Maggiore Campione Multiplexing dei tessuti utilizzando combinata Precursore isotopica etichettatura e isobarica Tagging (CPilot)

L'obiettivo generale di questo metodo multiplex avanzato è aumentare il numero di campioni di proteine che possono essere analizzati contemporaneamente, riducendo al contempo l'errore del campione e il tempo dello strumento. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'invecchiamento, delle malattie neurodegenerative, di altre malattie legate all'età e del cancro correlate alla patogenesi, alla progressione, alla diagnosi, alla prognosi e ai bersagli terapeutici. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è possibile generare un'istantanea completa dei cambiamenti proteici in molte condizioni.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla malattia di Alzheimer in un modello murino, può anche essere applicato a campioni di tessuto di pazienti con Alzheimer o una serie di altri disturbi. In generale, le persone che non conoscono questo metodo lo troveranno difficile perché ci sono diversi campioni da gestire contemporaneamente in un breve lasso di tempo. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando ci siamo resi conto che l'acetilazione poteva essere combinata con la marcatura isoberica per la nitrazione delle proteine, il che ci ha motivato a far funzionare la tecnica a livello globale per tutti i peptidi.

Questo studio analizzerà il cervello, il cuore e i tessuti epatici di un modello murino di Alzheimer e di controlli wild type. Trasferire da 60 a 90 milligrammi di ciascun campione di tessuto in una provetta di lisi e aggiungere 500 microlitri di PBS con urea a otto molari. Omogeneizzare i campioni utilizzando un omogeneizzatore meccanico.

Rimuovere l'omogeneizzato di tessuto dalla provetta di lisi e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga. Sciacquare la provetta di lisi con 100-500 microlitri di PBS con urea a otto molari e combinare la soluzione di risciacquo con l'omogeneizzato di tessuto. Centrifugare l'omogeneizzato di tessuto per 15 minuti.

Afferrare il surnatante da ogni campione. Dopo aver eseguito il test BCA per determinare la concentrazione proteica, aggiungere 100 microgrammi di proteine da ciascun campione a provette per microcentrifuga etichettate individualmente. Aggiungere ditiotreitolo a ciascun campione.

E incubare a 37 gradi Celsius per due ore. Aggiungere iodoacetammide, IAM, a ciascun campione e incubare su ghiaccio al buio per due ore. Quindi, aggiungere la L-cisteina a ciascun campione e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.

Dopo 30 minuti, aggiungere il tampone tris con cloruro di calcio per diluire l'urea a una concentrazione finale di due molari. Aggiungere la tripsina trattata con L1 tosilimitotofeniletilcolero metilchetone a ciascun campione. E incubare a 37 gradi Celsius per 24 ore.

Il giorno seguente, estinguere la digestione delle proteine congelando il campione in azoto liquido e conservarlo a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius fino a ulteriore elaborazione. Prima della marcatura per dimetilazione, i campioni di peptidi vengono desalini, come descritto nel protocollo di testo, ed essiccati mediante centrifugazione sotto vuoto. Per iniziare la procedura di marcatura della dimetilazione, ricostituire i peptidi in acido acetico all'1% disciolto in HPLC o acqua di grado nanopuro.

Rimuovere una porzione da 50 microgrammi di ciascun campione in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Conservare il resto dei peptidi ricostituiti a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius per esperimenti futuri. Nelle fasi che verranno illustrate in seguito, è fondamentale aggiungere rapidamente i reagenti in modo che le reazioni chimiche abilitanti avvengano per lo stesso periodo di tempo per tutti i campioni.

Aggiungere otto microlitri di una soluzione di formaldeide da 60 millimolari ai campioni per la marcatura con dimetilazione leggera. Aggiungere otto microlitri di una soluzione di formaldeide marcata con carbonio 13 da 60 millimolari di deuterio ai campioni per la marcatura con forte dimetilazione. Aggiungere otto microlitri di cianoboroidruro di sodio da 24 millimolari ai campioni etichettati con dimetilazione leggera.

