Name: Proteoma profonda profilatura di etichettatura isobarico, vasto cromatografia liquida, spettrometria di massa e quantificazione assistita da Software (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Scopri la profilazione proteomica profonda con etichettatura isobarica, cromatografia liquida estesa e spettrometria di massa ad alta risoluzione. Questo metodo computazionale consente di quantificare oltre 10.000 proteine per la ricerca sui biomarcatori.

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Gli autori ringraziano tutti gli altri membri lab e impianto per utile discussione. Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto da NI H concede ALSAC, R01AG047928, R01AG053987 e R01GM114260. L'analisi di MS è stata eseguita in Research Hospital proteomica Facility di St. Jude Children, parzialmente sostenuto da NIH Cancer Center Support grant P30CA021765. Gli autori ringraziano Nisha Badders per aiuto con il manoscritto di editing.

<ol><li>Pagala, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+protein+analysis+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative protein analysis by mass spectrometry.</a> Methods Mol Biol. 1278, 281-305 (2015).</li>
<li>Altelaar, A. F., Munoz, J., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+proteomics%3A+towards+an+integrative+view+of+proteome+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Next-generation proteomics: towards an integrative view of proteome dynamics.</a> Nat Rev Genet. 14 (1), 35-48 (2013).</li>
<li>Rauniyar, N., Yates, J. R. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isobaric+labeling-based+relative+quantification+in+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics.</a> J Proteome Res. 13 (12), 5293-5309 (2014).</li>
<li>Ross, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).</li>
<li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometric+exploration+of+proteome+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function.</a> Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).</li>
<li>Bai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+Profiling+of+Proteome+and+Phosphoproteome+by+Isobaric+Labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Extensive+Liquid+Chromatography%2C+and+Mass+Spectrometry.+Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Deep Profiling of Proteome and Phosphoproteome by Isobaric Labeling.</a> Extensive Liquid Chromatography, and Mass Spectrometry. Methods Enzymol. 585, 377-395 (2017).</li>
<li>McAlister, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+the+multiplexing+capacity+of+TMTs+using+reporter+ion+isotopologues+with+isobaric+masses%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses.</a> Anal Chem. 84 (17), 7469-7478 (2012).</li>
<li>Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+throughput+in+targeted+proteomics+assays%3A+54-plex+quantitation+in+a+single+mass+spectrometry+run%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Increasing throughput in targeted proteomics assays: 54-plex quantitation in a single mass spectrometry run.</a> Anal Chem. 85 (11), 5340-5346 (2013).</li>
<li>Bai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+approaches+for+analyzing+U1-70K+cleavage+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Integrated approaches for analyzing U1-70K cleavage in Alzheimer's disease.</a> J Proteome Res. 13 (11), 4526-4534 (2014).</li>
<li>Bai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U1+small+nuclear+ribonucleoprotein+complex+and+RNA+splicing+alterations+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).</li>
<li>Thongboonkerd, V., LaBaer, J., Domont, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+of+proteomics+applied+to+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Recent advances of proteomics applied to human diseases.</a> J Proteome Res. 13 (11), 4493-4496 (2014).</li>
<li>Churchman, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+Retinoids+in+IKZF1-Mutated+BCR-ABL1+Acute+Lymphoblastic+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Efficacy of Retinoids in IKZF1-Mutated BCR-ABL1 Acute Lymphoblastic Leukemia.</a> Cancer Cell. 28 (3), 343-356 (2015).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Joint+mouse-human+phenome-wide+association+to+test+gene+function+and+disease+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Joint mouse-human phenome-wide association to test gene function and disease risk.</a> Nat Commun. 7, 10464(2016).</li>
<li>Mertz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+elution+interactome+analysis+of+the+Mind+bomb+1+ubiquitin+ligase+reveals+a+novel+role+in+dendritic+spine+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Sequential elution interactome analysis of the Mind bomb 1 ubiquitin ligase reveals a novel role in dendritic spine outgrowth.</a> Mol Cell Proteomics. 14 (7), 1898-1910 (2015).</li>
<li>Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G. 2nd, Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-pH+reversed-phase+chromatography+with+fraction+concatenation+for+2D+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis.</a> Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+off-line+high+pH+reversed-phase+fractionation+and+nano-liquid+chromatography-mass+spectrometry+method+for+global+proteomic+profiling+of+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Analyt+Technol+Biomed+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">An off-line high pH reversed-phase fractionation and nano-liquid chromatography-mass spectrometry method for global proteomic profiling of cell lines.</a> J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 974, 90-95 (2015).</li>
<li>Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-line+high-pH+reversed-phase+fractionation+for+in-depth+phosphoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics.</a> J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).</li>
<li>Song, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversed-phase-reversed-phase+liquid+chromatography+approach+with+high+orthogonality+for+multidimensional+separation+of+phosphopeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Reversed-phase-reversed-phase liquid chromatography approach with high orthogonality for multidimensional separation of phosphopeptides.</a> Anal Chem. 82 (1), 53-56 (2010).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+optimization+of+long+gradient+chromatography+mass+spectrometry+for+deep+analysis+of+brain+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Systematic optimization of long gradient chromatography mass spectrometry for deep analysis of brain proteome.</a> J Proteome Res. 14 (2), 829-838 (2015).</li>
