Name: Preparazione automatica del campione per lanalisi multiplexata delle modifiche post-traduzionali delle istane a singola (sc-hPTM2) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-19T13:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Scopri un metodo automatizzato per l'analisi multiplex delle modifiche post-traduzionali degli istoni a singola cellula. Questo protocollo consente profilazioni quantitative ad alta sensibilità della cromatina.

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<ol><li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Res. 21 (3), 381-395 (2011).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).</li>
<li>Sidoli, S., Bhanu, N. V., Karch, K. R., Wang, X., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+workflow+for+analysis+of+histone+post-translational+modifications+using+bottom-up+mass+spectrometry%3A+from+histone+extraction+to+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Complete workflow for analysis of histone post-translational modifications using bottom-up mass spectrometry: from histone extraction to data analysis.</a> J Vis Exp. (111), e54112(2016).</li>
<li>Budnik, B., Levy, E., Harmange, G., Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCoPE-MS%3A+mass+spectrometry+of+single+mammalian+cells+quantifies+proteome+heterogeneity+during+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell differentiation.</a> Genome Biol. 19 (1), 161(2018).</li>
<li>Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+protein+analysis+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-cell protein analysis by mass spectrometry.</a> Curr Opin Chem Biol. 60 (1), 1-9 (2021).</li>
<li>Leduc, A., Khoury, L., Cantlon, J., Khan, S., Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+sample+preparation+for+multiplexed+single-cell+proteomics+using+nPOP%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Massively parallel sample preparation for multiplexed single-cell proteomics using nPOP.</a> Nat Protoc. 19 (12), 3750-3776 (2024).</li>
<li>Lund, P. J., Kori, Y., Zhao, X., Sidoli, S., Yuan, Z. F., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotopic+labeling+and+quantitative+proteomics+of+acetylation+on+histones+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isotopic labeling and quantitative proteomics of acetylation on histones and beyond.</a> Methods Mol Biol. 1977 (1), 43-70 (2019).</li>
<li>Cutler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+profiling+of+single-cell+histone+post-translational+modifications+to+dissect+chromatin+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based profiling of single-cell histone post-translational modifications to dissect chromatin heterogeneity.</a> Nature Communications. , (2025).</li>
<li>Davie, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+histone+deacetylase+activity+by+butyrate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Inhibition of histone deacetylase activity by butyrate.</a> J Nutr. 133 (7 Suppl), 2485S-2493S (2003).</li>
<li>Stransky, S., Cutler, R., Aguilan, J., Nieves, E., Sidoli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+reversible+histone+acetylation+and+dynamics+in+gene+expression+regulation+using+3D+liver+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Investigation of reversible histone acetylation and dynamics in gene expression regulation using 3D liver spheroid model.</a> Epigenetics Chromatin. 15 (1), 35-35 (2022).</li>
<li>Stransky, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-automated+phenotypic+analysis+of+functional+3D+spheroid+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Semi-automated phenotypic analysis of functional 3D spheroid cell cultures.</a> J Vis Exp. (1), e65086(2023).</li>
<li>Yuan, Z. F., Sidoli, S., Marchione, D. M., Simithy, J., Janssen, K. A., Szurgot, M. R., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpiProfile+2.0%3A+a+computational+platform+for+processing+epi-proteomics+mass+spectrometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">EpiProfile 2.0: a computational platform for processing epi-proteomics mass spectrometry data.</a> J Proteome Res. 17 (7), 2533-2541 (2018).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Tubi microcentrifughe da 1,5 mL</td><td>Bio-Rad</td><td>2239480</td><td></td></tr><tr><td>1000 & micro; Punte a canna larga a L</td><td>Fisher Scientific</td><td>14222703</td><td></td></tr><tr><td>200 & micro; Punte a canna larga a L</td><td>Fisher Scientific</td><td>14222730</td><td></td></tr><tr><td>Placca PCR a 384 pozzi Lo Bind&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>30129547</td><td></td></tr><tr><td>Collettore a vuoto a 96 pozzi</td><td>Millipore</td><td>MAVM0960R</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile, grado Optima LC-MS/MS</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-1</td><td></td></tr><tr><td>Lamine adesive per piastre PCR</td><td>Thermo Fisher</td><td>AB0626</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile anidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA42311AK</td><td>Soluzione di stock per etichette e sfusi</td></tr><tr><td>Arg-C Ultra, grado Mass Spec</td><td>Promega</td><td>VA1831</td><td></td></tr><tr><td>Acqua di grado cellulare</td><td>Corning</td><td>25-055-CV</td><td></td></tr><tr><td>CellenVIALS</td><td>SCIENION</td><td>/</td><td>Il numero di catalogo è accompagnato da una citazione</td></tr><tr><td>DMSO, Anidro</td><td>Thermo Fisher</td><td>D12345</td><td>Soluzione di stock per etichette</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D0632-5G</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Eagle's Medium Modificato (DMEM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT17205CV</td><td></td></tr><tr><td>Siero bovino fetale</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT35010CV</td><td></td></tr><tr><td>Acido formico</td><td>Thermo</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>Acido formico 98%&ndash; 100% per LC-MS LiChropur</td><td>Sigma</td><td>5330020050</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT21022CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (Ultra Puro)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11344041</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile di grado HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>Acqua di grado HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>W5-4</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di idrossilamina 50&nbsp;t. % in H2O</td><td>Sigma</td><td>438227-50ML</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25015CI</td><td></td></tr><tr><td>Detergente n-Dodecyl-beta-Maltoside (DDM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BN2005</td><td></td></tr><tr><td>Amminoacidi non essenziali</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25025CI</td><td></td></tr><tr><td>Spettrometro di massa Orbitrap Exploris 480</td><td>Thermo Fisher</td><td>BRE725539</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide 16% Soluzione Acquosa di Grado EM</td><td>Scienze della microscopia elettronica</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>PDC-CM (rivestimento di tipo 2)</td><td>SCIENION</td><td>/</td><td>Il numero di catalogo è accompagnato da una citazione</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT3002CI</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), 10x, pH 7,4, senza RNasi</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>Perforazione Dimetilsolfossido (DMSO), grado LC-MS</td><td>Thermo Fisher</td><td>85190</td><td></td></tr><tr><td>Pistola a pipetta</td><td>Eppendorf</td><td>Z666467 (Milipore Sigma)</td><td></td></tr><tr><td>Anidride propionica &ge; 99%</td><td>Sigma</td><td>240311-50G</td><td></td></tr><tr><td>Anidride propionica-d10 & ge; 98 atomi % D, &ge; 99% (CP)</td><td>Sigma</td><td>615692-1G</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga refrigerata</td><td>Thermo</td><td>75-217-420</td><td></td></tr><tr><td>Vetri rivestiti SciCHIP H1</td><td>SCIENION</td><td>/</td><td>Il numero di catalogo è accompagnato da una citazione</td></tr><tr><td>Concentratore a vuoto SpeedVac (piastre a 96 pozzi)</td><td>Thermo</td><td>15308325</td><td>Savant SPD1010</td></tr><tr><td>Cappuccio sterile</td><td>Thermo</td><td>1375</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sierologiche sterili</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367549</td><td></td></tr><tr><td>Colorazione SYTOX Green Dead Cell, per citometria a flusso</td><td>Thermo Fisher</td><td>S34860</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1X), senza fenolo rosso</td><td>Thermo Fisher</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Vortice</td><td>Sigma</td><td>Z258415</td><td></td></tr><tr><td>Bagno d'acqua</td><td>Fisher Scientific</td><td>FSGPD10</td><td></td></tr></tbody></table>

