Profilatura cellulare Redox usando la microscopia ad alto contenuto

L'obiettivo generale di questo metodo basato sulla microscopia ad alto contenuto è quello di quantificare simultaneamente la morfofunzione mitocondriale e i livelli cellulari delle specie reattive dell'ossigeno in modo da stabilire una robusta impronta redox per le linee cellulari esposte a diverse perturbazioni sperimentali. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella biologia redox, come ad esempio se le condizioni patogene o i trattamenti composti provocano stress ossidativo e in che misura la forma e la funzione mitocondriale sono influenzate. Il vantaggio principale di questa tecnica è che tutti i parametri possono essere misurati contemporaneamente all'interno della stessa cella.

Per iniziare la procedura, seminare da 8 a 10.000 fibroblasti dermici umani in 60 pozzetti interni di una piastra nera da 96 pozzetti con un sottile fondo continuo in polistirene o vetro. Quando si utilizzano condizioni, trattamenti o linee cellulari diversi, distribuire le posizioni di semina in modo omogeneo sulla piastra per ridurre al minimo gli effetti della piastra. Quindi, seminare altre 8-10.000 cellule nel pozzetto B01 da utilizzare per la regolazione della messa a fuoco.

Successivamente, riempire i pozzi esterni vuoti con del terreno per ridurre al minimo le pendenze tra i pozzi e l'ambiente. Picchiettare delicatamente la piastra tre volte prima di rimetterla nell'incubatrice per evitare che le cellule crescano a chiazze. Coltivare le cellule per 24 ore, o fino a quando non raggiungono il 70% di confluenza.

Successivamente, salva le informazioni sul trattamento per l'esperimento in un foglio di calcolo chiamato configurazione. Per configurare il microscopio, calibrare prima il tavolino XY utilizzando il software. Quindi, creare un protocollo di imaging per una piastra multipozzetto utilizzando il software di acquisizione.

Questo protocollo consente l'acquisizione automatica delle posizioni impostate e dei pozzetti selezionati di una piastra a 96 pozzetti. A questo punto, selezionare il tipo corretto di piastra multipozzetto da un elenco di piastre disponibili fornito all'interno del software. In alternativa, definire il formato della piastra a più pozzetti utilizzando le dimensioni della piastra e del pozzetto.

Quindi, allineare la piastra del pozzetto definendo due angoli dei quattro pozzetti d'angolo esterno. Successivamente, selezionare i pozzetti che devono essere acquisiti e definire un protocollo di acquisizione costituito da un'acquisizione sequenziale della lunghezza d'onda. Assicurarsi che il canale GFP sia impostato per primo.

Quindi, definire un loop di piastre a pozzetti per acquisire quattro immagini a spaziatura regolare e senza sovrapposizioni posizionate attorno al centro di ciascun pozzetto selezionato utilizzando il protocollo di acquisizione definito. In questa fase, preparare la soluzione colorante per 60 pozzetti aggiungendo la soluzione madre CM-H2DCFDA e TMRM al tampone HEPES HBSS. Quindi, scartare il terreno di coltura dalle cellule capovolgendo la piastra con un unico movimento fluido.

Lavare delicatamente le cellule due volte con tampone HH. Non dimenticare bene A01 con le celle utilizzate per la regolazione della messa a fuoco. Eliminare il tampone HH tra le fasi di lavaggio.

Quindi, caricare le celle con CM-H2DCFDA e TMRM aggiungendo 100 microlitri della soluzione colorante a ciascun pozzetto. Ancora una volta, non dimenticare bene A01. Incubare le cellule per 25 minuti al buio a temperatura ambiente.

Dopo 25 minuti, lavare le cellule due volte con 100 microlitri di tampone HH e aggiungere 100 microlitri di tampone HH a tutti i 60 pozzetti interni. Per eseguire la misurazione effettiva, installare la piastra sul microscopio. Quindi, attiva il sistema di messa a fuoco automatica basato su hardware e regola l'offset dell'autofocus utilizzando il pozzo B01 e il canale TMRM fino a ottenere un'immagine nitida.

Successivamente, eseguire il protocollo di imaging. Il set di dati dell'immagine risultante fornirà informazioni sui livelli basali di ROS, sul potenziale di membrana mitocondriale e sulla morfologia mitocondriale. Successivamente, per misurare i livelli di ROS indotti, rimuovere con cautela la piastra a 96 pozzetti dal microscopio.

Aggiungere 100 microlitri di soluzione TBHP a 40 micromolari in ciascun pozzetto e attendere almeno tre minuti per consentire la reazione completa del TBHP con il CM-H2DCFDA. Durante questo periodo, aggiungere 100 microlitri della soluzione di lavoro dell'anticorpo al pozzetto A01. A questo punto, rimontare la piastra sul microscopio e controllare nuovamente la messa a fuoco utilizzando il pozzetto B01.

Quindi, acquisire le stesse posizioni del primo ciclo di imaging utilizzando lo stesso protocollo di imaging. Il set di dati dell'immagine risultante fornirà informazioni sui livelli di ROS indotti. Successivamente, acquisire immagini in campo piatto nel pozzo A01.