<li>Hebert, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+one+hour+yeast+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The one hour yeast proteome.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (1), 339-347 (2014).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JUMP%3A+a+tag-based+database+search+tool+for+peptide+identification+with+high+sensitivity+and+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">JUMP: a tag-based database search tool for peptide identification with high sensitivity and accuracy.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3663-3673 (2014).</li>
<li>Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematical+optimization+of+reverse-phase+chromatography+for+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Systematical optimization of reverse-phase chromatography for shotgun proteomics.</a> J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).</li>
<li>Niu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+Peptide+Fractionation+and+y1+Ion-Based+Interference+Detection+Method+for+Enabling+Accurate+Quantification+by+Isobaric+Labeling+and+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Extensive Peptide Fractionation and y1 Ion-Based Interference Detection Method for Enabling Accurate Quantification by Isobaric Labeling and Mass Spectrometry.</a> Anal Chem. 89 (5), 2956-2963 (2017).</li>
<li>Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MS3+eliminates+ratio+distortion+in+isobaric+multiplexed+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics.</a> Nat Methods. 8 (11), 937-940 (2011).</li>
<li>Savitski, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+fragmentation+and+optimized+isolation+width+settings+for+improvement+of+protein+identification+and+accuracy+of+isobaric+mass+tag+quantification+on+Orbitrap-type+mass+spectrometers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers.</a> Anal Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).</li>
<li>Wenger, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas-phase+purification+enables+accurate%2C+multiplexed+proteome+quantification+with+isobaric+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Gas-phase purification enables accurate, multiplexed proteome quantification with isobaric tagging.</a> Nat Methods. 8 (11), 933-935 (2011).</li>
<li>McAlister, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MultiNotch+MS3+enables+accurate%2C+sensitive%2C+and+multiplexed+detection+of+differential+expression+across+cancer+cell+line+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">MultiNotch MS3 enables accurate, sensitive, and multiplexed detection of differential expression across cancer cell line proteomes.</a> Anal Chem. 86 (14), 7150-7158 (2014).</li>
<li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+proteome+quantification+by+DEEP+SEQ+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Genome-scale proteome quantification by DEEP SEQ mass spectrometry.</a> Nat Commun. 4, 2171(2013).</li>
<li>Savitski, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+fragmentation+and+optimized+isolation+width+settings+for+improvement+of+protein+identification+and+accuracy+of+isobaric+mass+tag+quantification+on+Orbitrap-type+mass+spectrometers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers.</a> Anal. Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).</li>
<li>Ahrne, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+Improvement+of+Quantification+Accuracy+in+Isobaric+Mass+Tag-Based+Protein+Quantification+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation and Improvement of Quantification Accuracy in Isobaric Mass Tag-Based Protein Quantification Experiments.</a> J Proteome Res. 15 (8), 2537-2547 (2016).</li>
<li>Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematical+Optimization+of+Reverse-Phase+Chromatography+for+Shotgun+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Systematical Optimization of Reverse-Phase Chromatography for Shotgun Proteomics.</a> J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).</li>
<li>Tan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Proteomics+and+Phosphoproteomics+Profiling+Reveals+Dynamic+Signaling+Networks+and+Bioenergetics+Pathways+Underlying+T+Cell+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Integrative Proteomics and Phosphoproteomics Profiling Reveals Dynamic Signaling Networks and Bioenergetics Pathways Underlying T Cell Activation.</a> Immunity. 46 (3), 488-503 (2017).</li>
<li>Wu, Z., Na, C. H., Tan, H., Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+ubiquitination+analysis+by+SILAC+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Global ubiquitination analysis by SILAC in mammalian cells.</a> Methods Mol Biol. 1188, 149-160 (2014).</li>
<li>Tan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refined+phosphopeptide+enrichment+by+phosphate+additive+and+the+analysis+of+human+brain+phosphoproteome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Refined phosphopeptide enrichment by phosphate additive and the analysis of human brain phosphoproteome.</a> Proteomics. 15 (2-3), 500-507 (2015).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JUMPg%3A+an+Integrative+Proteogenomics+Pipeline+Identifying+Unannotated+Proteins+in+Human+Brain+and+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">JUMPg: an Integrative Proteogenomics Pipeline Identifying Unannotated Proteins in Human Brain and Cancer Cells.</a> J Proteome Res. 17 (7), 2309-2320 (2016).</li>
<li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+clinical+utility+of+cancer+genomic+and+proteomic+data+across+tumor+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Assessing the clinical utility of cancer genomic and proteomic data across tumor types.</a> Nat Biotechnol. 32 (7), 644-652 (2014).</li>
<li>Nesvizhskii, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteogenomics%3A+concepts%2C+applications+and+computational+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Proteogenomics: concepts, applications and computational strategies.</a> Nat Methods. 11 (11), 1114-1125 (2014).</li>
<li>Fagerberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+human+tissue-specific+expression+by+genome-wide+integration+of+transcriptomics+and+antibody-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Descriviamo un protocollo ad alta velocità per la quantificazione delle proteine con una strategia di etichettatura isobarica 10-plex, che è stata implementata con successo in diverse pubblicazioni12,13,14,32 . In questo protocollo, possiamo analizzare fino a 10 campioni biologici differenti della proteina nell'1 esperimento. Ordinariamente possiamo identificare e quantificare ben oltre 10.000 ...

