Preparazione automatica del campione per l'analisi multiplexata delle modifiche post-traduzionali delle istane a singola (sc-hPTM2)

Stiamo facendo avanzare la proteomica a singola cellula con un metodo multiplex automatizzato per studiare l'eterogeneità globale della cromatina per modifiche post-traduzionali. Ciò che rende questo protocollo impegnativo è la preparazione proteomica su scala picogrammica, la marcatura multiplex e la risoluzione di peptidi istoni complessi modificati combinatori. Per cominciare, ricostituire le cellule epatocellulari del carcinoma epatocellulare dell'epatite G2/C3A a una concentrazione finale di 200-500 cellule per microlitro in PBS gelato.

Imposta la larghezza dell'impulso e la tensione di trasmissione di ogni ugello ai valori forniti dal produttore. Per la massima efficienza del pickup, assicurarsi che lo spostamento Z tra i due ugelli differisca di meno di 50 micrometri. Identifica la posizione ottimale di contatto per ciascun ugello e confronta le letture dell'altezza Z nella scheda di configurazione dell'ugello.

Per lo schema di multiplexing tuplex, carica una singola carrella sul portacarrelle nel cappuccio e poi trasferiscila allo strumento. Utilizzando una pipetta, inserisci 150 microlitri di DMSO di grado LCMS in un nuovo tubo PCR. Posizionalo in posizione due della stazione di lavaggio con il tappo del tubo rivolto verso la porta dello strumento.

Inizia la run DMSO. Ottieni un drop stabile una volta che il DMSO è stato aspirato. Nota il cambiamento nella trasparenza del PDC.

Potrebbe essere necessario aumentare la tensione. Verifica la stabilità effettuando un controllo del volume di caduta. Esegui la configurazione del head camera wizard per allineare la fotocamera.

Distribuire DMSO e permettere allo strumento di svuotare automaticamente gli ugelli e catturare immagini su tutte le slide per il controllo qualità. Esamina queste immagini per verificare una goccia DMSO uniforme su ogni vetrina e per verificare la presenza di gocce mancanti o fuori bersaglio. Dopo aver aspirato la sospensione della cella, apri la cella in un modulo, esegui una cattura di background e poi esegui la routine di mappatura per definire la zona di espulsione.

Esegui l'analisi e poi porta le particelle per selezionare le celle in base alla dimensione e all'allungamento. Ora, prepara un mix master di digestione fresco in acqua di grado LCMS. Degas la soluzione con una pompa a vuoto per 10 minuti sul ghiaccio.

Dopo aver dispensato la miscela digeritiva sulle vetrine, lascia che lo strumento risciacqui automaticamente gli ugelli e fotografi ogni vetrina. Esamina le immagini per verificare che ogni goccia riceva uniformemente il mix digestivo. Incubare le vetri a temperatura ambiente durante la notte per effettuare la digestione.

Dopo aver iniziato la fase di evaporazione e la digestione notturna, ispezionare le immagini. Se le gocce sono sufficientemente asciutte, ferma la corsa. Se no, clicca continua e asciuga per altri cinque minuti.

Per l'etichettatura, si preparano prima soluzioni stock per la derivazione multiplexata degli istoni. Dopo la dispensazione, lascia che lo strumento risciacqui automaticamente gli ugelli e fotografa ogni vetrina. Esamina le immagini per confermare una distribuzione uniforme e la corretta posizione delle gocce su tutte le vetrine.

Dopo l'incubazione, si dispensa la soluzione di idrossilamina per la tempra. Per raccogliere il campione, seleziona la run nella scheda principale e poi inizia la run nella scheda run. Dopo aver terminato il ritiro, controlla le immagini per verificare eventuali errori.

Una volta finito con il pickup, rimuovi il coperchio dalla piastra del pickup. Poi asciuga i campioni a bassa temperatura in un concentratore a vuoto. Per l'acquisizione dei dati, programmare il metodo di cromatografia liquida ad alte prestazioni.

Imposta l'esperimento MS due per contenere finestre di isolamento di sovraccarico di massa di 50%, dissociazione di collisione ad alta energia del 27% e obiettivo automatico di controllo del guadagno del 1000%. Copri la piastra con un tappetino di guarnizione in gomma e posizionala all'interno dell'auto campionatore. Dopo aver ottenuto i file grezzi, controlla brevemente il cromatogramma e poi esegui i dati grezzi nella versione 2.1 di EpiProfile. Rivedere la tabella di output delle abbondanze normalizzate degli istoni PTM e usarla per le analisi a valle.

I primi 20 peptidoformi H3 di istoria sono stati quantificati, mostrando le loro abbondanze relative in condizioni di controllo e trattate con butirato di sodio. Sia l'acetilazione di H3K9 che quella di H3 K14 hanno mostrato maggiore abbondanza relativa durante il trattamento con butirato di sodio. Mentre l'acetilazione H3 K9, l'acetilazione K14 appariva ancora più arricchita nelle cellule trattate.

I livelli totali di acetilazione sono aumentati dopo il trattamento con butirato di sodio, con cellule trattate che hanno mostrato una distribuzione degli errori più ampia rispetto ai controlli, riflettendo la maggiore eterogeneità catturata a livello di singola cellula. La quantificazione delle modifiche degli istoni singoli e co-presenti ha dimostrato che gli stati di acetilazione combinatoria sono stati maggiormente influenzati dal butirato di sodio. La maggiore dispersione delle cellule trattate con butirato di sodio ha indicato una maggiore eterogeneità biologica tra le singole cellule all'interno degli sferoidi.

Questo protocollo colma il divario nella ricerca epigenetica permettendo agli scienziati di studiare gli stati della cromatina in soluzione a singola cellula. Questo flusso di lavoro consente la preparazione di campioni ad alto rendimento, il multiplexing del campione e la spettrometria di massa imparziale per produrre sia dati epigenetici cellulari singole sensibili che quantitativi. Ricerche future esploreranno come la regolazione della cromatina stia alterando stati patologici come il cancro, le malattie metaboliche e l'invecchiamento.