Proteoma profonda profilatura di etichettatura isobarico, vasto cromatografia liquida, spettrometria di massa e quantificazione assistita da Software

L'obiettivo generale di questo esperimento è identificare e quantificare con precisione oltre 10.000 proteine da lisato cellulare o tissutale attraverso diversi trattamenti farmacologici, decorso temporale o condizioni biologiche. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della medicina o della biologia, come ad esempio quali proteine cambiano in risposta a un farmaco o ad altri stimoli biologici. Il vantaggio principale di questa tecnica è che ha la capacità di quantificare con precisione oltre il 70% del proteoma espresso in 10 diverse condizioni sperimentali.

Le implicazioni di questa tecnologia possono essere estese alla diagnosi delle malattie umane attraverso la scoperta di potenziali biomarcatori. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, in quanto la lisi cellulare ottimale e la stima dei fluidi svolgono un ruolo chiave nelle procedure di digestione, etichettatura e separazione a valle. Per iniziare questo protocollo, ottenere cellule in coltura di interesse.

Lavare le celle due volte utilizzando 10 millilitri di PBS per ogni lavaggio. Raschiare e raccogliere le cellule lavate in una provetta da 1,5 millilitri contenente un millilitro di PBS. Centrifugare a 600 volte g e quattro gradi Celsius per cinque minuti.

Rimuovere il surnatante e conservare a meno 80 gradi Celsius fino al momento di lisare le cellule. Raccogliere e pesare rapidamente i tessuti desiderati dopo la dissezione. Successivamente, conservarli immediatamente in azoto liquido e conservarli a meno 80 gradi Celsius.

Preparare il tampone di lisi il giorno dell'esperimento come indicato nel protocollo di testo. Aggiungere il tampone di lisi al campione congelato in modo tale che il rapporto tampone/campione sia di 10 a uno e la concentrazione finale di proteine sia compresa tra cinque e 10 milligrammi per millilitro. Quindi, aggiungere le perle di vetro e utilizzare un frullatore per lisare i campioni a quattro gradi Celsius e velocità otto frullando per 30 secondi e poi riposando per cinque secondi, ripetendo l'operazione cinque volte o fino a quando i campioni non sono omogeneizzati.

Misurare la concentrazione proteica utilizzando un saggio standard di quantificazione delle proteine o un gel di poliacrilammide SDS colorato con Coomassie con BSA come standard. Successivamente, aggiungere il 100% di acetonitrile in modo tale che la concentrazione finale sia del 10% e la proteasi di Lys-C abbia un rapporto enzima/substrato di uno a 100. Incubare a temperatura ambiente per due ore per consentire la digestione delle proteine.

Quindi aggiungere DTT in modo tale che la concentrazione finale sia di un millimolare. Incubare a temperatura ambiente per un'ora. Quindi, aggiungere 50 millimolari di HEPES fino a quando la concentrazione di urea nei campioni non viene diluita a due molari.

Aggiungere la tripsina a ciascun campione con un rapporto tripsina/proteine di uno a 50. Incubare a temperatura ambiente per almeno tre ore. Successivamente, aggiungere DTT fino a quando la sua concentrazione non è di nuovo di un millimolare e incubare a temperatura ambiente per due ore.

Aggiungere iodoacetamide in modo tale che la sua concentrazione finale sia di 10 millimolari. Incubare al buio per 30 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, estinguere qualsiasi iodoacetamide non reagito aggiungendo DTT in modo tale che la sua concentrazione finale sia di 30 millimolari.

Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Verificare l'efficienza della digestione della tripsina come indicato nel protocollo di testo. Quindi, aggiungere TFA a ciascun campione in modo che la concentrazione finale sia dell'1%Utilizzando una striscia di pH, misurare il pH di ciascun campione per verificare che sia compreso tra due e tre.

Se necessario, aggiungere ulteriore TFA per raggiungere un pH inaccettabile. Centrifugare i campioni a 20.000 volte g e temperatura ambiente per 10 minuti. Raccogliere il surnatante e caricare i campioni su colonne di centrifuga preparate.

Centrifugare a 100 volte g per tre minuti o fino a quando il campione non è passato completamente attraverso la colonna per legare i campioni. Quindi, aggiungere 0,5 millilitri di TFA allo 0,1% a ciascuna colonna. Centrifugare a 500 volte g per 30 secondi.

Successivamente, aggiungere 125 microlitri di una soluzione contenente il 60% di acetonitrile e 0,1 TFA in ciascuna colonna. Centrifugare a 100 volte g per tre minuti per eluire i peptidi dalla colonna. Ricostituire ogni campione di peptide desalinizzato in 50 microlitri di HEPES da 50 millimolari.

