Name: Un metodo delle celle di aggregazione efficiente e flessibile per il 3D Spheroid Produzione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Scopri un metodo rapido e flessibile per generare sferoidi cellulari 3D mediante aggregazione cellulare. Questa tecnica utilizza una matrice idrosolubile non proteica per facilitare l'isolamento rapido degli sferoidi in vari saggi cellulari.

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Gli autori ringraziano M. Gordon del Queen's University Biomedical Imaging Centre per l'assistenza. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni operative della Cancer Research Society of Canada (19439) e del Canadian Institutes for Health Research (MOP-142303) (LMM), e da borse di studio per laureati dell'Ontario e borse di studio dal Terry Fox Research Institute Training Program in Transdisciplinary Cancer Research (SMM, EYL) e da una Craig Jury Summer Scholarship (SMM).

<ol><li>Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+vs.+three-dimensional+in+vitro+tumor+migration+and+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional vs. three-dimensional in vitro tumor migration and invasion assays.</a> Methods Mol Biol. 986 (986), 227-252 (2013).</li>
<li>Albini, A., Noonan, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27chemoinvasion%27+assay%2C+25+years+and+still+going+strong%3A+the+use+of+reconstituted+basement+membranes+to+study+cell+invasion+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The 'chemoinvasion' assay, 25 years and still going strong: the use of reconstituted basement membranes to study cell invasion and angiogenesis.</a> Curr Opin Cell Biol. 22 (5), 677-689 (2010).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).</li>
<li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends Biotechnol. 31 (2), 108-115 (2013).</li>
<li>Carletti, E., Motta, A., Migliaresi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffolds+for+tissue+engineering+and+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Scaffolds for tissue engineering and 3D cell culture.</a> Methods Mol Biol. 695, 17-39 (2011).</li>
<li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> J Vis Exp. (51), (2011).</li>
<li>Handschel, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospects+of+micromass+culture+technology+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Head+Face+Med%22%5BJournal%5D)">Prospects of micromass culture technology in tissue engineering.</a> Head Face Med. 3, 4(2007).</li>
<li>Stuckhoff, A. P., DelValle, L. <a target="_blank" href="http://www.springer.com/us/book/9781627036399">Neuronal Cell Culture Methods and Protocols Vol. 1078 Methods in Molecular Biology</a>. Amini, S., White, M. K. 1078, Humana Press. 119-132 (2013).</li>
<li>Stewart, G. J., Wang, Y., Niewiarowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylcellulose+protects+the+ability+of+anchorage-dependent+cells+to+adhere+following+isolation+and+holding+in+suspension%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Methylcellulose protects the ability of anchorage-dependent cells to adhere following isolation and holding in suspension.</a> Biotechniques. 19 (4), 598-604 (1995).</li>
<li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+establishment+and+analysis+of+three-dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biol. 10, 29(2012).</li>
<li>Nagelkerke, A., Bussink, J., Sweep, F. C. G. J., Span, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+of+breast+cancer+cells%3A+How+to+go+three-dimensional%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Generation of multicellular tumor spheroids of breast cancer cells: How to go three-dimensional.</a> Anal. Biochem. 437 (1), 17-19 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Vi presentiamo un metodo rapido e flessibile per la produzione di sferoidi di cellule 3D per modellare l&#39;architettura dei tessuti in vivo utilizzando reagenti poco costosi e facilmente reperibili. Il nostro protocollo sfrutta le proprietà non citotossiche e adesione di promozione di MC 8, 9 per mediare l&#39;aggregazione delle cellule e ridurre al minimo la formazione di monostrato cellulare. Diversamente matrici a base di proteine ​​isolate da font...

