Un semplice metodo di estrazione frazionata per l'analisi completa dei metaboliti, dei lipidi e delle proteine ​​da un singolo campione

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di recuperare e analizzare tutte le principali entità molecolari, compresi i metaboliti polari e semipolari, i lipidi e le proteine da un singolo campione utilizzando una semplice estrazione frazionata di metil-tributil etere. In generale, gli scienziati hanno difficoltà ad analizzare più classi di composti da un singolo campione. Utilizzando l'estrazione MTBE che presentiamo qui, è possibile estrarre e analizzare più classi di composti, come lipidi, metaboliti e proteine da un singolo campione.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che può estrarre in modo robusto tutte le classi di composti molecolari da una piccola quantità di aliquote di un singolo campione. Questo metodo aiuta a rispondere a domande fondamentali nella biologia dei sistemi, poiché fornisce la base sperimentale per l'analisi multiomica, fornendo frazioni che possono essere utilizzate per l'analisi mediante proteomica, lipidomica e metabolomica. Il seguente protocollo è stato dimostrato utilizzando il tessuto fogliare di Arabidopsis.

Le Arabidopsis sono piccole piante da fiore della famiglia delle Brassicaceae e sono imparentate con i cavoli. Iniziare questa procedura pre-raffreddando i supporti delle provette dell'omogeneizzatore di tessuto in azoto liquido per almeno 10 minuti. Rimuovere i campioni dall'azoto liquido e posizionarli nei supporti delle provette.

Quindi rimuovere i portaprovette dall'azoto liquido. Inserire rapidamente i portaprovette nell'omogeneizzatore di tessuto e impostare l'omogeneizzatore per macinare il materiale biologico in una polvere fine e omogenea. Per le foglie, utilizzare 20 hertz per un minuto.

Il tempo e la velocità di omogeneizzazione possono variare a seconda del tessuto. Assicurarsi di omogeneizzare fino a quando il campione risultante non è una polvere molto fine. E il campione deve essere mantenuto congelato in ogni fase dell'omogeneizzazione.

Omogeneizzare i campioni, quindi rimuovere i campioni biologici dai supporti delle provette. E se non verranno utilizzati subito, mettili in un congelatore a meno 80 gradi Celsius fino a nuova estrazione. Etichettare quattro provette per microcentrifuga da due millilitri a fondo tondo con chiusura di sicurezza con il numero del campione.

Pre-raffreddare i tubi e alcune spatole immergendoli in azoto liquido. Una volta che le provette e le spatole si sono raffreddate, posizionare una delle provette su una bilancia analitica e utilizzare una spatola per aliquotare 25 milligrammi di polvere di tessuto nella provetta per microcentrifuga. Registrare il peso esatto di ciascun campione, quindi immergere immediatamente i campioni aliquotici nell'azoto liquido.

Eseguire rapidamente questo passaggio per evitare di scongelare il materiale vegetale. Conservare i campioni aliquotati a meno 80 gradi Celsius fino a un'ulteriore estrazione. Per prepararsi all'estrazione, preraffreddare l'etere metilterz-butilico, o la miscela di estrazione con metanolo MTBE, preparata come descritto nel documento di accompagnamento, in un congelatore a meno 20 gradi Celsius.

Estrarre i campioni aliquotati e aggiungere un millilitro della miscela di estrazione pre-raffreddata a ciascuna provetta del campione. Eseguire rapidamente questo passaggio. L'MTBE ha una bassa viscosità e può gocciolare dal puntale della pipetta.

Miscelare immediatamente ogni campione su un miscelatore a vortice fino a quando il tessuto non è ben omogeneizzato all'interno della miscela di estrazione. Conservare le provette in un rack sul banco fino a quando tutti i campioni non sono stati estratti. Questo passaggio è fondamentale.

Qui precipitiamo le proteine e inattiviamo le loro attività enzimatiche. Incubare tutti i campioni su un agitatore orbitale a 100 giri/min per 45 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi sonicare i campioni per 15 minuti in un bagno di sonicazione ghiacciato.

Successivamente, per frazionare mediante separazione di fase, aggiungere 650 microlitri di una soluzione tre a uno di acqua e metanolo a ciascuna provetta del campione. Quindi mescolare a vortice per un minuto. Centrifugare i campioni a una velocità di 20.000 volte g per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

Dopo questo passaggio, maneggiare i tubi con cura per evitare la miscelazione delle due fasi liquide ed evitare di rompere il pellet precipitato. In questa fase, ci sono due fasi liquide ammissibili con un pellet solido sul fondo del tubo. La fase superiore non polare contiene lipidi.

La fase acquosa inferiore contiene metaboliti polari e semipolari. Il pellet contiene proteine, amidi e la parete cellulare. Trasferire 500 microlitri di solvente dalla fase superiore contenente lipidi in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri etichettata.