Gli avanzamenti nella tecnologia di sequenziamento di nuova generazione hanno portato ad un nuovo paesaggio per lo studio di sistemi biologici e malattia umana. Questo ha permesso un gran numero di misurazioni del genoma, trascrittoma, proteoma, metaboloma e altri sistemi molecolari a diventare tangibili. Spettrometria di massa (MS) è uno dei metodi più sensibili in chimica analitica, e la sua applicazione in proteomica ha rapidamente ampliato dopo il sequenziamento del genoma umano. Nel campo della proteomica, da alcuni anni hanno prodotto importanti progressi tecnici nella basata su MS-analisi quantitative, tra cui isobarica etichettatura e multiplexing capacità combinata con cromatografia liquida estesa, oltre alla strumentazione avanza, consentendo più veloce, più accurate misurazioni con meno materiale di campione richiesto. Proteomica quantitativa è diventati un approccio tradizionale per la profilatura di decine di migliaia di proteine e modifiche di posttranslational in campioni biologici altamente complessi1,2,3,4 , 5 , 6.
Metodi d'etichettatura isobariche multiplex ad esempio tag Isobarico per quantificazione relativa e assoluta (cioè, iTRAQ) e tag di massa tandem (TMT) MS hanno notevolmente migliorato la produttività del campione e aumentato il numero di campioni che possono essere analizzati in un unico esperimento1,6,7,8. Insieme con altri metodi di quantificazione basati su MS, come quantificazione privo di etichetta ed etichettatura con gli amminoacidi nella coltura delle cellule (cioè, SILAC), il potenziale di queste tecniche nella proteomica dell'isotopo stabile campo è notevole9 ,10,11. Ad esempio, il metodo TMT permette 10 campioni di proteine da analizzare insieme in 1 esperimento utilizzando reagenti 10-plex. Questi tag TMT strutturalmente identici hanno la stessa massa complessiva, ma isotopi pesanti differenzialmente sono distribuiti su atomi di carbonio o azoto, risultante in un ione unico reporter durante frammentazione MS/MS di ogni tag, consentendo pertanto una quantificazione relativa tra i 10 campioni. La strategia TMT è ordinariamente applicata per studiare vie biologiche, progressione di malattia e di processi cellulari12,13,14.
Notevoli miglioramenti tecnici sono migliorati sistemi di cromatografia liquida (LC)-MS/MS, sia in termini di LC separazioni e parametri di MS, per massimizzare l'identificazione della proteina senza sacrificare la precisione di quantificazione. Prima dimensione separazione dei peptidi mediante una tecnica di separazione con alta ortogonalità per la seconda dimensione è fondamentale in questo tipo di metodo di proteomica di fucile da caccia per ottenere i massimi risultati20. Cromatografia liquida a fase inversa ad alta pH (RPLC) offre prestazioni migliori rispetto a convenzionali scambio cationico forte cromatografia20. Quando alto pH RPLC è combinata con una seconda dimensione di basso pH RPLC, sia analitico gamma dinamica e la copertura della proteina sono migliorate, conseguente la capacità di identificare la maggior parte delle proteine espresse durante l'esecuzione di analisi intero proteoma15 ,16,17,18. Altri progressi tecnici includono piccole particelle C18 (1,9 µm) ed esteso lungo colonna (~ 1 m)19. Inoltre, altri miglioramenti importanti sono nuove versioni di spettrometri di massa con velocità di scansione rapida, una migliore sensibilità e risoluzione20e bioinformatica sofisticata pipeline per MS dati mining21.
Qui, descriviamo un protocollo dettagliato che incorpora le più recenti metodologie con modifiche per migliorare la sensibilità e la velocità effettiva, mentre ci si concentra sui meccanismi di controllo di qualità in tutto l'esperimento. Il protocollo comprende estrazione di proteine e digestione, TMT 10-plex etichettatura, pH di base e frazionamento RPLC pH acido, ad alta risoluzione MS rilevamento ed elaborazione di dati di MS (Figura 1). Inoltre, realizziamo diversi passaggi di controllo di qualità per la risoluzione dei problemi e valutare la variazione sperimentale. Questo protocollo dettagliato è destinato ad aiutare i ricercatori nuovi al campo ordinariamente identificare e quantificare con precisione migliaia di proteine da un lisato o tessuto.

