Un metodo delle celle di aggregazione efficiente e flessibile per il 3D Spheroid Produzione

VOCE NARRANTE: L'obiettivo generale di questo metodo è quello di generare in modo efficiente grandi quantità di robusti sferoidi cellulari mediante aggregazione cellulare per il loro utilizzo in una varietà di saggi basati su cellule. Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizza una matrice solubile in acqua non proteica per l'aggregazione cellulare e la formazione di sferoidi, che consente un facile e rapido isolamento degli sferoidi. Questo metodo può aiutare a raccogliere nuove intuizioni nella biologia cellulare sugli effetti delle interazioni cellula-cellula e cellula/matrice sulla crescita dei tessuti in un microambiente tridimensionale.

VOCE NARRANTE Prima di preparare gli aggregati, scaldare 50 millilitri di acqua ultrapura a 80 gradi Celsius e aggiungere 10 grammi di polvere di metilcellulosa. Agitare la sospensione fino a quando le particelle non si disperdono uniformemente. Quindi aggiungere acqua ultrapura fredda fino a un volume finale di 100 millilitri e conservare le particelle per una notte a 4 gradi Celsius fino a quando la soluzione diventa limpida e di colore paglierino senza solidi visibili.

Passare la soluzione attraverso un filtro da 0,45 micrometri per rimuovere eventuali frammenti non disciolti e diluire 1:5 milligrammi per millilitro della soluzione filtrata nel terreno di coltura appropriato. Quindi filtrare il terreno integrato con metilcellulosa attraverso un colino da 0,22 micrometri. Successivamente, in una cabina di sicurezza biologica, lavare una sottocoltura confluente al 70% con PBS e collegare le cellule con tre millilitri di tampone di associazione tripsina-EDTA in un incubatore per colture cellulari.

Dopo alcuni minuti, ispezionare le cellule al microscopio ottico con un ingrandimento di 10x. Quando le cellule si sono sollevate dalla piastra, neutralizzare la reazione con sette millilitri di terreno di coltura integrato con siero. Trasferire la soluzione cellulare in una provetta fresca da 15 millilitri, quindi raccogliere le cellule liberate mediante centrifugazione.

La causa più comune di una formazione di sferoidi non riuscita, oltre alla contaminazione delle particelle, è l'uso di concentrazioni non ottimali di metilcellulosa o siero per l'aggregazione e la crescita della linea cellulare specifica. VOCE NARRANTE - Utilizzando una micropipetta P1000 con puntale filtrante, triturare il pallet da tre a cinque volte con un millilitro del mezzo di formazione degli sferoidi, premendo il puntale della pipetta contro il fondo del tubo con una leggera angolazione, mentre pipettiamo lentamente senza espellere l'intero contenuto del puntale per pulire il pellet. Dopo il conteggio, diluire la sospensione cellulare a una concentrazione di una volta per 10 fino alla quarta cellula per millilitro e sciacquare un serbatoio di pipetta multicanale sterile con acqua ultrapura filtrata per rimuovere polvere e fibre.

Erogare le cellule nel serbatoio e utilizzare i puntali del filtro per trasferire 100 microlitri di cellule in ciascun pozzetto di una piastra repellente per cellule con fondo a U a 96 pozzetti, mescolando periodicamente la sospensione cellulare per evitare che le cellule si depositino sul fondo del serbatoio. Quando tutte le cellule sono state posizionate, posizionare la piastra in un incubatore per colture tissutali e ispezionare quotidianamente i pozzetti per verificare la presenza di sferoidi. Le cellule dovrebbero depositarsi sul fondo di ciascun pozzetto entro sei ore e generalmente aggregarsi in uno sferoide entro 24-48 ore.

