Un semplice metodo di estrazione frazionata per l'analisi completa dei metaboliti, dei lipidi e delle proteine ​​da un singolo campione

L'obiettivo generale di questo metodo è recuperare e analizzare tutte le principali entità molecolari, inclusi metaboliti polari e semi-polari, lipidi e proteine, da un singolo campione mediante una semplice estrazione frazionata con metil-ter-butil etere. In generale, gli scienziati riscontrano difficoltà nell'analizzare più classi di composti da un unico campione. Utilizzando l'estrazione con MTBE qui presentata, è possibile estrarre e analizzare più classi di composti, come lipidi, metaboliti e proteine, da un singolo campione.

Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente di estrarre in modo robusto tutte le classi di composti molecolari da una piccola quantità di aliquota di un singolo campione. Questo metodo aiuta a rispondere a domande fondamentali nella biologia dei sistemi, poiché fornisce la base sperimentale per l'analisi multiomica, fornendo frazioni che possono essere utilizzate per analisi mediante proteomica, lipidomica e metabolomica. Il seguente protocollo viene dimostrato utilizzando tessuto fogliare di Arabidopsis.

Arabidopsis sono piccole piante fiorite della famiglia Brassicaceae, imparentate con il cavolo. Iniziare questa procedura pre-raffreddando i portacampioni del disomogeneizzatore in azoto liquido per almeno 10 minuti. Rimuovere i campioni dall'azoto liquido e posizionarli nei portacampioni.

E quindi rimuovere i portaprovette dall'azoto liquido. Posizionare rapidamente i portaprovette nel frantumatore tissutale e impostare il frantumatore per macinare il materiale biologico in una polvere fine ed omogenea. Per le foglie, utilizzare 20 hertz per un minuto.

Il tempo e la velocità di omogeneizzazione possono variare a seconda del tessuto. Assicurarsi di omogeneizzare fino a quando il campione risultante non diventa una polvere molto fine. Il campione deve essere mantenuto congelato in ogni fase dell'omogeneizzazione.

Omogeneizzare i campioni, quindi rimuovere i campioni biologici dai portaprovette. Se non verranno utilizzati immediatamente, collocarli in un congelatore a meno 80 gradi Celsius fino all'estrazione successiva. Etichettare quattro microprovette con fondo rotondo da due millilitri con chiusura di sicurezza con il numero del campione.

Raffreddare preventivamente le provette e alcune spatole immergendole in azoto liquido. Una volta che provette e spatole sono fredde, posizionare una delle provette su una bilancia analitica e utilizzare una spatola per prelevare 25 milligrammi di polvere di tessuto all'interno di una provetta da microcentrifuga. Registrare il peso esatto di ciascun campione, quindi posizionare immediatamente i campioni aliotiquotati in azoto liquido.

Eseguire rapidamente questo passaggio per evitare lo scongelamento del materiale vegetale. Conservare i campioni aliquotati a meno 80 gradi Celsius fino all'estrazione successiva. Per prepararsi all'estrazione, pre-raffreddare l'etere metil-tert-butile, o miscela di estrazione metanolo MTBE, preparata come descritto nel documento allegato, in un congelatore a meno 20 gradi Celsius.

Prelevare i campioni aliquote e aggiungere un millilitro della miscela di estrazione pre-raffreddata in ogni provetta. Eseguire questo passaggio rapidamente. L'etere metil-ter-butilico ha una bassa viscosità e può gocciolare dalla punta della pipetta.

Mescolare immediatamente ogni campione su un agitatore vortex fino a quando il tessuto non è ben omogeneizzato all'interno della miscela di estrazione. Mantenere le provette in un portaprovette sul banco fino a quando tutti i campioni non sono stati estratti. Questo passaggio è fondamentale.

Qui precipitiamo le proteine e ne inattiviamo le attività enzimatiche. Incubare tutti i campioni su un agitatore orbitale a 100 RPM per 45 minuti a quattro gradi Celsius. Successivamente, sottoporre i campioni a sonicazione per 15 minuti in un bagno di sonicazione ghiacciato.

Successivamente, per frazionare mediante separazione in fase, aggiungere 650 microlitri di una soluzione tre a uno di acqua e metanolo a ogni provetta del campione. Mescolare quindi mediante vortex per un minuto. Centrifugare i campioni a una velocità di 20.000 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

Dopo questo passaggio, maneggiare le provette con attenzione per evitare il mescolamento delle due fasi liquide e per non disturbare il pellet precipitato. A questo punto, sono presenti due fasi liquide ammissibili con un pellet solido sul fondo della provetta. La fase superiore apolare contiene i lipidi.

La fase acquosa inferiore contiene metaboliti polari e semi-polari. Il pellet contiene proteine, amidi e la parete cellulare. Trasferire 500 microlitri di solvente dalla fase superiore contenente lipidi in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri etichettato.