preparazione automatica del campione per l'analisi multiplexata delle modifiche post-traduzionali delle istane a singola (sc-hptm2)

Automated Sample Preparation for the Multiplexed Analysis of Single-Cell Histone Post-Translational Modifications (sc-hPTM2)

Per dimostrare l'applicazione del nostro flusso di lavoro proteomico-istonico a singola cellula utilizzando il nostro sistema, abbiamo analizzato sferoidi di cellule HepG2/C3A trattate con 5 mM di butirato di sodio per 24 ore. Dopo l'acquisizione di LC-MS/MS, i dati grezzi sono stati processati con EpiProfile sia per la marcatura leggera (anidride propionica) sia per la marcatura pesante (anidride propionica-d10), ottenendo dati normalizzati che rappresentano le abbondanze dei peptidi e dei segni degli istoni. Il pacchet...

Preparazione automatica del campione per l'analisi multiplexata delle modifiche post-traduzionali delle istane a singola (sc-hPTM2)

Histone post-translational modifications (hPTMs) are central regulators of chromatin organization and gene expression. Their dysregulation is implicated ...

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Questo protocollo descrive un flusso di lavoro completamente integrato per la caratterizzazione di istone modificazioni post-traslazionali utilizzando la spettrometria di massa (MS). Il flusso di lavoro prevede la purificazione istone da colture di cellule o tessuti, istone derivatizzazione e la digestione, analisi MS utilizzando nano-flusso cromatografia liquida e le istruzioni per l'analisi dei dati. Il protocollo è stato progettato per il completamento entro 2 - 3 giorni.

Flusso di lavoro completo per l&#39;analisi dell&#39;istone modificazioni post-traduzionali Utilizzando Bottom-up Spettrometria di Massa: Da istone estrazione all&#39;analisi dei dati

Questo manoscritto descrive i metodi per applicare la tecnologia del microarray peptide alla profilazione di specificità degli anticorpi che riconoscono gli istoni e le loro modificazioni post-traslazionali.