Biologicamente rilevanti valutazione del comportamento delle cellule tumorali è impegnativo utilizzando tradizionali bidimensionali (2D) metodologie di coltura cellulare, in parte perché questi non riflettono adeguatamente il microambiente delle cellule presenti in vivo. Approcci alternativi comprendenti componenti della matrice extracellulare nella cultura (ad esempio, Boyden saggi da camera) sono fisiologicamente più rappresentativi dell&#39;ambiente tessuti in vivo. Tuttavia, possono essere limitati a valutazione del comportamento singola cella, e non ricapitolano complesso in combinazioni vivo di cellula-matrice e cellula-cellula interazioni che contribuiscono al tessuto o tumore crescita 1, 2, 3. L&#39;uso di sferoidi multicellulari è un approccio recente che riproduce più accuratamente l&#39;architettura compatta nella crescita cellulare vivo 1,4. Sferoidi possono essere usati per studiare le interazioni cellula-matrice di cellule normali, ma può anche agire come analoghi tumorali per modellare caratteristiche della progressione tumorale, come la crescita metastatica o resistenza ai farmaci 4. Sferoidi possono essere formati dalla proliferazione di cellule singole annegate in una matrice 5, o più rapidamente, promuovendo l&#39;aggregazione di più celle per formare un unico cluster cellulare (per esempio, appendere goccia, metodi centrifugazione) 6, 7. Esistenti tecniche di aggregazione delle cellule possono richiedere materiali costosi o di attrezzature specializzate. Inoltre, questi sferoidi hanno una vasta gamma di dimensioni e morfologie e possono essere difficili da produrre in grandi quantità, fare confronti tra le condizioni di crescita o trattamenti difficili. Infine, sferoidi generati da questi metodi possono essere difficile isolare dal extracel proteinicomatrice lular in cui sono incorporati da utilizzare in altre applicazioni. Qui, descriviamo una metodologia di aggregazione cellulare robusto e facilmente modificabile per la rapida formazione di sferoidi di cellule di dimensioni sempre utilizzando disponibili in commercio piastre di celle-repellente U-basso e una matrice di adesione di promozione inerte, metilcellulosa. Una volta formati, questi sferoidi multicellulari sono facilmente isolati per uso in una vasta gamma di applicazioni. Il protocollo è anche facilmente adattato per generare sferoidi attraverso la proliferazione cellulare, che può essere utilizzato per valutare altri processi cellulari. Qui, dimostriamo saggi di invasione delle cellule, quantificati da immunofluorescenza, e un saggio anoikis, a titolo di esempio le applicazioni di queste due differenti protocolli di formazione sferoide.

<table><tbody><tr><td>Buffers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di cloruro di calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21114</td><td>Utilizzato per tampone di lavaggio PBS+; Non sterilizzare in autoclave il tampone di lavaggio PBS+ con l'aggiunta di cloruro di calcio</td></tr><tr><td>Soluzione di cloruro di magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td>Utilizzato per tampone di lavaggio PBS+; Non sterilizzare in autoclave PBS+ tampone di lavaggio con l'aggiunta di cloruro di magnesio</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Per formazione di sferoidi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well U-bottom Piastra repellente per cellule</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650970</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5546</td><td>Per la coltura di linee cellulari SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1</td></tr><tr><td>F12K Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2112722</td><td>Per la coltura di linee cellulari TT</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1051</td><td>Filtro prima dell'uso per rimuovere i contaminanti particolati</td></tr><tr><td>Metilcellulosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7027</td><td>Preparare in acqua a 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td>Per la coltura di linee cellulari HCT-116, BxPC-3</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12605028</td><td>tampone di dissociazione</td></tr><tr><td>Nome</strong</td><td>>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>For Invasion Assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine Type I Collagen</td><td>Corning Incorporated</td><td>354231</td><td>Stock 3,1 mg/mL; Mantenere sul ghiaccio quando in uso</td></tr><tr><td>DMEM Phenol Red Free Basso Glucosio&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11054-20</td><td>Meno fluorescenza di fondo rispetto al mezzo integrato con rosso fenolo</td></tr> Linea <tr><td>cellulare gliale derivata Fattore neurotrofico</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>Chemioattrattivo</td></tr><tr><td><forte>Nome</forte></td><td><forte>Azienda</forte></td><td><forte>Numero di catalogo</forte></td><td><forte>Commenti</forte></td></tr><tr><td>Per microscopia a immunofluorescenza</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>#1.5 Coverglass</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72225-01</td><td>Per il montaggio di sferoidi asportati</td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 488 Falloidina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td>Utilizzato per colorare l'actina a 1:200</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Bioshop Canada Incorporated</td><td>ALB001</td><td>Utilizzato nel tampone di blocco BSA</td></tr><tr><td>Dabco 33-LV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>290734</td> Glicerolo <td>Antisbiadimento</td></tr><tr><td></td><td>Bioshop Canada Incorporated</td><td>GLY001</td><td>Utilizzato nel supporto di montaggio MOWIOL</td></tr><tr><td>Software ImageJ</td><td>Freeware, NIH-Utilizzato</td><td></td> <td>per l'analisi delle immagini&nbsp;</td></tr><tr><td>Microslide</td><td>VWR International</td><td>48312-024</td><td>Per il montaggio di sferoidi asportati</td></tr><tr><td>MOWIOL 4-88</td><td>EMD-Millipore</td><td>475904</td><td>Utilizzato nel mezzo di montaggio MOWIOL</td></tr><tr><td>Paraformaldeide&nbsp;</td><td>EMD-Millipore</td><td>PX0055-3</td><td>Utilizzato nel tampone di fissazione</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Bioshop Canada Incorporated</td><td>TRX777</td><td>Utilizzato nel tampone di permeabilizzazione</td></tr></tbody></table>

un metodo delle celle di aggregazione efficiente e flessibile per il 3d spheroid produzione