Assicurati che i segnali siano ben all'interno della gamma dinamica. Regolando le impostazioni di acquisizione. Successivamente, esportare i set di dati acquisiti in un'unica cartella come singoli file TIFF utilizzando la nomenclatura standardizzata.

Ciò include il riferimento alla piastra, al trattamento pre o post TBHP, al pozzetto, al campo e al canale separati da trattini bassi. Inoltre, salva le immagini flat field nella stessa cartella dei singoli file TIFF utilizzando la nomenclatura standardizzata. In questo passaggio, apri il software di elaborazione delle immagini e installa il macroset di metriche redox.

Quindi, apri l'interfaccia di configurazione per impostare le impostazioni di analisi facendo clic sul pulsante S. Selezionare il tipo di immagine, il numero di canali e il pozzetto utilizzato per acquisire le immagini in campo piatto. Successivamente, indica quale canale contiene cellule o mitocondri.

Seleziona le caselle di controllo Sfondo e Migliora per eseguire rispettivamente la sottrazione dello sfondo e l'equalizzazione dell'istogramma adattivo con contrasto limitato. Successivamente, definisci un sigma per la gaussiana e la sfocatura delle cellule e l'aumento laplaciano dei mitocondri. Selezionare un algoritmo di soglia automatica e inserire i limiti di esclusione delle dimensioni.

Quindi, testare le impostazioni di segmentazione su alcune immagini selezionate dei set di dati acquisiti aprendole e facendo clic sui pulsanti C o M nel menu rispettivamente per la segmentazione delle cellule o dei mitocondri. A seguire, dall'analisi batch sulla cartella di interesse cliccando sul pulsante cancelletto e selezionando la cartella con le immagini. Verificare le impostazioni e premere OK.

Dopo l'analisi batch, verifica visivamente le prestazioni della segmentazione su uno stack di verifica facendo clic sul pulsante V e selezionando la cartella con le immagini. Esamina lo stack di verifica per confermare se la segmentazione è andata a buon fine. L'analisi iniziale dei dati estratti viene eseguita automaticamente con un'applicazione Shiny gratuita.

Ciò consente una rapida interpretazione dei risultati. Per iniziare, aprire l'applicazione in R Studio. Scegli di eseguirlo in un browser esterno.

Nella pagina di input, selezionare la directory in cui si trovano i file dei risultati. Assicurarsi che il file di installazione sia presente anche in questa directory. I file dei risultati e le informazioni di configurazione vengono importati, compilati e visualizzati automaticamente.

La pagina di configurazione dell'esperimento mostra il layout dell'esperimento. La pagina successiva mostra separatamente i livelli di ROS e diversi parametri mitocondriali per ciascuna piastra. Seleziona la piastra che desideri visualizzare utilizzando il menu a discesa.

I dati vengono visualizzati in un formato di piastra a più pozzetti, nonché in box plot con valori anomali etichettati con il numero del pozzetto e dell'immagine. La pagina dell'intero esperimento mostra i risultati normalizzati di tutte le piastre combinate, insieme a un'analisi statistica di base. Se viene fornito un file di rilascio tramite la pagina di input, i punti dati specificati verranno esclusi.

Nella pagina di analisi dei cluster, un profilo redox sensibile viene composto utilizzando un componente principale e l'analisi dei dati da cinque parametri. Infine, la pagina dei dati di download consente di salvare i dati elaborati e riorganizzati per un ulteriore utilizzo. Di seguito sono riportati i risultati di un esperimento in cui i fibroblasti dermici umani sono stati trattati con l'inibitore della proteasi dell'HIV Saquinavir.

Utilizzando il protocollo descritto, è stato rilevato un aumento significativo sia per i livelli basali che per quelli indotti. Rispetto alle cellule di controllo, trattate con DMSO. Saquinavir ha anche influenzato significativamente la morfofunzione mitocondriale.

Il potenziale di membrana mitocondriale misurato come segnale TMRM medio per pixel mitocondriale è aumentato in modo significativo. Inoltre, i mitocondri hanno acquisito un modello altamente frammentato, quantitativamente indicato da una maggiore circolarità e da una dimensione media più piccola dei singoli mitocondri. Combinando i parametri di cui sopra utilizzando l'analisi dei componenti principali, sia le condizioni di controllo che quelle di Saquinavir potrebbero essere chiaramente separate l'una dall'altra dalle loro impronte digitali redox.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che l'illuminazione stessa provoca stress ossidato. Pertanto, le condizioni di esposizione devono essere ridotte al minimo e mantenute costanti durante l'esperimento. Una volta padroneggiate, è possibile colorare e acquisire fino a 20 piastre da 96 pozzetti in un giorno.

Dopo il secondo ciclo di imaging, le cellule possono essere fissate e utilizzate per una colorazione immunofluorescente a valle. Ciò aumenta il numero di parametri misurati sulle stesse celle e consente di rispondere a ulteriori domande. Dopo aver visto questo video, dovresti essere in grado di eseguire le misurazioni combinate dei ROS e della morfofunzione mitocondriale in colture cellulari aderenti utilizzando la microscopia ad alto contenuto.