Misurazione del pH, delle sostanze chimiche redox e della capacità degradativa dei macropinosomi utilizzando la microscopia a doppio fluoroforo

Descriviamo i protocolli per misurare il pH, gli eventi ossidativi e la digestione delle proteine in singoli macropinosomi in cellule vive. L'accento è posto sulla microscopia a doppio fluoroforo ratiometrico e sui vantaggi che offre rispetto alle tecniche basate sulla popolazione.

Questo protocollo consente la valutazione in tempo reale di vari processi e parametri biochimici all'interno del lume dei singoli macropinosomi. Questi metodi possono essere impiegati per la scoperta di farmaci nella biologia cellulare della macropinocitosi. Questo protocollo offre il vantaggio di rivelare l'eterogeneità sia a livello cellulare che a livello di organelli.

Un giorno prima del test semina raw264.7 cellule ad una densità di cinque volte 10 alla potenza delle cellule in 100 microlitri per pozzetto, in una piastra di fondo di vetro a 96 pozzetti con lati neri. Il giorno del test verificare se i pozzi sono confluenti almeno al 70%. Quindi lavare tutti i pozzi con 100 microlitri di HBSS, preriscaldati a 37 gradi Celsius.

Quindi, aggiungere 100 microlitri di HBSS contenenti 0,025 milligrammi per millilitro di TMR etichettati 70 kilodalton destrano e 0,025 milligrammi per millilitro di fluoresceina etichettati 70 kilodalton destrano in ciascun pozzo, quindi incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Al termine dell'incubazione, rimuovere la piastra dall'incubatore e lavare le cellule sei volte con 100 microlitri di HBSS. Dopo l'ultimo lavaggio aggiungere 100 microlitri di HBSS preriscaldato alle cellule, quindi posizionare la piastra su un microscopio con uno stadio e una camera riscaldati.

Dopo aver regolato i parametri di eccitazione ed emissione per TMR e fluoresceina secondo necessità, acquisire un'immagine da ciascun pozzo alternando tra i due fluorofori tra ciascun pozzo. Dopo la prima acquisizione, verificare se tutti i pozzi sono rimasti a fuoco su tutta la piastra, quindi acquisire le immagini di ciascun pozzo a intervalli da uno a 15 minuti per il periodo di tempo desiderato. Durante l'acquisizione dell'immagine, regolare il pH di un'aliquota di 50 millilitri di una soluzione ricca di potassio tamponata con HEPES da 25 millimolari a 7,5 utilizzando 10 molari cloridrico o 10 molari idrossido di potassio secondo necessità.

Quindi regolare il pH di aliquote di 350 millilitri della soluzione ricca di potassio tamponata con MES da 25 millimolari a pH 6,5, pH 5,5 e pH 5,0. Una volta completata l'acquisizione dell'immagine, rimuovere l'HBSS dalla piastra a 96 pozzi contenente le cellule e aggiungere la soluzione ricca di potassio a pH 7,5. Quindi aggiungere Nigericina ad una concentrazione finale di 10 microgrammi per millilitro.

Posizionare la piastra sul microscopio e acquisire le immagini di ciascun pozzo utilizzando le stesse impostazioni di acquisizione dimostrate in precedenza. Per misurare gli eventi ossidativi all'interno dei macropinosomi, seminare le cellule RAW264.7 in una piastra a 96 pozzetti un giorno prima del test, come dimostrato in precedenza. Quindi il giorno del test lavare tutti i pozzi con 100 microlitri di HBSS preriscaldati a 37 gradi Celsius.

Quindi, aggiungere 100 microlitri di HBSS contenenti 0,025 milligrammi per millilitro di TMR etichettati 70 kilodalton destrano e 0,025 milligrammi per millilitro di H2DCFDA etichettati 70 kilodalton destro a ciascun pozzo, quindi incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Dopo aver rimosso la piastra dall'incubatore, lavare le celle sei volte con 100 microlitri di HBSS. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 100 microlitri di HBSS a ciascun pozzo e posizionare la piastra sul microscopio.

Dopo aver regolato i parametri di eccitazione ed emissione per TMR e H2DCFDA secondo necessità, acquisire le immagini di ciascun pozzo a intervalli da uno a 15 minuti, come dimostrato in precedenza. Per misurare la digestione delle proteine all'interno dei macropinosomi, seminare le cellule RAW264.7 un giorno prima del test, come dimostrato in precedenza. Quindi il giorno del test lavare tutti i pozzi con 100 microlitri di HBSS preriscaldati a 37 gradi Celsius.

Successivamente aggiungere 100 microlitri di HBSS contenenti 0,025 milligrammi per millilitro di TMR etichettati 70 kilodalton destrano in 0,2 milligrammi per millilitro BODIPY etichettato ovalbumina a ciascun pozzo. Quindi incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Dopo aver rimosso le cellule dall'incubatrice, lavarle sei volte con 100 microlitri di HBSS.

Dopo l'ultimo lavaggio aggiungere 100 microlitri di HBSS a ciascun pozzo, quindi posizionare la piastra sul microscopio. Dopo aver regolato i parametri di eccitazione ed emissione per TMR e BODIPY secondo necessità, acquisire immagini di ciascun pozzo a intervalli da uno a 15 minuti, come dimostrato in precedenza. Quando si misura il pH, gli eventi ossidativi o la degradazione proteica nei macropinosomi, la dinamica dell'acidificazione non può essere misurata per un certo periodo di tempo corrispondente alla fase di carico destro, che varia a seconda del tipo di cellula utilizzata.

Quando si misura il pH del macropinosoma, il rapporto fluoresceina/TMR diventerà progressivamente più piccolo e si stabilizzerà entro i 15 minuti dall'acquisizione. Questo plateau corrisponde a un pH di circa cinque, che corrisponde approssimativamente al pH dei lisosomi. Al termine di ogni acquisizione, viene eseguita una calibrazione in situ.

Il rapporto fluoresceina/TMR dovrebbe essere maggiore all'interno del tampone di taratura a pH 7,5 e diventare progressivamente più piccolo man mano che i tamponi di taratura diventano più acidi. Ciò consente la generazione di una curva di calibrazione. Quando si misurano gli eventi ossidativi all'interno dei macropinosomi, il rapporto tra H2DCFDA e TMR diventerà progressivamente più grande e probabilmente si stabilizzerà entro i primi 20-30 minuti in una raw264.7 attivata.

Quando si misura la digestione delle proteine macropinosomiali, un segnale di fluoresceina progressivamente forte verrà liberato mentre l'ovalbumina viene digerita. Nelle cellule RAW264.7, l'aumento della fluorescenza liberata dall'ovalbumina etichettata BODIPY digerito, si stabilizzerà entro i primi 30 minuti. Con questo ruolo emergente nell'omeostasi e la sua rilevanza appena scoperta per la patologia del cancro, è attualmente in corso una ricerca sulla macropinocitosi rinascimentale.

Questi metodi hanno fornito una cassetta degli attrezzi per esplorare il contributo della macropinocitosi a questi campi di studio.