Per confermare la formazione di uno sferoide riuscito, utilizzare una punta P10 al microscopio ottico per pipettare delicatamente il terreno sullo sferoide. Gli sferoidi correttamente formati si allenteranno dalla piastra e rotoleranno, confermando la loro struttura 3D. Per incorporare gli sferoidi nel collagene, utilizzare il pipettaggio inverso per rivestire uniformemente il fondo di ciascun pozzetto di un vetrino da camera di coltura tissutale a otto pozzetti con un minimo di 50 microlitri di collagene neutralizzato per pozzetto.

Quando tutti i pozzetti sono stati coperti, posizionare il vetrino della camera in una piastra di coltura tissutale da 35 millimetri riempita con acqua ultrapura in una piastra di coltura tissutale da 10 centimetri e incubare la piastra di coltura tissutale da 10 centimetri a 37 gradi Celsius per circa un'ora. Quando il collagene si è polimerizzato, utilizzare un puntale filtrante P1000 per trasferire con cura gli sferoidi preformati in provette per microcentrifuga da 1,5 millilitri. È fondamentale che gli strati di base del collagene vengano incubati fino a quando non sono completamente polimerizzati per evitare di disturbare il collagene quando si aggiungono gli sferoidi o il terreno.

Narratore Raccogli gli sferoidi raccolti in una microcentrifuga da tavolo e usa una pipetta P200 per rimuovere i surnatanti, rimuovendo il surnatante in eccesso mediante l'inversione del tubo su un tovagliolo di carta pulito, se necessario. Utilizzando una punta per pipetta P200 a foro largo, risospendere immediatamente gli sferoidi in 50 microlitri di collagene neutralizzato e trasferire con cura le miscele di collagene sferoidale in ciascun pozzetto del vetrino della camera di coltura tissutale a otto pozzetti. Rimettere il vetrino nell'incubatrice fino a quando il collagene non viene polimerizzato.

Dopo circa un'ora, aggiungere lentamente almeno 100 microlitri di terreno di coltura riscaldato contenente il trattamento appropriato di interesse a ciascun pozzetto per un'altra incubazione. Quindi utilizzare un microscopio a fluorescenza per acquisire sezioni di imaging ottico attraverso gli sferoidi invasori. Utilizzando questo protocollo, gli sferoidi possono essere generati da una varietà di linee cellulari.

Nelle condizioni appropriate di trattamento con metilcellulosa e siero, le singole cellule si depositano e aderiscono insieme al centro del pozzetto per formare sferoidi con un'aderenza minima al fondo del pozzetto. Alcune linee cellulari sono in grado di aderire alle piastre repellenti cellulari in assenza o a basse concentrazioni di metilcellulosa, determinando la formazione di uno sferoide circondato da un monostrato cellulare. In generale, concentrazioni più elevate di metilcellulosa impediscono alle cellule di aderire al pozzetto.

Ma una concentrazione troppo alta di metilcellulosa riduce l'adesione da cellula a cellula e impedisce alle cellule di depositarsi sul fondo del pozzetto, con conseguente formazione di aggregati sciolti e numerosi sferoidi satelliti. Gli sferoidi inclusi nel collagene possono essere trattati con un chemioattrattivo per indurre l'invasione delle singole cellule verso l'esterno dello sferoide nella matrice circostante. Gli sferoidi fissi inclusi nel collagene possono essere visualizzati mediante microscopia a campo chiaro per quantificare la distanza e il numero di cellule invasive, o mediante microscopia a immunofluorescenza per visualizzare le strutture invasive formate dalle cellule migranti.

È importante lasciare un tempo sufficiente affinché le cellule si aggreghino in sferoidi strutturalmente sani, sufficientemente robusti per la loro manipolazione senza frammentazione e che possano essere facilmente raccolti per il loro utilizzo in saggi successivi. Il nostro protocollo di crescita cellulare può essere ulteriormente adattato per molteplici saggi di biologia cellulare. Ad esempio, per valutare la resistenza cellanoiosa è possibile posizionare le cellule in terreni integrati con alte concentrazioni di metilcellulosa.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare sferoidi cellulari tridimensionali per aggregazione, che sarà uno strumento prezioso per molte applicazioni di biologia cellulare.