An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production

Coltura cellulare monostrato non adeguato a modellare il comportamento in vivo dei tessuti, che comporta complesse interazioni cellula-cellula e cellula-matrice. Tridimensionali tecniche di coltura (3D) delle cellule sono una recente innovazione sviluppata per colmare le lacune di coltura cellulare aderente. Mentre sono state sviluppate diverse tecniche per generare analoghi tessuti in vitro, questi metodi spesso sono complesse, costose da stabilire, richiedono attrezzature specializzate, e sono generalmente limitate dalla compatibilità con solo alcuni tipi di cellule. Qui, descriviamo un protocollo rapida e flessibile per aggregare cellule in sferoidi 3D multicellulari di taglia costante che è compatibile con la crescita di una varietà di tumori e linee cellulari normali. Utilizziamo diverse concentrazioni di siero e metil cellulosa (MC) promuovere ancoraggio-indipendente generazione sferoide e prevenire la formazione di monostrati di cellule in un modo altamente riproducibile. Condizioni ottimali per indivlinee cellulari idual possono essere realizzati regolando MC o concentrazioni sieriche nel mezzo formazione sferoide. Gli sferoidi 3D generati possono essere raccolti per l&#39;uso in una vasta gamma di applicazioni, tra cui segnalazione cellulare o studi di espressione genica, screening di farmaci candidati, o nello studio dei processi cellulari, come l&#39;invasione delle cellule tumorali e la migrazione. Il protocollo è anche facilmente adattato per generare sferoidi clonali da singole cellule, e può essere adattato per valutare crescita ancoraggio-indipendente e anoikis-resistenza. Nel complesso, il nostro protocollo fornisce un metodo facilmente modificabile per generare e utilizzare sferoidi cellulari 3D per ricapitolare microambiente 3D dei tessuti e modellare la crescita in vivo di cellule normali e tumorali.

Descriviamo un metodo flessibile ed efficace per generare sferoidi discreti utilizzando piastre di celle-repellenti e mezzi di formazione sferoide integrato con MC. Nelle condizioni appropriate di MC e siero, singole cellule depositano ed aderiscono insieme al centro del pozzo per formare sferoidi con minima aderenza al fondo del pozzetto. Usando questo protocollo, sferoidi sono stati generati da una varietà di linee cellulari (Figura 2B). Titolazione di MC e le concentr...

Qui, descriviamo un protocollo rapido e flessibile per la formazione di sferoidi cellulari 3D attraverso l'aggregazione cellulare. Questo è facilmente adattabile a più tipi di cellule ed è adatto per l'uso in una varietà di applicazioni, tra cui la migrazione cellulare, l'invasione o i saggi anoikis e per l'imaging e la quantificazione delle interazioni cellula-matrice.

Un metodo delle celle di aggregazione efficiente e flessibile per il 3D Spheroid Produzione

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. ...

NARRATORE L'obiettivo generale di questo metodo è generare in modo efficiente elevate quantità di sferoidi cellulari robusti mediante aggregazione cellulare, per il loro utilizzo in una varietà di saggi cellulari. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nell'utilizzo di una matrice solubile in acqua non proteica per l'aggregazione cellulare e la formazione degli sferoidi, che consente un facile e rapido isolamento degli sferoidi stessi. Questo metodo può contribuire a ottenere nuove informazioni in biologia cellulare sugli effetti delle interazioni cellula-cellula e cellula/matrice sulla crescita tissutale in un microambiente tridimensionale.NARRATORE Prima di preparare gli aggregati, riscaldare 50 millilitri di acqua ultrapura a 80 gradi Celsius e aggiungere 10 grammi di polvere di metilcellulosa. Agitare la sospensione finché le particelle non sono uniformemente disperse. Quindi aggiungere acqua ultrapura fredda fino a un volume finale di 100 millilitri e conservare la sospensione tutta la notte a 4 gradi Celsius, fino a quando la soluzione diventa limpida e di colore giallo paglierino, senza solidi visibili.Passare la soluzione attraverso un filtro da 0,45 micrometri

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Descriviamo un metodo semplice, rapido di generare 3D tessuti come sferoidi e la loro potenziale applicazione di quantificare le differenze nelle interazioni cellula-cellula.

Un semplice Hanging goccia Cultura protocollo cellulare per la generazione di sferoidi 3D

Gli sferoidi sono un tipo di modello di coltura cellulare 3D utilizzato per rappresentare in modo più accurato l'ambiente di una cellula rispetto ai modelli monostrato di coltura cellulare 2D. Nel protocollo di esempio, vedremo gli scienziati generare sferoidi da una linea cellulare di cancro del colon-retto e applicare l'imaging di cellule vive per monitorare la crescita degli sferoidi.

