Name: Profilatura cellulare Redox usando la microscopia ad alto contenuto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Impara a quantificare simultaneamente i livelli di ROS intracellulari e la morfofunzione mitocondriale nelle cellule aderenti utilizzando la microscopia ad alto contenuto con sonde fluorescenti.

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Questa ricerca è stata supportata dall'Università di Anversa (TTBOF/29267, TTBOF/30112), dal Fondo Speciale per la Ricerca dell'Università di Gand (progetto BOF/11267/09), da NB-Photonics (Codice progetto 01-MR0110) e dall'iniziativa CSBR (Centers for Systems Biology Research) dell'Organizzazione Olandese per la Ricerca Scientifica (NWO; No: CSBR09/013V). Parti di questo manoscritto sono state adattate da un'altra pubblicazione1, con il permesso di Springer. Gli autori ringraziano Geert Meesen per il suo aiuto con il microscopio a campo largo.

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</ol>

Gli autori affermano che non esistono interessi finanziari concorrenti o altri conflitti di interesse. L&#39;autore corrispondente assicura anche che tutti gli autori siano stati invitati a rivelare qualsiasi conflitto d&#39;interesse.

Questo documento descrive un metodo di microscopia ad alto contenuto per la quantificazione simultanea dei livelli ROS intracellulari e morfofunzione mitocondriale in NHDF. La sua performance è stata dimostrata con un caso di studio sul NHDF trattato con SQV. I risultati supportano evidenze precedenti dalla letteratura in cui sono stati osservati livelli aumentati di ROS o disfunzione mitocondriale dopo il trattamento con inibitori della proteasi HIV di tipo 1, anche se in esperimenti separati 19...

<html> La concentrazione di ROS intracellulare è regolata minuziosamente attraverso una interazione dinamica tra i sistemi ROS e ROS. Lo squilibrio tra i due provoca uno stato di stress ossidativo. Tra le principali fonti di ROS sono i mitocondri 1 . Considerato il loro ruolo nella respirazione cellulare, sono responsabili della maggior parte delle molecole di superossido intracellulare (O 2 - - ) 2 . Ciò è dovuto principalmente alla perdita di elettroni a O 2 al complesso 1 della catena di trasporto di elettroni in condizioni di forte potenziale di membrana mitocondriale negativo (Δψ m ), vale a dire l&#39; iperpolarizzazione mitocondriale. D&#39;altra parte, la depolarizzazione mitocondriale è stata correlata anche con l&#39;aumento della produzione di ROS che punta a più modi di azione 3 , 4 , 5 ,&gt; 6 , 7 , 8 . Inoltre, attraverso modifiche di redox nelle proteine ​​delle macchine di fusione di fissione, ROS co-regola la morfologia mitocondriale 9. Ad esempio, la frammentazione è correlata all&#39;aumento della produzione ROS e all&#39;apoptosi 10 , 11 , mentre i mitocondri filamentosi sono stati legati alla fame nutritiva e alla protezione contro Mitophagy 12 . Data l&#39;intricata relazione tra ROS cellulare e morfofunzione mitocondriale, entrambi dovrebbero essere idealmente quantificati contemporaneamente nelle cellule viventi. Per fare esattamente questo, è stato sviluppato un saggio di imaging ad alto contenuto basato sulla microscopia a larga scala automatizzata e sull&#39;analisi delle immagini delle colture cellulari aderenti colorate con le sonde fluorescenti CM-H 2 DCFDA (ROS) e TMRM (mitocondriali Δψ m e morfologia). L&#39;imaging ad alto contenuto si riferisce all&#39;estrazione di spAtiemodally ricchi ( cioè , un gran numero di funzioni descrittive) informazioni sui fenotipi cellulari utilizzando marcatori complementari multipli e analisi automatiche delle immagini. In combinazione con la microscopia automatizzata molti campioni possono essere proiettati in parallelo ( cioè ad alta velocità) aumentando così la potenza statistica del dosaggio. Infatti, un elemento principale del protocollo è che consente la simultanea quantificazione di più parametri nella stessa cella, e questo per un gran numero di celle e condizioni. Il protocollo è suddiviso in 8 parti (descritte in dettaglio nel protocollo sottostante): 1) Celle di semina in una piastra a 96 pozzetti; 2) Preparazione di soluzioni di magazzino, soluzioni di lavoro e buffer di imaging; 3) Impostazione del microscopio; 4) Caricamento delle cellule con CM-H 2 DCFDA e TMRM; 5) Primo biografo live per misurare i livelli basali ROS e la morfofunzione mitocondriale; 6) Secondo round di immagini in diretta dopo l&#39;aggiunta di tert- butilePerossido (TBHP) per misurare i livelli di ROS indotti; 7) Analisi automatica delle immagini; 8) Analisi dei dati, controllo della qualità e visualizzazione. Il dosaggio è stato originariamente sviluppato per i normali fibroblasti umani umani (NHDF). Poiché queste celle sono grandi e piatte, sono adatte per la valutazione della morfologia mitocondriale nelle immagini 2D widefield 13 , 14 . Tuttavia, con modifiche minori, questo metodo è applicabile ad altri tipi di cellule aderenti. Inoltre, accanto alla combinazione di CM-H 2 DCFDA e TMRM, il flusso di lavoro è conforme a una varietà di coppie di coloranti fluorescenti con diverse specificità molecolari 1 , 15 .

