Preparazione automatica del campione per l'analisi multiplexata delle modifiche post-traduzionali delle istane a singola (sc-hPTM2)
December 19th, 2025
Qui presentiamo un protocollo per automatizzare l'analisi post-traduzionale delle modifiche degli istoni a singola cellula utilizzando una strategia di marcatura isotopica a due plex e la digestione ArgC. Questo flusso di lavoro consente un profiling quantitativo, riproducibile e ad alta sensibilità dell'eterogeneità della cromatina e delle risposte epigenetiche a risoluzione di singola cellula.
Stiamo facendo avanzare la proteomica a singola cellula con un metodo multiplex automatizzato per studiare l'eterogeneità globale della cromatina per modifiche post-traduzionali. Ciò che rende questo protocollo impegnativo è la preparazione proteomica su scala picogrammica, la marcatura multiplex e la risoluzione di peptidi istoni complessi modificati combinatori. Per cominciare, ricostituire le cellule epatocellulari del carcinoma epatocellulare dell'epatite G2/C3A a una concentrazione finale di 200-500 cellule per microlitro in PBS gelato.
Imposta la larghezza dell'impulso e la tensione di trasmissione di ogni ugello ai valori forniti dal produttore. Per la massima efficienza del pickup, assicurarsi che lo spostamento Z tra i due ugelli differisca di meno di 50 micrometri. Identifica la posizione ottimale di contatto per ciascun ugello e confronta le letture dell'altezza Z nella scheda di configurazione dell'ugello.
Per lo schema di multiplexing tuplex, carica una singola carrella sul portacarrelle nel cappuccio e poi trasferiscila allo strumento. Utilizzando una pipetta, inserisci 150 microlitri di DMSO di grado LCMS in un nuovo tubo PCR. Posizionalo in posizione due della stazione di lavaggio con il tappo del tubo rivolto verso la porta dello strumento.
Inizia la run DMSO. Ottieni un drop stabile una volta che il DMSO è stato aspirato. Nota il cambiamento nella trasparenza del PDC.
Potrebbe essere necessario aumentare la tensione. Verifica la stabilità effettuando un controllo del volume di caduta. Esegui la configurazione del head camera wizard per allineare la fotocamera.
Distribuire DMSO e permettere allo strumento di svuotare automaticamente gli ugelli e catturare immagini su tutte le slide per il controllo qualità. Esamina queste immagini per verificare una goccia DMSO uniforme su ogni vetrina e per verificare la presenza di gocce mancanti o fuori bersaglio. Dopo aver aspirato la sospensione della cella, apri la cella in un modulo, esegui una cattura di background e poi esegui la routine di mappatura per definire la zona di espulsione.
Esegui l'analisi e poi porta le particelle per selezionare le celle in base alla dimensione e all'allungamento. Ora, prepara un mix master di digestione fresco in acqua di grado LCMS. Degas la soluzione con una pompa a vuoto per 10 minuti sul ghiaccio.
Dopo aver dispensato la miscela digeritiva sulle vetrine, lascia che lo strumento risciacqui automaticamente gli ugelli e fotografi ogni vetrina. Esamina le immagini per verificare che ogni goccia riceva uniformemente il mix digestivo. Incubare le vetri a temperatura ambiente durante la notte per effettuare la digestione.
Dopo aver iniziato la fase di evaporazione e la digestione notturna, ispezionare le immagini. Se le gocce sono sufficientemente asciutte, ferma la corsa. Se no, clicca continua e asciuga per altri cinque minuti.
Per l'etichettatura, si preparano prima soluzioni stock per la derivazione multiplexata degli istoni. Dopo la dispensazione, lascia che lo strumento risciacqui automaticamente gli ugelli e fotografa ogni vetrina. Esamina le immagini per confermare una distribuzione uniforme e la corretta posizione delle gocce su tutte le vetrine.
Dopo l'incubazione, si dispensa la soluzione di idrossilamina per la tempra. Per raccogliere il campione, seleziona la run nella scheda principale e poi inizia la run nella scheda run. Dopo aver terminato il ritiro, controlla le immagini per verificare eventuali errori.
Una volta finito con il pickup, rimuovi il coperchio dalla piastra del pickup. Poi asciuga i campioni a bassa temperatura in un concentratore a vuoto. Per l'acquisizione dei dati, programmare il metodo di cromatografia liquida ad alte prestazioni.
Imposta l'esperimento MS due per contenere finestre di isolamento di sovraccarico di massa di 50%, dissociazione di collisione ad alta energia del 27% e obiettivo automatico di controllo del guadagno del 1000%. Copri la piastra con un tappetino di guarnizione in gomma e posizionala all'interno dell'auto campionatore. Dopo aver ottenuto i file grezzi, controlla brevemente il cromatogramma e poi esegui i dati grezzi nella versione 2.1 di EpiProfile. Rivedere la tabella di output delle abbondanze normalizzate degli istoni PTM e usarla per le analisi a valle.
I primi 20 peptidoformi H3 di istoria sono stati quantificati, mostrando le loro abbondanze relative in condizioni di controllo e trattate con butirato di sodio. Sia l'acetilazione di H3K9 che quella di H3 K14 hanno mostrato maggiore abbondanza relativa durante il trattamento con butirato di sodio. Mentre l'acetilazione H3 K9, l'acetilazione K14 appariva ancora più arricchita nelle cellule trattate.
