzione al rapporto uno a uno di metanolo grado UPLC in acqua. Trasferire una quantità sufficiente di liquido in vial di vetro e chiudere ermeticamente. Quindi, posizionare le provette di vetro in un campionatore automatico refrigerato a quattro gradi Celsius. Iniettare due microlitri da ciascun campione e separare i metaboliti su una colonna RP C-18 mantenuta a 40 gradi Celsius, utilizzando un sistema UPLC con una portata di 400 microlitri al minuto. Utilizzare le fasi mobili per la separazione cromatografica con i parametri indicati nella Tabella 2 del documento allegato.Acquisire spettri di massa full scan in modalità di ionizzazione positiva e negativa utilizzando uno spettrometro di massa adatto, che copra un intervallo di massa compreso tra 50 e 1500 rapporto massa/carica. Infine, eseguire l'estrazione, la digestione e l'analisi delle proteine, come descritto nel documento allegato. Sono stati raccolti, macinati ed estratti 25 milligrammi di tessuto fogliare di Arabidopsis prima di sottoporli a tre piattaforme analitiche UPLC-MS.I metaboliti primari e secondari polari e semi-polari sono stati analizzati a partire dalla fase polare mediante UPLC-MS in fase inversa C-18. I cromatogrammi del picco base dei lipidi, mostrati nel pannello superiore, e dei metaboliti semi-polari, mostrati nel pannello inferiore, sono stati analizzati in modalità di ionizzazione positiva. L'istogramma a torta nell'angolo superiore destro di ciascun cromatogramma mostra il numero di lipidi e metaboliti identificati assegnati a diverse classi chimiche.Ad esempio, a 58 diversi lipidi è stato assegnato il gruppo dei triacilgliceroli, indicato nel grafico superiore come TAG. Metaboliti più idrofili di questa frazione, come zuccheri e aminoacidi polari, che non mostrano una buona ritenzione sul materiale a fase inversa, possono essere analizzati mediante altri metodi analitici, come la GCMS o la cromatografia liquida a interazione idrofila. Le proteine ottenute dall'estrazione sono state digerite in soluzione e analizzate mediante LCMS in modalità shotgun.L'istogramma circolare mostrato nell'angolo superiore destro indica il numero di proteine identificate assegnate a diversi processi biologici. Ad esempio, 268 proteine sono state assegnate alla categoria localizzazione. In sintesi, da campioni come quello utilizzato in questo esempio è possibile identificare routineamente più di 200 specie lipidiche, 50 metaboliti semipolari annotati e diverse migliaia di proteine.Inoltre, il metodo ha dimostrato un'ampia applicabilità utilizzando diversi tessuti, organi e materiali da colture cellulari. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come estrarre e analizzare la maggior parte dei composti essenziali da un singolo campione. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante mantenere tutti i campioni congelati, frantumare correttamente il materiale e utilizzare solventi e prodotti chimici di grado analitico.Seguendo questa procedura, tutti i metodi analitici possono essere impiegati per determinare la composizione molecolare dei campioni estratti.

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Un semplice metodo di estrazione frazionata per lanalisi completa dei metaboliti, dei lipidi e delle proteine ​​da un singolo campione (Video) | JoVE Journal

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