<table><tbody><tr><td><forte>Reagenti</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetrametilrodamina, estere metilico, perclorato (TMRM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T668</td><td></td></tr><tr><td>CM-H2DCFDA (Indicatore generale di stress ossidativo)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C6827</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido</td><td>Sigma)Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>MatriPlate 96-Well Fondo in vetro Piastra MicroWell 630 &; L-Nero 0,17 mm Vetro basso con coperchio</td><td>Sistemi per scienze della vita Brooks</td><td>MGB096-1-2-LG-L</td><td></td></tr><tr><td>HBSS senza fenolo rosso 500 mL</td><td>Lonza</td><td>BE10-527F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM alto glucosio con L-glutammina</td><td>Lonza</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato Bufered Saline (PBS) senza Ca e Mg</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M 500 mL</td><td>Lonza</td><td>17-737F</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di tripsina-versene (EDTA)</td><td>Lonza</td><td>BE17-161E</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure F(ab')2 Frammento Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson</td><td>711-166-152</td><td>Anticorpo utilizzato per l'acquisizione di immagini a campo piatto</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Frammento Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson</td><td>711-546-152</td><td>Anticorpo utilizzato per l'acquisizione di immagini a campo piatto</td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Ti eclipse widefield microscope</td><td>Nikon</td> Perfect Focus System (PFS)Nikon <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>basato su hardware sistema di messa a fuoco automatica</td></tr><tr><td>CFI Plan Apo Lambda 20X obiettivo</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS Elelements Advanced Research 4.5 con modulo JOBS</td><td>Nikon</td><td></td><td>Questo software viene utilizzato per guidare il microscopio e programmare/eseguire il protocollo di acquisizione automatica delle immagini</td></tr><tr><td>ImageJ (FIJI) Versione 2.0.0-rc-43/1.50g</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RStudio Versione 1.0.44</td><td>Rstudio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R versione 3.3.2</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

profilatura cellulare redox usando la microscopia ad alto contenuto

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Le specie reattive di ossigeno (ROS) regolano i processi cellulari essenziali, inclusi l&#39;espressione genica, la migrazione, la differenziazione e la proliferazione. Tuttavia, livelli eccessivi di ROS inducono uno stato di stress ossidativo, accompagnato da danni ossidativi irreversibili al DNA, ai lipidi e alle proteine. Quindi, la quantificazione di ROS fornisce un proxy diretto per la condizione di salute cellulare. Poiché i mitocondri sono tra le principali fonti cellulari e gli obiettivi della ROS, l&#39;analisi congiunta della funzione mitocondriale e della produzione ROS nelle stesse cellule è fondamentale per una migliore comprensione dell&#39;interconnessione in condizioni fisiopatologiche. Pertanto, è stata sviluppata una strategia basata su microscopia ad alto contenuto per la quantificazione simultanea dei livelli ROS intracellulari, del potenziale della membrana mitocondriale (ΔΨ m ) e della morfologia mitocondriale. Si basa su microscopia automatizzata a fluorescenza a larga scala e analisi delle immagini di cellule adesive viventi, coltivate in piastre a più pozzetti e staineD con le cellule-permeabili fluorescenti reporter molecole CM-H 2 DCFDA (ROS) e TMRM (ΔΨ m e morfologia mitocondriale). In contrasto con la fluorimetria o la cytometria a flusso, questa strategia consente di quantificare i parametri subcellulari a livello della singola cellula con elevata risoluzione spaziale, sia prima che dopo la stimolazione sperimentale. Importante, la natura basata sull&#39;immagine del metodo consente di estrarre parametri morfologici oltre alle intensità del segnale. Il set di funzioni combinato viene utilizzato per l&#39;analisi dei dati multivariata esplorativa e statistica per rilevare le differenze tra sottopopolazioni, tipi di cellule e / o trattamenti. Qui viene fornita una descrizione dettagliata del dosaggio, insieme ad un esperimento di esempio che dimostra il suo potenziale per una discriminazione inequivocabile tra stati cellulari dopo la perturbazione chimica.