Generazione di sferoidi da linee cellulari: un metodo di coltura cellulare tridimensionale (3D)

Vi presentiamo un dispositivo microfluidico centricomotore a motore in grado di coltivare sferoidi cellulari. Utilizzando questo dispositivo, sferoidi di tipo cellulare singolo o multiplo potrebbe essere facilmente costati in condizioni di alta gravità.

Piattaforma lab-on-a-CD per la generazione di spheroid tridimensionali multicellulari

Qui, descriviamo la produzione su larga scala di sferoidi stromali / cellule staminali (ASC) di derivazione adiposa utilizzando un sistema di pipettaggio automatizzato per seminare la sospensione cellulare, garantendo così l'omogeneità delle dimensioni e della forma dello sferoide. Questi sferoidi ASC possono essere utilizzati come elementi costitutivi per approcci di bioprinting 3D.

Produzione automatizzata su larga scala di sferoidi a cellule staminali di derivazione adiposa per la bioprinting 3D

Questo protocollo descrive in dettaglio un metodo per la produzione di tre diversi tipi di sferoidi in un modo che li rende adatti per lo screening e l'analisi ad alto contenuto su larga scala. Inoltre, vengono presentati esempi che mostrano come possono essere analizzati a livello sferoidale e di singole cellule.

Un metodo robusto per la produzione su larga scala di sferoidi per applicazioni di screening e analisi ad alto contenuto

Il presente protocollo descrive una tecnica per produrre sferoidi tissutali su larga scala in modo economico utilizzando un dispositivo simile a un timbro stampato in 3D.

Generazione di sferoidi tissutali tramite un dispositivo simile a un timbro stampato in 3D

Presentiamo un protocollo per la coltivazione di sferoidi ad alta riproducibilità e la loro caratterizzazione fenotipica utilizzando l'acquisizione di immagini e la proteomica.

Analisi fenotipica semi-automatizzata di colture cellulari sferoidi 3D funzionali

Qui, presentiamo un protocollo che consente la fabbricazione rapida, robusta ed economica di sferoidi tumorali seguita dall'incapsulamento dell'idrogel. È ampiamente applicabile in quanto non richiede attrezzature specializzate. Sarebbe particolarmente utile per esplorare le interazioni sferoide-matrice e costruire modelli di fisiologia o patologia tissutale in vitro .

Fabbricazione e incapsulamento di sferoidi tumorali in idrogel di polietilenglicole per lo studio delle interazioni sferoide-matrice

Gli sferoidi cellulari sono stati considerati un potenziale modello nel campo delle applicazioni biologiche. Questo articolo descrive i protocolli per la generazione scalabile di sferoidi cellulari utilizzando un dispositivo di assemblaggio acustico 3D, che fornisce un metodo efficiente per la fabbricazione robusta e rapida di sferoidi cellulari uniformi.

Dispositivo di assemblaggio acustico tridimensionale per la produzione di massa di sferoidi cellulari

Qui, descriviamo diversi metodi di formazione di sferoidi multicellulari per eseguire la microscopia multiparametrica su cellule vive di follow-up. Utilizzando la microscopia a fluorescenza (FLIM), l'autofluorescenza cellulare, i coloranti di colorazione e le nanoparticelle, viene dimostrato l'approccio per l'analisi del metabolismo cellulare, dell'ipossia e della morte cellulare nel cancro tridimensionale (3D) vivo e negli sferoidi derivati da cellule staminali.

Produzione e microscopia multiparametrica per imaging a fluorescenza su cellule vive (FLIM) di sferoidi multicellulari

Questo studio presenta una metodologia economica ed efficiente per generare strutture cellulari 3D utilizzando un sistema basato su timbri per creare micropozzetti in stampi di agarosio. Il sistema promuove la formazione di sferoidi/organoidi uniformi, migliorando così le interazioni cellulari. Questo approccio riduce la variabilità sperimentale e supporta le applicazioni nei test sui farmaci e nell'ingegneria tissutale.

Generazione di sferoidi/organoidi tridimensionali da colture cellulari bidimensionali utilizzando un nuovo dispositivo di timbro

Scopri un metodo rapido e flessibile per generare sferoidi cellulari 3D mediante aggregazione cellulare. Questa tecnica utilizza una matrice idrosolubile non proteica per facilitare l'isolamento rapido degli sferoidi in vari saggi cellulari.

Un metodo delle celle di aggregazione efficiente e flessibile per il 3D Spheroid Produzione

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