Utilizzando una striscia di pH, verificare che il pH di ciascun campione sia compreso tra sette e otto. Quindi, sciogliere i reagenti TMT in acetonitrile anidro, aggiungerli ai campioni e quindi incubare a temperatura ambiente per un'ora. Successivamente, utilizzare puntali per pipette da 10 microlitri incorporati con mezzi cromatografici per desalinizzare un microgrammo di ciascun campione e analizzare l'efficienza di marcatura come indicato nel protocollo di testo.

Esaminare da sei a 10 peptidi separati per assicurarsi che i peptidi non marcati non vengano rilevati nei campioni etichettati. Quindi, mescolare insieme circa due microlitri di ciascun campione. Utilizzare puntali per pipette da 10 microlitri incorporati con terreni cromatografici per desalinare questa miscela.

Analizzare i campioni mediante LC-MS/MS come indicato nel protocollo di testo. Per iniziare, solubilizzare il campione di peptide desalinato in pool marcato con TMT in 65 microlitri di tampone A.Utilizzare una striscia di pH per verificare che il pH sia di circa 8,0. Se il campione è ancora acido, utilizzare idrossido di ammonio per regolare il pH secondo necessità.

Quindi, frazionare il campione come descritto nel protocollo di testo. Imposta il raccoglitore di frazioni in modo che raccolga le frazioni ogni due minuti, incluso il tempo di caricamento. Impostare la portata su 0,4 millilitri al minuto.

Raccogli un totale di 80 frazioni. Quindi, utilizzare un concentratore sottovuoto per asciugare completamente ogni altro campione. Utilizzando LC-MS/MS, analizza tutte le 80 frazioni per ottenere una copertura del proteoma ultra profonda.

Innanzitutto, imballare la resina C18 da 1,9 micrometri in colonne vuote di diametro interno di 75 micrometri raggiungendo un volume del letto di circa 1,3 microlitri. Avvolgere la colonna due o tre volte all'interno di un riscaldatore a farfalla per garantire che l'intera lunghezza sia riscaldata. Fissare la colonna con del nastro adesivo all'interno del riscaldatore facendo attenzione a non fissarla con nastro adesivo.

Quindi, riscalda la colonna a 65 gradi Celsius. Eseguire 100 nanogrammi di peptidi cerebrali di ratto attraverso il sistema LC-MS/MS per valutare la qualità del sistema. Ripeti questa valutazione un'altra volta.

Successivamente, caricare circa 0,2 microgrammi di peptidi ricostituiti sulla colonna mentre si scorre il tampone al 5% A.Eluire i peptidi dalla colonna e analizzarli con lo spettrometro di massa come indicato nel protocollo di testo. In questo studio, viene descritto un metodo ad alto rendimento per la quantificazione di proteine con una strategia di marcatura isobarica a 10 plessi. L'efficienza della marcatura TMT viene esaminata utilizzando LC-MS/MS per analizzare i campioni marcati con TMT e i corrispondenti campioni non etichettati.

Come si può notare, il picco peptidico non marcato si trova solo nel campione non marcato mentre il picco peptidico marcato con TMT si trova solo nel campione marcato. Successivamente, viene valutato l'effetto della finestra di isolamento MS2 sull'interferenza. Tutte le scansioni MS2 sono designate come scansione pulita o rumorosa.

Mentre le scansioni pulite mostrano ioni y1 di sola lisina, le scansioni rumorose li mostrano sia nella lisina che nell'arginina. Qui viene mostrata la rimozione rappresentativa dell'interferenza utilizzando peptidi di E.coli marcati singolarmente con tre diversi reagenti TMT. Le intensità relative sommate rivelano che la correzione basata sugli ioni y1 è più accurata per la quantificazione basata su TMT.

Una volta padroneggiato, questo protocollo può essere completato in quattro o cinque settimane se eseguito correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è molto importante assicurarsi che tutte le fasi di controllo della qualità siano eseguite completamente per garantire che il set di dati finale sia il più accurato possibile. L'adattamento di questa procedura per concentrarsi sulle modifiche post-traduzionali può rispondere ad altre domande, come ad esempio il modo in cui l'ubiquitinazione, la fosforilazione o l'acetilazione stanno cambiando in risposta alla progressione della malattia o al trattamento farmacologico.

Dopo il suo sviluppo, la tecnologia ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dei prodotti per esplorare i cambiamenti proteici nelle cellule e nei tessuti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere un'ottima comprensione di come identificare e quantificare con precisione oltre 10.000 proteine da una cellula o da un tessuto di mammifero. Non dimenticare che lavorare con UPLC ad alta pressione e poche colonne di silice può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare occhiali di sicurezza.

Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando abbiamo iniziato ad affrontare il noto problema della compressione del rapporto che si verifica nella marcatura isobarica. Ci siamo resi conto che il frazionamento esteso è un ottimo modo non solo per alleviare questo problema, ma anche per aumentare l'identificazione di proteine e peptidi che possono aumentare ulteriormente e adattarsi all'analisi del proteoma.