Profilatura cellulare Redox usando la microscopia ad alto contenuto

L'obiettivo generale di questo metodo basato sulla microscopia ad alto contenuto è quantificare simultaneamente la morfofunzione mitocondriale e i livelli cellulari di specie reattive dell'ossigeno, al fine di stabilire un'impronta redox robusta per linee cellulari esposte a diverse perturbazioni sperimentali. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella biologia redox, come ad esempio se condizioni patogeniche o trattamenti con composti inducano stress ossidativo, e in quale misura vengano influenzate la forma e la funzione mitocondriali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che tutti i parametri possono essere misurati all'interno della stessa cellula nello stesso momento.

Per iniziare la procedura, seminare da ottomila a diecimila fibroblasti dermici umani in 60 pozzetti interni di una piastra nera a 96 pozzetti con fondo in polistirene sottile continuo o in vetro. Quando si utilizzano condizioni, trattamenti o linee cellulari diversi, distribuire i punti di semina in modo omogeneo sulla piastra per minimizzare gli effetti di posizione. Successivamente, seminare ulteriori da ottomila a diecimila cellule nel pozzetto B01 da utilizzare per la regolazione del fuoco.

Successivamente, riempire le pozzette esterne vuote con del mezzo per minimizzare i gradienti tra le pozzette e l'ambiente circostante. Toccare delicatamente la piastra tre volte prima di riposizionarla nell'incubatore, per evitare che le cellule crescano in chiazze. Coltivare le cellule per 24 ore, oppure fino al raggiungimento di una confluenza del 70%.

In seguito, salvare le informazioni sul trattamento per l'esperimento in un foglio di calcolo denominato setup. Per configurare il microscopio, calibrare prima lo stadio XY utilizzando il software. Successivamente, creare un protocollo di acquisizione per una piastra a pozzetti multipli utilizzando il software di acquisizione.

Questo protocollo consente l'acquisizione automatica di posizioni predefinite e delle pozzette selezionate di una piastra a 96 pozzette. Selezionare ora il tipo corretto di piastra multipozzetta da un elenco di piastre disponibili fornito all'interno del software. In alternativa, definire il formato della piastra multipozzetta utilizzando le dimensioni della piastra e delle pozzette.

Quindi, allineare la piastra a pozzetti definendo due angoli dei quattro pozzetti angolari esterni. Successivamente, selezionare i pozzetti da acquisire e definire un protocollo di acquisizione costituito da un'acquisizione sequenziale di lunghezze d'onda. Assicurarsi che il canale GFP sia impostato per primo.

Quindi, definire un ciclo per la piastra a pozzetti per acquisire quattro immagini regolarmente distanziate e non sovrapposte, posizionate intorno al centro di ciascun pozzetto selezionato, utilizzando il protocollo di acquisizione definito. In questo passaggio, preparare la soluzione di colorazione per 60 pozzetti aggiungendo la soluzione stock di CM-H2DCFDA e TMRM al buffer HBSS HEPES. Successivamente, rimuovere il mezzo di coltura dalle cellule capovolgendo la piastra con un unico movimento fluido.

Lavare delicatamente le cellule due volte con il buffer HH. Non dimenticare il pozzetto A01 con le cellule utilizzate per la regolazione della messa a fuoco. Rimuovere il buffer HH tra i passaggi di lavaggio.

Quindi, carichi le cellule con CM-H2DCFDA e TMRM aggiungendo 100 microlitri della soluzione di colorazione a ciascun pozzetto. Ancora una volta, non dimentichi il pozzetto A01. Incubi le cellule per 25 minuti al buio a temperatura ambiente.

Dopo 25 minuti, lavare le cellule due volte con 100 microlitri di tampone HH e aggiungere 100 microlitri di tampone HH in tutte e 60 le pozzette interne. Per eseguire la misurazione effettiva, posizionare la piastra sul microscopio. Successivamente, accendere il sistema hardware di messa a fuoco automatica e regolare l'offset della messa a fuoco automatica utilizzando la pozzetta B01 e il canale TMRM fino a ottenere un'immagine nitida.

Successivamente, eseguire il protocollo di imaging. Il set di dati dell'immagine risultante fornirà informazioni sui livelli basali di ROS, sul potenziale di membrana mitocondriale e sulla morfologia mitocondriale. In seguito, per misurare i livelli indotti di ROS, rimuovere con attenzione la piastra a 96 pozzetti dal microscopio.

Aggiungere 100 microlitri di soluzione di TBHP a 40 micromolare in ogni pozzetto e attendere almeno tre minuti per consentire la completa reazione del TBHP con il CM-H2DCFDA. Durante questo periodo, aggiungere 100 microlitri della soluzione anticorpale di lavoro nel pozzetto A01. A questo punto, rimontare la piastra sul microscopio e verificare nuovamente il fuoco utilizzando il pozzetto B01.

Quindi, acquisire le stesse posizioni della prima sessione di acquisizione mediante lo stesso protocollo di imaging. Il set di dati ottenuto fornirà informazioni sui livelli di ROS indotti. Successivamente, acquisire immagini di campo piatto nel pozzetto A01.