Analisi della specificità degli anticorpi istonici con microarray di peptide

Lo scopo di questo articolo è quello di fornire una guida completa, sistematica per la purificazione efficiente degli istoni H3 e H4 e la quantificazione dei residui degli istoni acetilati.

Purificazione di H3 e H4 proteine istoniche e la quantificazione degli istoni acetilati marchi nelle cellule e tessuto cerebrale

Questo flusso di lavoro descrive contemporaneamente le prestazioni dell'arricchimento in termini di tempo ed efficiente in termini di costi di più modifiche post-traslazionali proteiche (PPM) per l'analisi proteomica globale quantitativa. Il protocollo utilizza l'arricchimento PTM a livello di peptide con più anticorpi coniugati, seguito dall'analisi della spettrometria di massa di acquisizione indipendente dai dati per ottenere informazioni biologiche sul crosstalk PTM.

Arricchimento simultaneo dell'affinità di due modifiche post-traduzionali per la quantificazione e la localizzazione del sito

Qui, gli autori mostrano l'utilità di MULTI-seq per la fenotipizzazione e il successivo accoppiato scRNA-seq e scATAC-seq nel caratterizzare i profili di accessibilità trascrittomica e cromatina nella retina.

Analisi multiplexata dell'espressione genica retinica e dell'accessibilità alla cromatina utilizzando scRNA-Seq e scATAC-Seq

Questo protocollo delinea come un sistema di coltura cellulare tridimensionale può essere utilizzato per modellare, trattare e analizzare le modifiche della cromatina in uno stato quasi fisiologico.

Quantificazione a livello globale delle modifiche post-traduzionali degli istoni in un modello di coltura cellulare 3D del tessuto epatico

Questo lavoro descrive un protocollo per la quantificazione delle modificazioni istoniche globali utilizzando la citometria a flusso intranucleare in microglia cerebrali isolate. Il lavoro contiene anche il protocollo di isolamento della microglia che è stato utilizzato per la raccolta dei dati.

Quantificazione delle modificazioni post-traduzionali degli istoni globali utilizzando la citometria a flusso intranucleare nella microglia cerebrale di topo isolata

Un flusso di lavoro analitico basato sulla cromatografia liquida, sulla spettrometria di mobilità ionica intrappolata e sulla spettrometria di massa a tempo di volo (LC-TIMS-TOF MS/MS) per un'analisi "bottom-up" ad alta affidabilità e altamente riproducibile delle modificazioni istoniche e l'identificazione in base ai parametri principali (tempo di ritenzione [RT], sezione d'urto di collisione [CCS] e rapporto massa-carica [m/z] accurato).

Screening della modificazione degli istoni mediante cromatografia liquida, spettrometria di mobilità ionica intrappolata e spettrometria di massa a tempo di volo

Questo protocollo consente un'estrazione efficiente degli istoni da vari campioni clinici per una successiva analisi di modifiche post-traduzionali tramite LC-MS/MS. Facilitando una rilevazione robusta delle principali modifiche agli istoni, rappresenta uno strumento prezioso per un profiling epigenetico completo in grandi coorti cliniche.

Estrazione degli istoni da campioni clinici per profilazione epigenetica tramite spettrometria di massa

Varianti genetiche nel membro umano della famiglia Spindlin 4 (SPIN4) sono state recentemente identificate in pazienti con sovracrescita ossea, un nuovo disturbo dello sviluppo. Vengono presentati un protocollo e nuovi risultati che descrivono l'identificazione biochimica degli istones modificati nel contesto dei nucleosomi come substrati di legame allo SPIN4.

Identificazione degli istoni modificati come substrati di legame del membro della famiglia spindlina umana 4 (SPIN4) tramite array peptidici e pulldown dei nucleosomi nativi

Questo studio presenta un protocollo multioma spaziale Trekker–CUT&amp;Tag che combina il codice a barre spaziale diretto di una sezione tissutale con l'analisi multioma a singola cellula. Questo approccio consente contemporaneamente la profilazione spaziale dell'espressione genica a singola cellula e la modifica dell'istone H3K27ac, offrendo intuizioni meccanicistiche sulla regolazione genica nel contesto della microanatomia tissutale.

Profilazione multiomica integrata a singola singola e risolta spazialmente del trascricroma e dei bersagli epigenomici nelle sezioni di tessuto congelato

Scopri un metodo automatizzato per l'analisi multiplex delle modifiche post-traduzionali degli istoni a singola cellula. Questo protocollo consente profilazioni quantitative ad alta sensibilità della cromatina.

Preparazione automatica del campione per lanalisi multiplexata delle modifiche post-traduzionali delle istane a singola (sc-hPTM2) (Video) | JoVE Journal

Preparazione automatica del campione per l'analisi multiplexata delle modifiche post-traduzionali delle istane a singola (sc-hPTM2)

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