Quindi, utilizzando una pipetta da 200 microlitri, rimuovere con cura la fase lipidica rimanente e gettarla. Quindi, trasferire 400 microlitri di solvente dalla fase inferiore in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri etichettata. Trasferire un'aliquota aggiuntiva di 200 microlitri in una provetta micro-fuge per eseguire ulteriori analisi, come l'analisi dei metaboliti basata sulla gascromatografia.

Rimuovere ed eliminare il resto della fase acquosa pipettando il volume in eccesso. Quindi, per lavare il pellet di proteina-amido-parete cellulare ottenuto, aggiungere 500 microlitri di metanolo e poi agitarlo per un minuto. Centrifugare i campioni a una velocità di 10.000 volte g per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

Far evaporare il solvente dai campioni lipidici utilizzando un evaporatore a flusso di azoto per evitare modifiche ossidative dei lipidi. I campioni essiccati risultanti devono essere analizzati immediatamente. Far evaporare il solvente dai campioni acquosi per una notte in un concentratore sottovuoto senza riscaldamento.

I campioni acquosi essiccati possono essere conservati per diverse settimane a meno 80 gradi Celsius prima dell'analisi. Risospendere le frazioni lipidiche essiccate in 400 microlitri di una soluzione di sette-tre acetonitrile a 2-propanolo. Trasferire una quantità sufficiente di liquido nelle fiale di vetro e tappare ermeticamente.

Quindi, metti le fiale di vetro in un campionatore automatico raffreddato a quattro gradi Celsius. Iniettare due microlitri per campione e separare i lipidi su una colonna C8 a fase inversa mantenuta a 60 gradi Celsius utilizzando un sistema UPLC funzionante a una velocità di flusso di 400 microlitri al minuto. Utilizzare le fasi mobili descritte nella tabella 1 del documento di accompagnamento per la separazione cromatografica.

Acquisire gli spettri di massa in modalità di ionizzazione positiva e negativa utilizzando uno strumento MS adatto che copre l'intervallo di massa compreso tra 150 e 1500 con rapporto carica/massa. Risospendere la fase polare in 200 microlitri di una soluzione di metanolo UPLC uno-a-uno in acqua. Trasferire una quantità sufficiente di liquido nelle fiale di vetro e tappare ermeticamente.

Quindi, metti le fiale di vetro in un campionatore automatico raffreddato, a quattro gradi Celsius. Iniettare due microlitri da ciascun campione e separare i metaboliti su una colonna RP C-18 mantenuta a 40 gradi Celsius utilizzando un sistema UPLC funzionante a una velocità di flusso di 400 microlitri al minuto. Utilizzare le fasi mobili per la separazione cromatografica con i parametri indicati nella tabella 2 del documento di accompagnamento.

Acquisizione di spettri di massa a scansione completa in modalità di ionizzazione positiva e negativa utilizzando uno spettrometro di massa adatto che copre un intervallo di massa compreso tra 50 e 1500 con rapporto massa/carica. Infine, eseguire l'estrazione, la digestione e l'analisi delle proteine, come descritto nel documento di accompagnamento. Sono stati raccolti, macinati ed estratti 25 milligrammi di tessuto fogliare di Arabidopsis prima di sottoporlo a tre piattaforme analitiche UPLC-MS.

I metaboliti primari e secondari polari e semipolari sono stati analizzati dalla fase polare mediante C-18 UPLC-MS in fase inversa. I cromatogrammi di picco di base dei lipidi, mostrati nel pannello superiore, e dei metaboliti semi-polari, mostrati nel pannello inferiore, sono stati analizzati in modalità ionizzazione positiva. Il grafico a torta nell'angolo in alto a destra di ogni cromatogramma mostra il numero di lipidi e metaboliti identificati assegnati a diverse classi chimiche.

Ad esempio, 58 lipidi diversi sono stati assegnati al gruppo dei triacilgliceridi, indicato nella tabella superiore come TAG. I metaboliti più idrofili di questa frazione, come gli zuccheri e gli amminoacidi polari, che non mostrano una buona ritenzione sul materiale in fase inversa, possono essere analizzati con altri metodi analitici, come il GCMS o la cromatografia liquida con interazione idrofila. Le proteine che sono state recuperate dall'estrazione sono state digerite in soluzione e analizzate utilizzando LCMS shotgun.

Il grafico a torta mostrato nell'angolo in alto a destra indica il numero di proteine identificate assegnate a diversi processi biologici. Ad esempio, 268 proteine sono state assegnate alla categoria di localizzazione. In sintesi, più di 200 specie lipidiche, 50 metaboliti semipolari annotati e diverse migliaia di proteine possono essere identificate di routine da campioni come quello utilizzato in questo esempio.

Inoltre, il metodo ha mostrato un'ampia applicabilità utilizzando diversi tessuti, organi e materiale di coltura cellulare. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come estrarre e analizzare la maggior parte dei composti essenziali da un singolo campione. Durante il tentativo di questa procedura, è importante mantenere tutti i campioni congelati, macinare correttamente il materiale e utilizzare solventi e sostanze chimiche di grado analitico.

Seguendo questa procedura, tutti i metodi analitici possono essere impiegati per determinare la composizione molecolare dei campioni estratti.