Name: Utilizzando biosensori a base di enzimi misurare Tonic e Phasic glutammato in modelli murini di Alzheimer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Impara a misurare il glutammato tonico e fasico in vivo con microelettrodi enzimatici in modelli murini di Alzheimer. Questo metodo permette il monitoraggio in tempo reale delle alterazioni neurochimiche nel cervello.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of scienze mediche generali (MNR; U54GM104942), NIA (MNR; R15AG045812), Associazione Alzheimer (MNR; NIRG-12-242.187), WVU facoltà di ricerca Senato Grant (MNR), e WVU PSCOR di Grant (MNR).

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GG è l&#39;unico proprietario di Quanteon, LLC che rende il sistema di registrazione-16 VELOCE utilizzato per le misurazioni del glutammato in questo studio. JEQ è un consulente pagato per Quanteon.

La tecnica MEA consente la misurazione della rapida cinetica di rilascio di neurotrasmettitore e l&#39;assorbimento in vitro e in vivo. Quindi, la tecnologia produce una vasta gamma di uscita dati compresi livelli di neurotrasmettitore tonico, rilascio di neurotrasmettitore evocato, e la clearance neurotrasmettitore. Tuttavia, perché l&#39;uso di MEA è una procedura relativamente complessa, ci sono numerosi fattori che possono avere bisogno di essere ottimizzato per l&#39;uso con successo. Ad esempio, ...

Misurare alterazioni neurotrasmettitore nel cervello è uno strumento essenziale per neuroscienziati studiano le malattie del sistema nervoso centrale (SNC) che sono spesso caratterizzati da disregolazione neurotrasmettitore. Sebbene microdialisi in combinazione con la cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC / CE) è il metodo più diffuso per misurare le variazioni nei livelli di neurotrasmettitori extracellulari 1, 2, 3, 4, la risoluzione spaziale e temporale delle sonde da microdialisi può non essere ideale per neurotrasmettitori , come glutammato, che sono strettamente regolata nello spazio extracellulare 5, 6. A causa dei recenti progressi nel campo della genetica e di imaging, ci sono altri metodi che possono essere utilizzati per mappare glutammato in vivo. Utilizzando reporter glutammato fluorescenti geneticamente codificati (iGluSnFR) und immagini a due fotoni, i ricercatori sono in grado di visualizzare rilascio di glutammato da neuroni e astrociti in vitro ed in vivo 7, 8, 9. In particolare, questo permette di registrare da un campo visivo più ampio e non interrompe le connessioni intrinseche del cervello. Mentre queste nuove tecniche ottiche consentono la visualizzazione della cinetica glutammato e misurazione delle risposte evocate sensoriali e attività neuronale, non hanno la capacità di quantificare la quantità di glutammato nello spazio extracellulare in regioni cerebrali discrete. Un metodo alternativo è la matrice microelettrodi enzimatico (MEA) che può selettivamente misurare i livelli di neurotrasmettitori extracellulari, quali glutammato, attraverso l&#39;uso di un sistema di registrazione di auto-riferimento. La tecnica MEA è stato utilizzato per studiare le alterazioni di glutammato extracellulare seguenti cerebrali traumatichelesioni 10, 11, 12, invecchiamento 13, 14, stress 15, 16, epilessia 17, 18, morbo di Alzheimer 19, 20, e l&#39;iniezione di un virale mimico 21 e rappresenta un miglioramento rispetto dei limiti spaziali e temporali inerenti microdialisi. Considerando microdialisi limita la capacità di misurare vicino alla sinapsi 22, 23, MEA hanno una risoluzione spaziale elevata che consente misure selettive di straripamento extracellulare glutammato vicino sinapsi 24, 25. In secondo luogo, la bassa risoluzione temporale di microdialisi (1 - 20 min) limita la capacità di indagare ladinamica veloce di rilascio di glutammato e la clearance si verificano nel millisecondo secondo intervallo 26. Perché le differenze nel rilascio o la clearance di glutammato non possono essere evidenti nelle misure di tonico, riposo livelli di glutammato, può essere necessario che il rilascio di glutammato e la clearance essere misurati direttamente. MEA tengono conto di tali misure a causa della loro elevata risoluzione temporale (2 Hz) e limiti di rilevabilità (&lt;1 um). Terzo, MEA consentire l&#39;analisi di variazioni subregionali neurotrasmettitori all&#39;interno di una particolare regione del cervello, come l&#39;ippocampo di ratto o topo. Ad esempio, utilizzando MEA possiamo separatamente bersaglio il giro dentato (DG), comu Ammonis 3 (CA3) e comu Ammonis 1 (CA1) dell&#39;ippocampo, che sono collegati tramite un circuito trisynaptic 27, di esaminare le differenze subregionali glutammato extracellulare. A causa delle dimensioni di sonde microdialisi (1 - lunghezza 4 mm) e il danno causato per impiantazione 28 &lt;/ sup&gt;, 29, le differenze subregionali sono difficili da affrontare. Inoltre, i sistemi ottici consentono solo la stimolazione tramite stimoli esterni, come ad esempio una stimolazione baffo o sfarfallio luce, che non consente la stimolazione subregionale 7. Un vantaggio finale di MEA rispetto ad altri metodi è la possibilità di studiare queste subregioni in vivo senza interrompere le loro connessioni estrinseche e intrinseche. Qui, viene descritto come un sistema di registrazione (per esempio, FAST16mkIII) in combinazione con MEA, costituito da un microelettrodo multisito a base di ceramica, può essere differenzialmente rivestito sui siti di registrazione per consentire agli agenti interferenti essere rilevato e rimosso dal segnale analita. Dimostriamo anche queste matrici possono essere utilizzati per studi Amperometry-di regolazione in vivo glutammato all&#39;interno della DG, CA3 e CA1 ippocampali subregioni di anestetizzato RTG (tauP301L) 4510 topi, un m comunemente usatoil modello Ouse della malattia di Alzheimer. Inoltre, forniamo conferma della sensibilità del sistema MEA alla dinamica veloci di rilascio di glutammato e di passaggio trattando i topi con riluzolo, un farmaco mostrato in vitro per diminuire il rilascio di glutammato e aumentare glutammato captazione 30, 31, 32, 33, e dimostrando queste rispettive variazioni in vivo nel modello murino tauP301L.

