Utilizzando biosensori a base di enzimi misurare Tonic e Phasic glutammato in modelli murini di Alzheimer

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare le variazioni di glutammato extracellulare tonico e fasico in vivo utilizzando array di microelettrodi collegati agli enzimi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze, come ad esempio se i livelli di neurotrasmettitori extracellulari e le dinamiche rapide del rilascio e della clearance dei neurotrasmettitori siano alterati negli stati patologici. Il vantaggio principale di questa tecnica è che gli array di microelettrodi possono misurare specifici cambiamenti di neurotrasmettitori all'interno di regioni cerebrali discrete, rendendolo un approccio spazialmente e temporalmente preciso pur essendo minimamente invasivo.

A dimostrare la procedura saranno Holly Hunsberger e Ryan Heslin del mio laboratorio. Per iniziare questa procedura, rivestire una coppia di siti di registrazione su un MEA con l'enzima desiderato e una diversa coppia di siti di registrazione con la matrice proteica inattiva. Quindi, aspirare la glutammato ossidasi o la matrice proteica utilizzando una siringa Hamilton da 10 microlitri.

Premere delicatamente lo stantuffo per erogare una piccola goccia di soluzione sulla punta della siringa. Per individuare i siti di registrazione MEA, sotto un microscopio da dissezione, applicare la soluzione ai siti di registrazione appropriati contattando brevemente i siti di registrazione con la gocciolina di soluzione, che rappresenta uno strato. Impostare un timer di un minuto tra le applicazioni di rivestimento nei siti di registrazione.

A questo punto, posizionare l'elettrodo di riferimento attraverso l'apertura del braccio di plastica. Abbassare l'elettrodo di riferimento in un becher contenente PBS e assicurarsi che non entri in contatto con la parte inferiore del becher. Quindi, collegare l'elettrodo di riferimento allo stadio principale e collegare il MEA alla placcatura mPD allo stadio superiore.

Abbassare il MEA nel becher della soluzione in modo che solo la punta del MEA sia immersa nella soluzione. Non immergere la punta MEA in liquidi oltre la bolla nera. Ciò potrebbe danneggiare il MEA.

Quindi, seleziona l'icona della galvanica sul desktop. Nel menu dello strumento galvanico, verificare che siano state inserite le impostazioni corrette. Successivamente, selezionare Esci dal software per terminare la galvanica.

Sciacquare le punte degli elettrodi placcate in mPD con acqua deionizzata e conservarle per 24 ore prima della calibrazione. In questa procedura, accendere un termoforo a 37 gradi Celsius e collegare la head stage al sistema di controllo della registrazione. Quindi, inserire la punta MEA in 40 millilitri di PBS molare da 0,5 molare agitato.

Quindi, collegare l'elettrodo di riferimento allo stadio di testa. Muovere la punta dell'elettrodo di riferimento per assicurarsi che non vi siano bolle d'aria. Successivamente, apri il programma di registrazione, assicurati che le impostazioni siano corrette, scegli il numero MEA, fai clic su Calibrazione e premi start.

Attendere da cinque a 10 minuti per l'equilibrio e iniziare la calibrazione una volta che la linea di base si è stabilizzata. Quindi, seleziona Linea di base e aggiungi 500 microlitri di acido ascorbico. Quindi, selezionare Interferente una volta che la corrente ha raggiunto un nuovo plateau stabile.

Se il MEA è correttamente galvanizzato, non si deve osservare alcun cambiamento. Successivamente, aggiungere 40 microlitri di L-glutammato da 20 millimolari. Una volta che la corrente ha raggiunto un nuovo plateau costante, segnare la prima aggiunta come analita.

Ripetere tre volte per un totale di tre aggiunte di glutammato. Quindi, aggiungi 40 microlitri di dopamina. E selezionare Sostanza in esame.

Successivamente, aggiungere 40 microlitri di perossido. Selezionare Sostanza in esame e fare clic sul pulsante di arresto una volta terminata la calibrazione. In questa fase, posizionare la micropipetta centralmente tra tutti e quattro i siti di registrazione del platino e montarla da 50 a 100 micrometri sopra il MEA utilizzando cera appiccicosa e argilla da modellare.