<table><tbody><tr><td>Sistema LC 1220</td><td>Agilent</td><td>G4288B</td><td></td></tr><tr><td>50% Idrossilammina</td><td>Thermo Scientific</td><td>90115</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Burdick & Jackson</td><td>AH015-4</td><td></td></tr><tr><td>Frullatore a proiettile</td><td>Next Advance</td><td>BB24-AU</td><td></td></tr><tr><td>Riscaldatore a farfalla</td><td>Phoenix S & Punte T</td><td>PST-BPH-20</td><td></td></tr><tr><td>C18</td><td>Harvard Apparatus</td><td>74-4607</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitolo (DTT)</td> <td>Sigma</td><td>D5545</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>41648</td><td></td></tr><tr><td>Acido formico</td><td>Sigma</td><td>94318</td><td></td></tr><tr><td>Fraction Collector</td><td>Gilson</td><td>FC203B</td><td></td></tr><tr><td>Perle di vetro</td><td>Next Advance</td><td>GB05</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamide (IAA)</td><td>Sigma</td><td>I6125</td><td></td></tr><tr><td>Lys-C</td><td>Wako</td><td>125-05061</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Burdick & Jackson</td><td>AH230-4</td><td></td></tr><tr><td>Kit per il dosaggio delle proteine BCA Pierce</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Spettrometro di massa</td><td>Thermo Scientific</td><td>Q Exactive HF</td><td></td></tr><tr><td>nanoflow UPLC</td><td>Thermo Scientific</td><td>Ultimate 3000</td><td></td></tr><tr><td>ReproSil-Pur C18 resina, 1,9 um</td><td>Dr. Maisch GmbH</td><td>r119.aq.0003</td><td></td></tr><tr><td>Colonne Self Pck</td><td>Nuovo obiettivo</td><td>PF360-75-15-N-5</td><td></td></tr><tr><td>Desossicolato di sodio</td><td>Sigma</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>Speedva</td><td>Thermo Scientific</td><td>SPD11V</td><td></td></tr><tr><td>TMT 10plex Reagente per etichette isobariche</td><td>Thermo Scientific</td><td>90110</td><td></td></tr><tr><td>Acido trifluoroacetico (TFA)</td><td>Applied Biosystems</td><td>400003</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Promega</td><td>V511C</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>Xbridge Column C18 colonna</td><td>Waters</td><td>186003943</td><td></td></tr><tr><td>Ziptips C18</td><td>Millipore</td><td>ZTC18S096</td><td></td></tr><tr><td>SepPak 1cc 50mg</td><td>Waters</td><td>WAT054960</td><td></td></tr></tbody></table>

proteoma profonda profilatura di etichettatura isobarico, vasto cromatografia liquida, spettrometria di massa e quantificazione assistita da software