<table><tbody>Array di microelettrodi <tr><td>FAST-16mkIII-8 canali</td><td>Quanteon</td><td>16mkIII</td><td></td></tr><tr><td></td><td>CenMet</td><td>W4 o 8-TRK</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-3059</td><td>10 g (scade dopo 1 mese)</td></tr><tr><td>Glutaraldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-6257</td><td>100 mL (scade dopo 6 mesi)</td></tr><tr><td>Glutammato ossidasi</td><td>US Biological o Sigma Aldrich</td><td>G4001-01 o 100646</td><td>50 UI (scade dopo 6 mesi)</td></tr><tr><td>Hamilton Siringhe</td><td>Hamilton</td><td>#80383</td><td>2 siringhe</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>BDH</td><td>UN1230</td><td>4 L</td></tr><tr><td>m-Fenilendiammina dicloridrato (mPD)</td><td>ACROS Organics</td><td>1330560250</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Elettrodi di riferimento (RE-5B)</td><td>BAS</td><td>MF-2079</td><td>3 elettrodi</td></tr><tr><td>Alimentato a batteria Magnetico piastra di agitazione</td><td>Cole-parmer</td><td>EW-04804-01</td><td>Può acquistare da diversi fornitori</td></tr><tr><td>Glutammato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-1626</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Acido ascorbico</td><td>TCI</td><td>50-81-7</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Dopamina cloridrato</td><td>Alfa Aesar</td><td>62-31-7</td><td>5 g</td></tr><tr><td>Acido perclorico</td><td>VWR</td><td>UN2920</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Cloruro di postassio</td><td>VWR</td><td>7447-40-7</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>VWR</td><td>7647-40-7</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>MP</td><td>153502</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>BDH</td><td>1310732</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Pipette di espulsione a pressione in vetro</td><td>Cera</td> appiccicosa CenMet <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Kerrlab</td><td>625</td><td>Può acquistare da un fornitore diverso</td></tr><tr><td>Microsyringe</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF28G-5</td><td></td></tr><tr><td>Argilla da modellare</td><td>WalMart</td><td></td><td>Può acquistare da diversi fornitori</td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>Parker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filo d'argento</td><td>AM systems</td><td>#786500</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>BDH</td><td>7647010</td><td>2.5 L</td></tr><tr><td>Filo di platino</td><td>AM Systems</td><td>778000</td><td></td></tr><tr><td>Pistola per saldatura</td><td>Lowes o Home Depot</td><td></td><td>Può acquistare da un fornitore diverso</td></tr><tr><td>Multimetro</td><td>WalMart</td><td></td><td>Può acquistare da un fornitore diverso</td></tr><tr><td>PhysioSuite</td><td>Kent Scientific</td><td></td><td>Può acquistare da un fornitore diverso</td></tr><tr><td>SomnoSuite</td><td>Kent Scientific</td><td></td><td>Può acquistare da un fornitore diverso</td></tr><tr><td>Dispositivo</td> <td>stereotassicoStoelting</td><td></td><td>Può acquistare da un fornitore diverso</td></tr><tr><td>Digital Lab Standard</td><td>Stoelting</td><td></td><td>Può acquistare da un fornitore diverso</td></tr><tr><td>Microscopio Meiji EMZ</td><td>Meiji</td><td>EMZ-5</td><td></td></tr><tr><td>Trapano</td><td>Dremel</td><td>Micro</td><td></td></tr><tr><td>Metricide</td><td>Metrex</td><td>102800</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>VWR</td><td></td><td>Può acquistare da un fornitore diverso</td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche</td><td>VWR</td><td></td><td>Può acquistare da un fornitore diverso</td></tr><tr><td>Tamponi di cotone sterili</td><td>Puritan</td><td>25806</td><td>Può acquistare da un fornitore diverso</td></tr><tr><td>Unguento per gli occhi Unguento</td><td>veterinario Puralube Ottenere</td><td></td><td>dal veterinario</td></tr><tr><td>Tamponi di iodio</td><td>VWR</td><td>S48050</td><td>Può acquistare da un fornitore diverso</td></tr><tr><td>Tamponi alcolici</td><td>Farmacia locale</td><td></td><td>Può acquistare da un fornitore diverso</td></tr><tr><td>Telo chirurgico sterile</td><td>Dynarex</td><td>4410</td><td>Può acquistare da un fornitore diverso</td></tr><tr><td>Soluzione salina sterile</td><td>Teknova</td><td>S5815</td><td>Può fare la propria soltuion utilizzando i filtri</td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno (3%)</td><td>Farmacia</td><td></td> locale <td>Può acquistare da un fornitore diverso</td></tr><tr><td>Pad riscaldante</td><td>WalMart</td><td></td><td>Può acquistare da diversi fornitore</td></tr></tbody></table>