I livelli totali di acetilazione sono aumentati dopo il trattamento con butirato di sodio, con cellule trattate che hanno mostrato una distribuzione degli errori più ampia rispetto ai controlli, riflettendo la maggiore eterogeneità catturata a livello di singola cellula. La quantificazione delle modifiche degli istoni singoli e co-presenti ha dimostrato che gli stati di acetilazione combinatoria sono stati maggiormente influenzati dal butirato di sodio. La maggiore dispersione delle cellule trattate con butirato di sodio ha indicato una maggiore eterogeneità biologica tra le singole cellule all'interno degli sferoidi.
Questo protocollo colma il divario nella ricerca epigenetica permettendo agli scienziati di studiare gli stati della cromatina in soluzione a singola cellula. Questo flusso di lavoro consente la preparazione di campioni ad alto rendimento, il multiplexing del campione e la spettrometria di massa imparziale per produrre sia dati epigenetici cellulari singole sensibili che quantitativi. Ricerche future esploreranno come la regolazione della cromatina stia alterando stati patologici come il cancro, le malattie metaboliche e l'invecchiamento.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per l'automazione dell'analisi delle modificazioni post-traduzionali degli istoni a singola cellula utilizzando una strategia di etichettatura isotopica two-plex. Il flusso di lavoro consente un profilaggio quantitativo e ad alta sensibilità dell'eterogeneità della cromatina a risoluzione di singola cellula.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Proteomica a singola cellula
- Modificazioni post-traduzionali degli istoni
- Analisi della cromatina
Contesto
- L'analisi a singola cellula è cruciale per comprendere l'eterogeneità cellulare.
- Le modificazioni post-traduzionali giocano un ruolo chiave nella regolazione della struttura e della funzione della cromatina.
- I metodi automatizzati possono migliorare la riproducibilità e la sensibilità negli studi proteomici.
- Le sfide includono la gestione di campioni di piccole dimensioni e miscele di peptidi complesse.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un protocollo robusto per analizzare le modificazioni degli istoni a risoluzione di singola cellula.
- Migliorare l'efficienza dell'etichettatura multiplo nei flussi di lavoro proteomici.
- Affrontare le sfide dei peptidi istonici a bassa abbondanza.
Metodi utilizzati
- Ricostruzione delle cellule Hep G2/C3A in PBS a una concentrazione specifica.
- Aggiustamento dei parametri dell'ugello per un prelievo ottimale del campione.
- Implementazione dell'etichettatura isotopica two-plex per la quantificazione.
- Utilizzo della digestione con ArgC per la preparazione dei peptidi.
Risultati principali
- Automazione di successo dell'analisi delle modificazioni degli istoni a singola cellula.
- Alta sensibilità e riproducibilità dimostrate nel profilaggio.
- Risoluzione efficace di peptidi istonici modificati combinatoriamente complessi.
- Intuition sull'eterogeneità della cromatina e sulle risposte epigenetiche.
Conclusioni
- Il protocollo sviluppato migliora lo studio della dinamica della cromatina a risoluzione di singola cellula.
- L'automazione migliora significativamente l'efficienza dell'analisi delle modificazioni degli istoni.
- Questo metodo può essere applicato a varie domande biologiche riguardanti l'epigenetica.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Automated single-cell histone PTM analysis addresses the critical challenge of resolving chromatin heterogeneity and epigenetic regulation at cellular resolution. This workflow enhances predictive confidence in early discovery by enabling quantitative, multiplexed profiling of histone modifications across individual cells. The approach supports risk-adjusted portfolio decisions by providing high-content, reproducible data on epigenetic states relevant to disease and therapeutic modulation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of chromatin regulatory mechanisms at the single-cell level.
- Supports functional target validation by quantifying histone PTM changes in response to perturbations.
- Facilitates mechanistic de-risking through direct measurement of epigenetic heterogeneity.
- Improves predictive confidence for target selection and triage in epigenetic drug discovery.
Screening & Assay Development
- Prepares validated single-cell systems for downstream screening of epigenetic modulators.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative histone PTM readouts for assay development.
- Enables multiplexed comparison of treatment conditions using isotopic labeling strategies.
- Supports scalable, high-throughput workflows for compound evaluation in chromatin biology.
Translational & Preclinical Research
- Aligns single-cell epigenetic profiling with disease-relevant models such as tumor spheroids.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by capturing cellular heterogeneity in response to therapeutic agents.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative chromatin state data.
- Supports translational biomarker identification for epigenetic drug development.
Pipeline & Workflow Integration
This automated protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling high-content, quantitative analysis of histone PTMs at single-cell resolution.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving cell-to-cell chromatin variability.
- Screening: Provides assay-ready, multiplexed outputs for robust compound screening and comparison.
- Analytics: Delivers quantitative, normalized histone PTM abundance tables for statistical analysis and condition comparison.
- Translational Research: Connects single-cell epigenetic data to disease models and therapeutic response evaluation.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, automated capability for ongoing epigenetic profiling across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in chromatin-targeted discovery.
- Operational Value: Standardizes and automates sample preparation for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by providing high-content, quantitative data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of epigenetic targets and compounds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-cell proteomics and mass spectrometry data analysis.
- Needs access to automated nano liquid handling and high-resolution LC-MS instrumentation.
- Demands cross-team standardization for sample preparation and data processing workflows.
- Adaptation may be needed for different cell types or disease models.
- Throughput and sensitivity are limited by instrument capacity and sample handling precision.