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Sono stati compiuti molti progressi eccezionali in spettrometria di massa (MS)-base di proteomica, con il progresso tecnico particolare in cromatografia liquida (LC) accoppiata alla spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) e capacità di multiplexing etichettatura isobarica. Qui, presentiamo un protocollo di analisi profonda-proteomica che combina i tag massa tandem 10-plex (TMT) etichettatura con un'ampia piattaforma di LC/LC-MS/MS e correzione post-MS computazionale interferenze per quantificare con precisione i proteomi tutto. Questo protocollo comprende le seguenti fasi: estrazione di proteine e digestione, TMT etichettatura, 2-dimensionale (2D) LC, spettrometria di massa ad alta risoluzione e computazionale di elaborazione dei dati. Procedura di controllo qualità è inclusa per la risoluzione dei problemi e valutare la variazione sperimentale. Più di 10.000 proteine in campioni di mammiferi possono essere quantificati con fiducia con questo protocollo. Questo protocollo può essere applicato anche per la quantificazione delle modifiche post traduzionale con modifiche minori. Questo metodo multiplex, robusto fornisce un potente strumento per analisi di proteomica in una varietà di campioni complessi, tra cui la coltura delle cellule, tessuti animali e umani campioni clinici.

Abbiamo usato un mix di peptide cross-specie precedentemente descritte per analizzare sistematicamente l'effetto di compressione rapporto in 3 passi principali del protocollo, tra cui frazionamento pre-MS, MS impostazioni e correzione post-MS23. Il frazionamento di pre-MS è stato valutato e ottimizzato utilizzando una combinazione di pH di base RPLC e pH acido RPLC. Per l'analisi di post-MS, sono stati considerati solo specie-peptidi. Abbiamo usato questo modello d...

Vi presentiamo un protocollo per quantificare con precisione le proteine con etichettatura isobarico, vasto frazionamento, strumenti di bioinformatica e procedura di controllo di qualità in combinazione con cromatografia liquida interfacciato ad uno spettrometro di massa ad alta risoluzione.

Proteoma profonda profilatura di etichettatura isobarico, vasto cromatografia liquida, spettrometria di massa e quantificazione assistita da Software

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è identificare e quantificare con precisione oltre 10.000 proteine da lisato cellulare o tissutale attraverso diversi trattamenti farmacologici, decorso temporale o condizioni biologiche. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della medicina o della biologia, come ad esempio quali proteine cambiano in risposta a un farmaco o ad altri stimoli biologici. Il vantaggio principale di questa tecnica è che ha la capacità di quantificare con precisione oltre il 70% del proteoma espresso in 10 diverse condizioni sperimentali.Le implicazioni di questa tecnologia possono essere estese alla diagnosi delle malattie umane attraverso la scoperta di potenziali biomarcatori. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, in quanto la lisi cellulare ottimale e la stima dei fluidi svolgono un ruolo chiave nelle procedure di digestione, etichettatura e separazione a valle. Per iniziare questo protocollo, ottenere cellule in coltura di interesse.Lavare le celle due volte utilizzando 10 millilitri di PBS per ogni lavaggio. Raschiare e raccogliere le cellule lavate in una provetta da 1,5 millilitri contenente un millilitro di

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Qui si descrive un metodo efficace per il frazionamento di membrane plasmatiche vegetali solubili nelle membrane resistenti e detergenti detergenti a base di miscela di non marcato e in vivo completamente 15 N etichettati colture cellulari Arabidopsis thaliana. La procedura viene applicata per studi di proteomica comparativi per capire i processi di segnalazione.

Metabolic Etichettatura e con membrana frazionamento per proteomica comparativa Analisi del<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Culture sospensione cellulare

Etichettatura isotopi stabili di peptidi da dimethylation riduttiva (etichettatura Redi) è un rapido strategia economica per proteomica accurate di massa a base di spettrometria-quantitativi. Qui mostriamo un metodo efficace per la preparazione e l'analisi di miscele proteiche che utilizzano l'approccio Redi che può essere applicato a quasi qualsiasi tipo di campione.