utilizzando biosensori a base di enzimi misurare tonic e phasic glutammato in modelli murini di alzheimer

Using Enzyme-based Biosensors to Measure Tonic and Phasic Glutamate in Alzheimer's Mouse Models

interruzione Neurotrasmettitore è spesso una componente chiave di malattie del sistema nervoso centrale (SNC), giocando un ruolo nella patologia sottostante malattia di Alzheimer, il morbo di Parkinson, la depressione e l&#39;ansia. Tradizionalmente, microdialisi è stata la tecnica più comune (lodato) per esaminare i cambiamenti neurotrasmettitore che si verificano in questi disturbi. Ma poiché microdialisi ha la capacità di misurare lenti cambiamenti 1-20 minuti durante ampie aree di tessuto, ha lo svantaggio di invasività, potenzialmente distruggere collegamenti intrinseci all&#39;interno del cervello e una capacità di campionamento lento. Una tecnica relativamente recente, l&#39;array microelettrodo (MEA), presenta numerosi vantaggi per misurare le variazioni dei neurotrasmettitori specifici all&#39;interno delle regioni cerebrali discrete che si verificano, rendendo per un approccio spazialmente e temporalmente preciso. Inoltre, utilizzando MEA è minimamente invasiva, consentendo la misurazione di alterazioni neurotrasmettitori in vivo. Nel nostro laboratorio, abbiamo hāve stato specificamente interessati a cambiamenti del neurotrasmettitore, il glutammato, legati alla patologia il morbo di Alzheimer. Come tale, il metodo qui descritto è stato utilizzato per valutare potenziali interruzioni dell&#39;ippocampo in glutammato in un modello di topo transgenico della malattia di Alzheimer. In breve, il metodo utilizzato prevede il rivestimento di un microelettrodo multisito con un enzima molto selettivo per il neurotrasmettitore di interesse e utilizzando siti autoreferenziali di sottrarre il rumore di fondo e interferenti. Dopo la placcatura e la calibrazione, il MEA può essere costruito con una micropipetta e abbassato nel regione del cervello di interesse utilizzando un dispositivo stereotassico. Qui, il metodo descritto comporta anestetizzante RTG (tauP301L) 4510 topi e utilizzando un dispositivo stereotassico di indirizzare con precisione sub-regioni (DG, CA1 e CA3) dell&#39;ippocampo.