Assicurarsi che i segnali siano ben all'interno del range dinamico, regolando le impostazioni di acquisizione. Successivamente, esportare i set di dati acquisiti in una singola cartella come file TIFF individuali utilizzando una nomenclatura standardizzata.

Questo include il riferimento alla piastra, prima o dopo il trattamento con TBHP, pozzetto, campo e canale, separati da trattini bassi. Inoltre, salvare le immagini del campo piatto nella stessa cartella come file TIFF individuali utilizzando la nomenclatura standardizzata. In questo passaggio, aprire il software di elaborazione delle immagini e installare il macroset per le metriche redox.

Quindi, aprire l'interfaccia di configurazione per impostare le impostazioni di analisi facendo clic sul pulsante S. Selezionare il tipo di immagine, il numero di canali e la pozzetta utilizzata per acquisire le immagini del campo piatto. Successivamente, indicare quale canale contiene le cellule o le mitocondrie.

Selezionare le caselle di controllo "background" e "enhance" per eseguire rispettivamente la sottrazione del fondo e l'equalizzazione adattiva dell'istogramma con limite al contrasto. Successivamente, definire un valore sigma per il filtro gaussiano e per l'appiattimento delle cellule e per il potenziamento laplaciano dei mitocondri. Selezionare un algoritmo di sogliatura automatica e inserire i limiti di esclusione dimensionale.

Quindi, testare le impostazioni di segmentazione su alcune immagini selezionate dei set di dati acquisiti aprendole e facendo clic sui pulsanti C o M nel menu per la segmentazione delle cellule o dei mitocondri, rispettivamente. Successivamente, eseguire l'analisi batch sulla cartella di interesse facendo clic sul pulsante cancelletto e selezionando la cartella contenente le immagini. Verificare le impostazioni e premere ok.

Dopo l'analisi batch, verificare visivamente le prestazioni della segmentazione su un insieme di verifica cliccando sul pulsante V e selezionando la cartella con le immagini. Esaminare l'intero insieme di verifica per confermare che la segmentazione sia stata eseguita correttamente. L'analisi iniziale dei dati estratti viene effettuata automaticamente mediante un'applicazione Shiny fornita gratuitamente.

Questo consente un'interpretazione rapida dei risultati. Per iniziare, aprire l'applicazione in R Studio. Scegliere di eseguirla in un browser esterno.

Nella pagina di input, selezionare la directory in cui si trovano i file dei risultati. Assicurarsi che anche il file di configurazione sia presente in questa directory. I file dei risultati e le informazioni di configurazione vengono importati, compilati e visualizzati automaticamente.

La pagina della configurazione sperimentale mostra la disposizione dell'esperimento. La pagina successiva visualizza i livelli di ROS e diversi parametri mitocondriali per ciascuna piastra separatamente. Selezionare la piastra che si desidera visualizzare utilizzando il menu a tendina.

I dati sono mostrati in un formato di piastra multi-well, nonché in grafici a scatola (box plot) con gli outlier etichettati con il numero del well e dell'immagine. La pagina dei risultati dell'intero esperimento mostra i risultati normalizzati di tutte le piastre combinate, insieme a un'analisi statistica di base. Se viene fornito un file di esclusione tramite la pagina di input, i punti dati specificati verranno esclusi.

Nella pagina dell'analisi dei cluster, viene elaborato un profilo redox sensibile mediante un'analisi delle componenti principali su dati provenienti da cinque parametri. Infine, la pagina di download dei dati consente di salvare i dati elaborati e riorganizzati per utilizzi successivi. Qui vengono mostrati i risultati di un esperimento in cui fibroblasti dermici umani sono stati trattati con l'inibitore della proteasi dell'HIV Saquinavir.

Utilizzando il protocollo descritto, è stato rilevato un significativo aumento sia dei livelli basali che di quelli indotti di ROS. Rispetto alle cellule di controllo, trattate con DMSO. Saquinavir ha inoltre significativamente influenzato la morfofunzione mitocondriale.

Il potenziale della membrana mitocondriale, misurato come segnale medio di TMRM per pixel mitocondriale, è aumentato in modo significativo. Inoltre, i mitocondri hanno assunto un aspetto altamente frammentato, indicato quantitativamente da una maggiore circolarità e da una dimensione media più piccola dei singoli mitocondri. Combinando i parametri sopra menzionati mediante analisi delle componenti principali, le condizioni di controllo e quelle con Saquinavir possono essere chiaramente distinte l'una dall'altra in base alle loro impronte redox.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che l'illuminazione stessa provoca stress ossidativo. Pertanto, le condizioni di esposizione devono essere ridotte al minimo e mantenute costanti per tutta la durata dell'esperimento. Una volta acquisita padronanza, è possibile colorare e acquisire fino a 20 piastre a 96 pozzetti in un solo giorno.

Dopo il secondo ciclo di acquisizione delle immagini, le cellule possono essere fissate e utilizzate per una successiva colorazione immunofluorescente. Questo aumenta il numero di parametri misurati sulle stesse identiche cellule e permette di rispondere ad ulteriori domande. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe essere in grado di eseguire misurazioni combinate di ROS e morfofunzionalità mitocondriale in colture cellulari aderenti, utilizzando la microscopia ad alto contenuto.