Il dosaggio è stato valutato utilizzando diversi esperimenti di controllo, i cui risultati sono descritti in Sieprath et al. 1 . In breve, la risposta di fluorescenza di CM-H 2 DCFDA e TMRM a variazioni indotte in modo estraneo nei ROS intracellulari e in ψ m, è stata quantificata per determinare la gamma dinamica. Per CM-H 2 DCFDA, NHDF ha mostrato un aumento lineare nel segnale di fluorescenza quando trattato con concent...

Questo documento presenta un flusso di lavoro di microscopia ad alto contenuto per la quantificazione simultanea dei livelli ROS intracellulari, nonché il potenziale e la morfologia della membrana mitocondriale - definiti congiuntamente come morfofunzione mitocondriale - nelle cellule adesive viventi utilizzando le molecole reporter fluorescenti per cellule permeanti 5- 6) clorometil-2 &#39;, 7&#39;-diclorodidro-fluoresceina diacetato, acetil estere (CM-H 2 DCFDA) e tetrametilrodamina metilestere (TMRM).

Profilatura cellulare Redox usando la microscopia ad alto contenuto

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

L'obiettivo generale di questo metodo basato sulla microscopia ad alto contenuto è quantificare simultaneamente la morfofunzione mitocondriale e i livelli cellulari di specie reattive dell'ossigeno, al fine di stabilire un'impronta redox robusta per linee cellulari esposte a diverse perturbazioni sperimentali. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella biologia redox, come ad esempio se condizioni patogeniche o trattamenti con composti inducano stress ossidativo, e in quale misura vengano influenzate la forma e la funzione mitocondriali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che tutti i parametri possono essere misurati all'interno della stessa cellula nello stesso momento.Per iniziare la procedura, seminare da ottomila a diecimila fibroblasti dermici umani in 60 pozzetti interni di una piastra nera a 96 pozzetti con fondo in polistirene sottile continuo o in vetro. Quando si utilizzano condizioni, trattamenti o linee cellulari diversi, distribuire i punti di semina in modo omogeneo sulla piastra per minimizzare gli effetti di posizione. Successivamente, seminare ulteriori da ottomila a diecimila cellule nel pozzetto B01 da utilizzare per la regol

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Biologia

Livello di specie reattive di ossigeno è elevata quando le cellule incontrano condizioni di stress. Qui si mostra l'esempio di 3'-3 'colorazione diaminobenzidina così come l'etichettatura cysTMT e spettrometria di massa per analizzare il proteoma redox...

Profiling tiolo Proteome Redox Utilizzando tag spettrometria di massa isotopica

Fonte: Katsalifis, A., et al. Imaging dal vivo dello stato redox del glutatione mitocondriale nei neuroni primari utilizzando un indicatore raziometrico. J. Vis. Exp. (2021)Questo video mostra l'imaging dello stato redox mitocondriale nei neuroni primari utilizzando un indicatore fluorescente raziometrico. Applicando due lunghezze d'onda di eccitazione al microscopio a fluorescenza, viene misurato il rapporto di intensità della fluorescenza per valutare l'ossidazione mitocondriale. Il...

Imaging dello stato redox mitocondriale nei neuroni primari utilizzando un indicatore raziometrico

Questo manoscritto descrive l'uso di reporters fluorogenic geneticamente codificati in un'applicazione di imaging di cellule vive per l'esame dello stress ossidativo indotto da xenobiotici. Questo approccio sperimentale offre ineguagliabile risoluzione spazio-temporale, sensibilità e specificità, evitando molte delle lacune dei metodi convenzionali utilizzati per la rilevazione dello sforzo ossidativo tossicologico.