Aggiungere otto mircolitri di cianoboroduderide sodica da 24 millimolari ai campioni marcati con forte dimetilazione. Agitare i campioni, quindi agitare delicatamente su un agitatore per provette per circa 10 minuti a temperatura ambiente. Spegni le reazioni aggiungendo 16 microlitri di ammoniaca all'1% per cinque minuti.

Riacidificare le miscele di reazione aggiungendo otto microlitri di acido formico al 5%. Combina i peptidi dimetilati leggeri e pesanti per generare un totale di sei campioni. Eseguire la desalinizzazione del campione come descritto nel protocollo di testo.

E asciugare i campioni mediante centrifugazione sottovuoto. Per essere marcatura isobarica dei campioni dimetilati, in primo luogo, ricostituire 100 microgrammi di peptidi dimetilati e bicarbonato di trietilammonio, o tampone TEB. Successivamente, preparare i reagenti isobarici secondo il protocollo del produttore del kit di marcatura isobarica.

Aggiungere il volume appropriato, in questo caso, 41 microlitri del reagente di marcatura isobarica solubilizzato a ciascuno dei campioni di peptidi e agitare per circa 10 secondi. Agitare i campioni su un agitatore per provette da microcentrifuga per circa un'ora a temperatura ambiente. Per spegnere le reazioni, aggiungere 8 microlitri di idrossilammina a ciascun campione.

E incubare i campioni per 15 minuti a temperatura ambiente. Raggruppare i sei campioni etichettati in un'unica miscela e dissalare. Preparare i peptidi per la cromatotrofia liquida ricostituendo i peptidi in acqua di spettrometria di massa con acido formico allo 0,1%.

Aggiungere peptidi ricostituiti in una provetta da microcentrifuga contenente un filtro da 0,65 micrometri. E centrifugare a 12.000 volte g per un minuto. Rimuovere ed eliminare il filtro.

Trasferire i peptidi filtrati in una fiala dell'autocampionatore. Iniettare sei microlitri di ciascun campione di fazione a scambio cationico forte su una colonna trappola. Confezione a due centimetri con materiale in carbonio 18.

Eseguire i metodi di separazione analitica e spettrometro di massa per l'acquisizione dei dati. È stata eseguita un'analisi cPilot a 12 plessi di tessuti cerebrali, cardiaci ed epatici da un modello murino di Alzheimer e da controlli wild type. I dati dei precursori hanno mostrato peptidi dimetilati leggeri e pesanti rappresentati dai picchi a m/z 643,854 e 647,875.

Questi peptidi sono stati selezionati, isolati in modo indipendente e frammentati con dissociazione indotta dalla collusione per generare questi spettri. I risultati della ricerca hanno indicato che i picchi appartenevano a un peptide della proteina fosfoglicerato chinasi uno. Questi picchi sono stati ulteriormente isolati per la spettrometria di massa tandem con dissociazione collusionale ad alta energia e gli ioni reporter sono stati osservati come mostrato.

Entrambi i set di spettri di spettrometria di massa a triplo stadio sono necessari per ottenere informazioni sui 12 campioni. In questo esempio, i rapporti tra gli ioni di Alzheimer e quelli di controllo wild type sono simili tra le due repliche biologiche per cervello, fegato e tessuti cardiaci. I valori di variazione della piega per ogni confronto suggeriscono che i livelli di fosfogalierato chinasi uno nel cervello e nel cuore sono più alti nei topi con malattia di Alzheimer, ma più bassi nel fegato.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa cinque ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di fare attenzione alla manipolazione del campione. Incorporati in questa procedura, è possibile eseguire metodi di separazione come un forte scambio cationico o un frazionamento ad alto pH per aumentare la profondità e la copertura giornaliera.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come migliorare il multiplexing dei campioni utilizzando C-Pilot.