Maggiore Campione Multiplexing dei tessuti utilizzando combinata Precursore isotopica etichettatura e isobarica Tagging (CPilot)

L'obiettivo generale di questo metodo multiplex migliorato è aumentare il numero di campioni proteici che possono essere analizzati contemporaneamente, riducendo al contempo gli errori del campione e il tempo di utilizzo dello strumento. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei campi dell'invecchiamento, delle malattie neurodegenerative, di altre patologie legate all'età e del cancro, relative a patogenesi, progressione, diagnosi, prognosi e bersagli terapeutici. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di ottenere una visione d'insieme completa delle variazioni proteiche in molteplici condizioni.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla malattia di Alzheimer in modelli murini, può anche essere applicato a campioni di tessuto provenienti da pazienti affetti da Alzheimer o da una serie di altre patologie. In generale, chi si approccia per la prima volta a questo metodo lo troverà impegnativo perché richiede di gestire simultaneamente diversi campioni in un breve lasso di tempo. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo riconosciuto che l'acetilazione poteva essere combinata con l'etichettatura isobarica per la nitrazione delle proteine, il che ci ha spinto a sviluppare una tecnica applicabile in modo globale a tutti i peptidi.

Questo studio analizzerà tessuti cerebrali, cardiaci ed epatici provenienti da un modello murino di malattia di Alzheimer e da controlli di tipo selvatico. Trasferire da 60 a 90 milligrammi di ciascun campione di tessuto in un tubo per la lisi e aggiungere 500 microlitri di PBS contenente otto moli di urea. Omogeneizzare i campioni utilizzando un omogeneizzatore meccanico.

Rimuovere l'omogenato tissutale dal tubo di lisi e trasferirlo in un tubo da microcentrifuga. Lavare il tubo di lisi con 100-500 microlitri di PBS contenente otto moli di urea e unire la soluzione di lavaggio all'omogenato tissutale. Centrifugare l'omogenato tissutale per 15 minuti.

Recuperare il soprannatante da ciascun campione. Dopo aver eseguito il saggio BCA per determinare la concentrazione proteica, aggiungere 100 microgrammi di proteina da ciascun campione in provette microcentrifuga etichettate singolarmente. Aggiungere il dithiothreitol a ciascun campione.

E incubare a 37 gradi Celsius per due ore. Aggiungere iodacetammide, IAM, a ogni campione e incubare sul ghiaccio al buio per due ore. Successivamente, aggiungere L-cisteina a ogni campione e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.

Dopo 30 minuti, aggiungere il buffer tris con cloruro di calcio per diluire l'urea fino a una concentrazione finale di due molarità. Aggiungere la tripsina trattata con L1 tosilimitotofeniletilcolormetilchetone a ciascun campione e incubare a 37 gradi Celsius per 24 ore.

Il giorno successivo, arrestare la digestione proteica congelando rapidamente il campione in azoto liquido e conservarlo a meno 80 gradi Celsius fino al successivo trattamento. Prima dell'etichettatura con dimetilazione, i campioni peptidici vengono desalificati, come descritto nel protocollo testuale, ed essiccati mediante centrifugazione sotto vuoto. Per iniziare la procedura di etichettatura con dimetilazione, ricostituire i peptidi in acido acetico al 1% disciolto in acqua di grado HPLC o nanopura.

Prelevare una porzione di 50 microgrammi di ciascun campione in un nuovo tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri. Conservare il resto dei peptidi ricostituiti a meno 80 gradi Celsius per esperimenti futuri. Nei passaggi che verranno dimostrati successivamente, è fondamentale aggiungere i reagenti rapidamente in modo che le reazioni chimiche avvengano per lo stesso periodo di tempo per tutti i campioni.

Aggiungere otto microlitri di una soluzione di formaldeide 60 millimolare ai campioni per la marcatura con dimetilazione leggera. Aggiungere otto microlitri di una soluzione di formaldeide marcata con carbonio 13 e deuterio 60 millimolare ai campioni per la marcatura con dimetilazione pesante. Aggiungere otto microlitri di boroidruro di sodio 24 millimolare ai campioni marcati con dimetilazione leggera.