Approcci alla valutazione dello Stress ossidativo tossicologici utilizzando geneticamente codificato Fluorogenic sensori di imaging

Qui, presentiamo un protocollo per rilevare le specie di ossigeno reattivo totale (ROS) utilizzando 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA). Questo metodo può visualizzare la localizzazione cellulare ROS in cellule aderenti con un microscopio a fluorescenza e quantificare l'intensità ROS con un lettore di lastre di fluorescenza. Questo protocollo è semplice, efficiente e conveniente.

Rilevamento di specie di ossigeno reattive totali nelle cellule aderenti entro il 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate

Questo protocollo descrive la valutazione dello stato di redox subcellulare specifico del compartimento all'interno della cella. Una sonda fluorescente redox-sensibile consente una comoda analisi ratiometrica nelle cellule intatte.

Valutazione dell'ossidazione cellulare utilizzando una proteina fluorescente verde sensibile al comparto subcellulare

Descriviamo i protocolli per misurare il pH, gli eventi ossidativi e la digestione delle proteine in singoli macropinosomi in cellule vive. L'accento è posto sulla microscopia a doppio fluoroforo ratiometrico e sui vantaggi che offre rispetto alle tecniche basate sulla popolazione.

Misurazione del pH, delle sostanze chimiche redox e della capacità degradativa dei macropinosomi utilizzando la microscopia a doppio fluoroforo

Questo articolo descrive un protocollo per determinare le differenze nello stato redox basale e le risposte redox alle perturbazioni acute nei neuroni primari dell'ippocampo e corticale utilizzando la microscopia confocale dal vivo. Il protocollo può essere applicato ad altri tipi di cellule e microscopi con modifiche minime.

Imaging dal vivo dello stato redox del glutatione mitocondriale nei neuroni primari utilizzando un indicatore raziometrico

Questo protocollo descrive l'imaging a fluorescenza e l'analisi dei coenzimi metabolici endogeni, della nicotinamide adenina ridotta (fosfato), del dinucleotide (NAD(P)H) e dell'adenina dinucleotide della flavina ossidata (FAD). L'imaging a autofluorescenza di NAD(P)H e FAD fornisce un metodo non distruttivo privo di etichette per valutare il metabolismo cellulare.

Imaging ad autofluorescenza per valutare il metabolismo cellulare

Qui, proponiamo un protocollo sistematizzato, accessibile e riproducibile per rilevare le specie reattive dell'ossigeno cellulare (ROS) utilizzando la sonda di diacetato 2′,7′-diclorofluoresceina (DCFH-DA) nelle cellule gliali di Müller (MMC). Questo metodo quantifica i livelli totali di ROS cellulare con un citometro a flusso. Questo protocollo è molto facile da usare, adatto e riproducibile.

Quantificazione di specie reattive dell'ossigeno utilizzando la sonda di diacetato di 2′,7′-diclorofluoresceina e la citometria a flusso nelle cellule gliali di Müller

Questo protocollo descrive un nuovo metodo per quantificare le specie reattive dell'ossigeno (ROS) intracellulari utilizzando il diidroetidio (DHE) come sonda colorante a fluorescenza utilizzando un approccio di screening ad alto rendimento. Il protocollo descrive i metodi per la valutazione quantitativa delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) intracellulari nelle tre diverse linee cellulari di carcinoma epatocellulare.

Valutazione dello screening ad alto rendimento della generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) utilizzando il colorante a fluorescenza diidroetidio (DHE)

Utilizzando una piattaforma multimodale che combina modalità di imaging ottico label-free, abbiamo sviluppato un protocollo per la visualizzazione e la quantificazione delle dinamiche cellulari e del metabolismo. Attraverso l'imaging tramite fluorescenza multifotone, generazione di seconda armonica e microscopia a scattering Raman stimolato, possiamo generare una panoramica olistica dell'ambiente cellulare e molecolare.

Piattaforma di imaging ottico multimodale per lo studio del metabolismo cellulare

Impara a quantificare simultaneamente i livelli di ROS intracellulari e la morfofunzione mitocondriale nelle cellule aderenti utilizzando la microscopia ad alto contenuto con sonde fluorescenti.

Profilatura cellulare Redox usando la microscopia ad alto contenuto

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