Quindi, utilizzando una pipetta da 200 microlitri, rimuovere con attenzione la fase lipidica residua e scartarla. Successivamente, trasferire 400 microlitri del solvente dalla fase inferiore in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri opportunamente etichettato. Trasferire un’ulteriore aliquota di 200 microlitri in un tubo microcentrifuga per eseguire ulteriori analisi, come l’analisi dei metaboliti mediante cromatografia gassosa.

Rimuovere e scartare il resto della fase acquosa asportando con pipetta il volume in eccesso. Quindi, per lavare il pellet proteina-amido-parete cellulare ottenuto, aggiungere 500 microlitri di metanolo e successivamente vortexare per un minuto. Centrifugare i campioni a una velocità di 10.000 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

Evaporare il solvente dai campioni lipidici utilizzando un evaporatore a flusso di azoto per evitare modifiche ossidative dei lipidi. I campioni secchi risultanti devono essere analizzati immediatamente. Evaporare il solvente dai campioni acquosi durante la notte in un concentratore sotto vuoto senza riscaldamento.

I campioni acquosi essiccati possono essere conservati per diverse settimane a meno 80 gradi Celsius prima dell'analisi. Ri-sospendere le frazioni lipidiche essiccate in 400 microlitri di una soluzione di acetonitrile e 2-propanolo nel rapporto sette a tre. Trasferire un volume sufficiente del liquido in vial di vetro e chiudere ermeticamente.

Quindi, posizionare i vial di vetro in un campionatore automatico refrigerato a quattro gradi Celsius. Iniettare due microlitri per campione e separare i lipidi su una colonna a fase inversa C8 mantenuta a 60 gradi Celsius utilizzando un sistema UPLC operante a una portata di 400 microlitri al minuto. Utilizzare le fasi mobili descritte nella Tabella 1 del documento allegato per la separazione cromatografica.

Acquisire gli spettri di massa in modalità di ionizzazione positiva e negativa utilizzando uno strumento di spettrometria di massa adeguato che copra un intervallo di massa compreso tra 150 e 1500 rapporto carica-massa. Ri-sospendere la fase polare in 200 microlitri di una soluzione al rapporto uno a uno di metanolo grado UPLC in acqua. Trasferire una quantità sufficiente di liquido in vial di vetro e chiudere ermeticamente.

Quindi, posizionare le provette di vetro in un campionatore automatico refrigerato a quattro gradi Celsius. Iniettare due microlitri da ciascun campione e separare i metaboliti su una colonna RP C-18 mantenuta a 40 gradi Celsius, utilizzando un sistema UPLC con una portata di 400 microlitri al minuto. Utilizzare le fasi mobili per la separazione cromatografica con i parametri indicati nella Tabella 2 del documento allegato.

Acquisire spettri di massa full scan in modalità di ionizzazione positiva e negativa utilizzando uno spettrometro di massa adatto, che copra un intervallo di massa compreso tra 50 e 1500 rapporto massa/carica. Infine, eseguire l'estrazione, la digestione e l'analisi delle proteine, come descritto nel documento allegato. Sono stati raccolti, macinati ed estratti 25 milligrammi di tessuto fogliare di Arabidopsis prima di sottoporli a tre piattaforme analitiche UPLC-MS.

I metaboliti primari e secondari polari e semi-polari sono stati analizzati a partire dalla fase polare mediante UPLC-MS in fase inversa C-18. I cromatogrammi del picco base dei lipidi, mostrati nel pannello superiore, e dei metaboliti semi-polari, mostrati nel pannello inferiore, sono stati analizzati in modalità di ionizzazione positiva. L'istogramma a torta nell'angolo superiore destro di ciascun cromatogramma mostra il numero di lipidi e metaboliti identificati assegnati a diverse classi chimiche.

Ad esempio, a 58 diversi lipidi è stato assegnato il gruppo dei triacilgliceroli, indicato nel grafico superiore come TAG. Metaboliti più idrofili di questa frazione, come zuccheri e aminoacidi polari, che non mostrano una buona ritenzione sul materiale a fase inversa, possono essere analizzati mediante altri metodi analitici, come la GCMS o la cromatografia liquida a interazione idrofila. Le proteine ottenute dall'estrazione sono state digerite in soluzione e analizzate mediante LCMS in modalità shotgun.

L'istogramma circolare mostrato nell'angolo superiore destro indica il numero di proteine identificate assegnate a diversi processi biologici. Ad esempio, 268 proteine sono state assegnate alla categoria localizzazione. In sintesi, da campioni come quello utilizzato in questo esempio è possibile identificare routineamente più di 200 specie lipidiche, 50 metaboliti semipolari annotati e diverse migliaia di proteine.

Inoltre, il metodo ha dimostrato un'ampia applicabilità utilizzando diversi tessuti, organi e materiali da colture cellulari. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come estrarre e analizzare la maggior parte dei composti essenziali da un singolo campione. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante mantenere tutti i campioni congelati, frantumare correttamente il materiale e utilizzare solventi e prodotti chimici di grado analitico.

Seguendo questa procedura, tutti i metodi analitici possono essere impiegati per determinare la composizione molecolare dei campioni estratti.