La proteomica quantitativa, utilizzando riduttiva dimethylation per Stable Isotope Labeling

Analisi approfondite dei proteomi delle cellule tumorali facilitano l'identificazione di nuovi bersagli farmacologici e biomarcatori diagnostici. Descriviamo un flusso di lavoro sperimentale per l'analisi quantitativa di (fosfo-)proteomi in sottopopolazioni di cellule tumorali derivate da tumori liquidi e solidi. Ciò si ottiene combinando le strategie di arricchimento cellulare con la spettrometria di massa quantitativa basata su Super-SILAC.

Mass quantitativa spettrometrica Profiling di proteomi cancro-cellulari derivate da liquido e tumori solidi

Combinato precursore etichettatura isotopica e tagging isobarica (CPilot) è una strategia proteomica quantitativa che migliora le capacità di multiplazione campione di tag isobariche. Questo protocollo descrive l'applicazione di CPilot ai tessuti dal modello murino della malattia e wild-type controlli di Alzheimer.

Maggiore Campione Multiplexing dei tessuti utilizzando combinata Precursore isotopica etichettatura e isobarica Tagging (CPilot)

Presentiamo qui protocolli per purificazione per affinità di complessi proteici e la loro separazione dal blu PAGE nativa, seguiti da proteine ​​correlazione profilatura mediante un'etichetta disponibile spettrometria di massa quantitativa. Questo metodo è utile per risolvere interattomi in distinti complessi proteici.

Risoluzione purificato per affinità complessi proteici di Blue Native PAGE e proteine ​​correlazione Profiling

Descritto è un flusso di lavoro proteomico per identificare i partner di interazione delle proteine da una frazione subcellulare nucleare utilizzando l'arricchimento dell'immunoaffinità di una determinata proteina di interesse e la spettrometria di massa priva di etichette. Il flusso di lavoro include frazionamento subcellulare, immunoprecipitazioni, preparazione dei campioni assistiti dal filtro, pulizia offline, spettrometria di massa e una pipeline bioinformatica a valle.

Flusso di lavoro per spettrometria di massa per l'immunoprecipitazioni nucleari senza etichetta per la profilazione del contraglio nucleare su larga scala

Presentiamo un protocollo di etichettatura ottimizzato per tag di massa tandem (TMT) che include informazioni dettagliate per ciascuno dei seguenti passaggi: estrazione delle proteine, quantificazione, precipitazioni, digestione, etichettatura, presentazione a un impianto proteomico e analisi dei dati.

Preparazione del campione TMT per l'invio di strutture proteomiche e la successiva analisi dei dati

L'etichettatura isotopica precursore combinata e il tagging isobarico (cPILOT) è una strategia avanzata di multiplexing del campione in grado di aumentare il numero di campioni che possono essere analizzati contemporaneamente ai tag isobarici disponibili. L'incorporazione di una piattaforma robotica ha notevolmente aumentato la produttività sperimentale, la riproducibilità e l'accuratezza quantitativa.

Multiplexing di campioni automatizzato utilizzando l'etichettatura isotopica precursore combinata e il tagging isobarico (cPILOT)

Il protocollo descritto fornisce un'analisi proteomica quantitativa ottimizzata di campioni di tessuto utilizzando due approcci: la quantificazione basata su etichette e la quantificazione senza etichette. Gli approcci basati su etichette hanno il vantaggio di una quantificazione più accurata delle proteine, mentre un approccio senza etichette è più economico e utilizzato per analizzare centinaia di campioni di una coorte.

Flusso di lavoro completo di proteomica shotgun basata su spettrometria di massa di campioni di tessuto

L'ossidazione del tiolo proteico ha implicazioni significative in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche normali. Descriviamo i dettagli di un metodo di proteomica redox quantitativa, che utilizza la cattura assistita da resina, la marcatura isobarica e la spettrometria di massa, consentendo l'identificazione sito-specifica e la quantificazione dei residui di cisteina ossidati in modo reversibile delle proteine.

Cattura assistita da resina accoppiata con etichettatura isobarica Tandem Mass Tag per la quantificazione multiplexata dell'ossidazione del tiolo proteico

Scopri la profilazione proteomica profonda con etichettatura isobarica, cromatografia liquida estesa e spettrometria di massa ad alta risoluzione. Questo metodo computazionale consente di quantificare oltre 10.000 proteine per la ricerca sui biomarcatori.

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Proteoma profonda profilatura di etichettatura isobarico, vasto cromatografia liquida, spettrometria di massa e quantificazione assistita da Software

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