Aggiungere otto microlitri di cianoboroidruro di sodio 24 millimolare ai campioni etichettati con dimetilazione pesante. Vortexare i campioni, quindi agitare delicatamente su un agitatore per provette per circa 10 minuti a temperatura ambiente. Arrestare le reazioni aggiungendo 16 microlitri di ammoniaca al 1% per cinque minuti.

Riacidificare le miscele di reazione aggiungendo otto microlitri di acido formico al 5%. Combinare i peptidi marcati con dimetilazione leggera e pesante per ottenere un totale di sei campioni. Eseguire la desalinizzazione dei campioni come descritto nel protocollo testuale.

E asciugare i campioni mediante centrifugazione sotto vuoto. Per iniziare la marcatura isobarica dei campioni dimetilati, prima di tutto ricostituire 100 microgrammi di peptidi dimetilati e bicarbonato di trietilammonio, o tampone TEAB. Successivamente, preparare i reagenti isobarici seguendo il protocollo del produttore del kit per la marcatura isobarica.

Aggiungere il volume appropriato, in questo caso 41 microlitri del reagente di marcatura isobarica solubilizzato, a ciascun campione di peptidi e vortexare per circa 10 secondi. Incubare i campioni su un agitatore per provette da microcentrifuga per circa un'ora a temperatura ambiente. Per bloccare le reazioni, aggiungere 8 microlitri di idrossilammina a ciascun campione.

E incubare i campioni per 15 minuti a temperatura ambiente. Riunire i sei campioni etichettati in un'unica miscela ed eseguire la desalting. Preparare i peptidi per la cromatografia liquida ricostituendo i peptidi in acqua di grado per spettrometria di massa contenente acido formico allo 0,1%.

Aggiungere i peptidi ricostituiti in una provetta da microcentrifuga contenente un filtro da 0,65 micrometri. Centrifugare a 12.000 × g per un minuto. Rimuovere e scartare il filtro.

Trasferire i peptidi filtrati in una provetta per autosampler. Iniettare sei microlitri di ogni campione della frazione di scambio cationico forte su una colonna trappola. Riempire con materiale carbonio 18 fino a due centimetri.

Eseguire i metodi di separazione analitica e di acquisizione dati con lo spettrometro di massa. È stata effettuata un'analisi cPilot in 12-plex su tessuti cerebrali, cardiaci ed epatici provenienti da un modello murino di malattia di Alzheimer e da controlli di tipo selvaggio. I dati dei precursori hanno mostrato peptidi dimetilati leggeri e pesanti, rappresentati dai picchi a m/z 643.854 e 647.875.

Questi peptidi sono stati selezionati, isolati in modo indipendente e frammentati mediante dissociazione indotta da collisione per generare questi spettri. I risultati della ricerca hanno indicato che i picchi appartenevano a un peptide della proteina fosfoglicerato chinasi uno. Questi picchi sono stati ulteriormente isolati per una spettrometria di massa tandem con dissociazione collisionale ad alta energia e gli ioni reporter sono stati osservati come mostrato.

Sono necessari entrambi i set di spettri di spettrometria di massa in tre stadi per ottenere informazioni sui 12 campioni. In questo esempio, i rapporti tra gli ioni della malattia di Alzheimer e quelli del controllo di tipo selvaggio sono simili tra i due replicati biologici per i tessuti cerebrale, epatico e cardiaco. I valori di variazione espressi in termini di fold change per ogni confronto suggeriscono che i livelli di chinasi del fosfoglicerato uno nel cervello e nel cuore sono più elevati nei topi con malattia di Alzheimer, ma più bassi nel fegato.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa cinque ore se effettuata correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di prestare attenzione alla manipolazione del campione. All'interno di questa procedura, possono essere eseguiti metodi di separazione come lo scambio cationico forte o la frazionatura ad alto pH al fine di aumentare la profondità giornaliera e la copertura.

Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come migliorare il multiplexing del campione utilizzando C-Pilot.