Anche se questa tecnologia può essere utilizzata per misurare alterazioni glutamatergici segnalazione in molti tipi di modelli animali, come ad esempio lesioni traumatiche del cervello, l&#39;invecchiamento, lo stress e l&#39;epilessia, qui si dimostra come la tecnologia MEA può essere utilizzato per esaminare le alterazioni glutamatergici a modello di topo transgenico di taupatia umano 19, 20. La RTG (tauP301L) 4510 del mouse es...

Qui, descriviamo l&#39;installazione, software di navigazione, e l&#39;analisi dei dati per un metodo spazialmente e temporalmente precisa misurazione toniche e fasiche cambiamenti glutammato extracellulare in vivo utilizzando matrici di microelettrodi enzimatico (MEA).

Utilizzando biosensori a base di enzimi misurare Tonic e Phasic glutammato in modelli murini di Alzheimer

Neurotransmitter disruption is often a key component of diseases of the central nervous system (CNS), playing a role in the pathology underlying ...

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare in vivo le variazioni toniche e fasiche del glutammato extracellulare utilizzando microelettrodi a matrice collegati a enzimi. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle neuroscienze, ad esempio se i livelli di neurotrasmettitori extracellulari e la dinamica rapida del rilascio e della rimozione dei neurotrasmettitori siano alterati in condizioni patologiche. Il principale vantaggio di questa tecnica è che i microelettrodi a matrice possono misurare variazioni specifiche dei neurotrasmettitori all'interno di regioni cerebrali distinte, rendendola un approccio preciso sia dal punto di vista spaziale che temporale, oltre a essere minimamente invasivo.La procedura sarà dimostrata da Holly Hunsberger e Ryan Heslin del mio laboratorio. Per iniziare la procedura, rivestire una coppia di siti di registrazione su un MEA con l'enzima desiderato e una coppia diversa di siti di registrazione con la matrice proteica inattiva. Successivamente, aspirare l'ossidasi del glutammato o la matrice proteica utilizzando una siringa Hamilton da 10 microlitri.Premere delicatamente lo stantuffo per dispensare una pic

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Una tecnica per la raccolta seriale del liquido cerebrospinale dalla Magna Cisterna in Mouse

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In questo video, un Multielectrode Array (MEA) rivestito con glutammato ossidasi viene impiantato nel tessuto cerebrale di un topo anestetizzato. La soluzione di glutammato viene iniettata nello spazio extracellulare dove il MEA rileva i livelli di glutammato, consentendo il monitoraggio in tempo reale dell'assorbimento di glutammato da parte degli astrociti.

Monitoraggio in vivo del glutammato in tempo reale utilizzando un array di microelettrodi rivestiti di enzimi

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Valutazione di alternanza spontanea, riconoscimento novello di oggetti e attacco degli arti nei modelli di topo transgenico Modelli di neuropathologia di Amiloide-β e Tau

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Impara a misurare il glutammato tonico e fasico in vivo con microelettrodi enzimatici in modelli murini di Alzheimer. Questo metodo permette il monitoraggio in tempo reale delle alterazioni neurochimiche nel cervello.

Utilizzando biosensori a base di enzimi misurare Tonic e Phasic glutammato in modelli murini di Alzheimer

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