Utilizzando un adattatore CC, clamp il filo positivo rosso al filo d'argento preparato sul lato del pin d'oro e clamp il filo negativo nero al catodo a bagno di platino. Quindi, collega l'adattatore CC e cerca il processo di placcatura corretto. Dovrebbero apparire delle bolle sull'elettrodo del bagno e l'elettrodo di riferimento dovrebbe assumere un colore grigio argento.

In questa procedura, posizionare l'animale nel dispositivo stereotassico e utilizzare le barre auricolari per stabilizzare la testa. Assicurati che l'animale sia assicurato e che la testa non si muova. Quindi, applicare l'unguento per gli occhi utilizzando un applicatore di cotone sterile.

Dopodiché, radere la testa con un rifinitore. E rimuovi il pelo vicino alle orecchie usando piccole forbici chirurgiche. Successivamente, applicare lo iodio e poi l'alcol sul cuoio capelluto alternativamente per tre volte.

Successivamente, praticare un'incisione al centro del cuoio capelluto e stendere la pelle. Assorbire il sangue con una punta di cotone sterile e applicare acqua ossigenata per facilitare la comparsa di bregma e lambda. Assicurati che la testa sia posizionata correttamente misurando la parte dorso-ventrale e mediale-laterale di bregma e lambda.

Impostare le coordinate a bregma su zero e contrassegnare le coordinate di destinazione. Quindi, fora intorno al segno. Successivamente, collegare il MEA allo stadio principale.

Riempire nuovamente la pipetta con la prima soluzione desiderata. Assicurarsi di lasciare uno spazio vuoto nella pipetta senza soluzione in modo che la soluzione espulsa possa essere esaminata. Quindi, collegare il tubo alla micropipetta di vetro.

Trova bregma con il MEA attaccato e imposta le coordinate a zero. Sposta il MEA alle coordinate desiderate e abbassalo lentamente fino a quando la punta tocca il cervello. Successivamente, azzerare la coordinata dorso-ventrale e poi abbassare lentamente il MEA nel cervello.

Posizionare l'elettrodo di riferimento in una posizione remota dal MEA in modo che sia ancora in contatto liquido con il cervello per completare il circuito. Nel programma di registrazione, fare clic sull'elettrodo calibrato desiderato, quindi fare clic su Esegui esperimento per avviare la registrazione. Dopo aver ottenuto una linea di base stabile, impostare l'eiettore di pressione su 0.6 secondi e 0.5 psi e premere il pulsante rosso sull'eiettore di pressione per espellere.

Registrare il tempo e la pressione, nonché i tick di volume spostati sul foglio di iniezione e, se necessario, prendere nota. Successivamente, rimuovere il MEA con la micropipetta attaccata, sciacquarlo con acqua deionizzata e immergerlo in PBS durante la notte fino a quando tutto il sangue non è sparito. Nelle regioni CA3 e CA1 dell'ippocampo, i livelli di glutammato tonico erano significativamente aumentati nei topi TauP301L trattati con veicolo, un effetto attenuato dal trattamento con riluzolo.

Qui, le registrazioni rappresentative abbinate al basale del rilascio di glutammato evocato dal cloruro di potassio nel CA3 hanno mostrato che il trattamento con riluzolo ha attenuato l'aumento significativo dell'ampiezza del rilascio di glutammato osservato nei topi Vehicle-TauP301L. L'applicazione locale di cloruro di potassio ha prodotto un robusto aumento del glutammato extracellulare che è tornato rapidamente a livelli tonici. Il rilascio di glutammato evocato da cloruro di potassio significativamente aumentato nei DG, CA3 e CA1 osservato nei topi TauP301L trattati con veicolo dopo l'applicazione locale di cloruro di potassio è stato attenuato con il trattamento con riluzolo.

Questa sezione dell'ippocampo colorata di viola cresyl conferma la posizione delle tracce MEA in CA3 e CA1. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare i passaggi per la risoluzione dei problemi elencati nel manoscritto. Ad esempio, per ridurre i segnali rumorosi, ricordarsi di mettere a terra il sistema e seguire i passaggi in modo tempestivo.