Cartografia molecolare a doppia modalità: integrazione del rilevamento multiplex dell'mRNA con la citometria di massa per imaging proteico

Ci concentriamo su una biologia speciale per comprendere meglio i meccanismi molecolari del cancro ovarico, nella speranza di trovare nuovi bersagli terapeutici e biomarcatori per prevedere la sopravvivenza del paziente. Una delle sfide attuali dell'IMC include la dissezione di proteine a minore abbondanza, il lavoro di validazione e titolazione degli anticorpi, nonché la classificazione dei pixel complessa e lunga durante l'analisi. Inizia rimuovendo il liquido in eccesso dalle vetrine preparate in FFPE.

Tira fuori la teglia per il controllo dell'umidità dal forno e metti il portalami nella teglia. Poi, si utilizza accuratamente l'amplificatore RNA-ISH 3 e aggiungi abbastanza reagente da coprire completamente ogni sezione di tessuto sulle vetrine. Chiudi la teglia e inseriscila nel forno di ibridazione per 30 minuti a 40 gradi Celsius.

Durante l'incubazione, preparare la miscela metallica di oligonucleotidi diluendo ogni oligo in un rapporto da uno a 15. Mescola accuratamente l'oligo metallico e lascialo a temperatura ambiente fino a un ulteriore utilizzo. Ora, togli la teglia per il controllo dell'umidità dal forno.

Togli il portalami dalla teglia e rimetti la teglia nel forno. Poi, posizionare le vetrine in un portavetri trasparente pre-lavato con acqua priva di nucleasi. Lava i vetri nel wash buffer con una leggera agitazione per due minuti.

Dopo aver rimosso il liquido in eccesso dalle lamelle, estrai la teglia per il controllo dell'umidità dal forno e metti il portavetrino nella teglia. Aggiungi gli oligonucleotidi metallici misti preparati in precedenza per coprire completamente ogni sezione di tessuto. Ora, chiudi completamente la teglia e inseriscila nel forno di ibridazione per 45 minuti a 40 gradi Celsius.

Rimuovi la teglia di controllo dell'umidità dal forno di ibridazione, togli il portaculi e riporta la teglia vuota nel forno. Per bloccare i siti di legame non specifici, aggiungere un volume sufficiente di tampone bloccante da coprire completamente ogni sezione di tessuto sul vetrino e incubare le vetrine a temperatura ambiente per 30 minuti. Mentre le vetrine sono in incubazione, prepara la miscela di anticorpi diluendo gli anticorpi usando il tampone diluente degli anticorpi.

Una volta terminata l'incubazione, si elimina il tampone dalle vetri tissutali e si dispensa abbastanza miscela di anticorpi preparata in precedenza da coprire completamente le sezioni di tessuto. Poi, posiziona i vetri in una camera di umidità e incubali durante la notte a quattro gradi Celsius. Per preparare una soluzione fresca di intercalatore Iridium, si effettua una diluizione da uno a 2.000 da una soluzione stock da 500 micromolari utilizzando TBS priva di RNasi.

Inserire i vetri in un portavetrino trasparente prelavato con acqua priva di nucleasi, e lavare i vetri in TBS-T buffer usando una leggera agitazione per cinque minuti. Poi, per tingere le vetrine, aggiungere la soluzione di lavoro di Iridio preparata e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopodiché, posiziona i vetrini in un portavetri trasparente che è stato pre-lavato con acqua priva di nucleasi.

Lava i vetri due volte nel tampone TBS-T con una leggera agitazione per cinque minuti. Poi, immergi rapidamente i vetrini in acqua doppiamente distillata per evitare la cristallizzazione del sale causato dal TBS sul tessuto. Asciuga i vetrini sotto un cappuccio chimico per 10 minuti e conservali a quattro gradi Celsius fino all'acquisizione dell'immagine.

Caricare il vetrino preparato nella camera di ablazione del sistema di citometria di massa per imaging. Acquisire un'immagine panoramica della diapositiva per identificare la regione di interesse. Utilizzando il software di acquisizione immagini, segna le regioni di interesse desiderate sull'immagine panoramica.

Applica il modello di acquisizione nel software di acquisizione delle immagini. E regolare la potenza del laser in base al tipo di campione. Ora, inizia il processo di ablazione laser.

Misurare la quantità di ciascun isotopo utilizzando il rivelatore, che converte i dati in formato digitale per l'analisi. Lo stato di attivazione delle cellule T CD8 è stato valutato utilizzando la co-rilevazione della granzima B sia a livello di mRNA che di proteine, insieme alla positività interferone-gamma. Un fibroblasto associato al cancro è stato dimostrato di esprimere la proteina MFAP5 e l'mRNA POSTN, entrambi marcatori dell'aggressività dei fibroblasti associata al cancro.

Una cellula T CD4 è stata dimostrata co-esprimere l'mRNA di IL17A e IL6, coerente con l'identità della cellula TH17. Sono stati osservati che le cellule T CD4 esprimono mRNA IL13. Cellule tumorali CD47-positive alla cheratina sono state esibite vicino a una cellula T CD8.

È stato dimostrato che una cellula T CD8 attivata esprime la proteina CD25. È stata osservata una colorazione comparabile con mRNA tra THBS2 e CD47 tra protocolli coniugati con metallo e marcati con fluorescente.