Un metodo delle celle di aggregazione efficiente e flessibile per il 3D Spheroid Produzione

NARRATORE L'obiettivo generale di questo metodo è generare in modo efficiente elevate quantità di sferoidi cellulari robusti mediante aggregazione cellulare, per il loro utilizzo in una varietà di saggi cellulari. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nell'utilizzo di una matrice solubile in acqua non proteica per l'aggregazione cellulare e la formazione degli sferoidi, che consente un facile e rapido isolamento degli sferoidi stessi. Questo metodo può contribuire a ottenere nuove informazioni in biologia cellulare sugli effetti delle interazioni cellula-cellula e cellula/matrice sulla crescita tissutale in un microambiente tridimensionale.

NARRATORE Prima di preparare gli aggregati, riscaldare 50 millilitri di acqua ultrapura a 80 gradi Celsius e aggiungere 10 grammi di polvere di metilcellulosa. Agitare la sospensione finché le particelle non sono uniformemente disperse. Quindi aggiungere acqua ultrapura fredda fino a un volume finale di 100 millilitri e conservare la sospensione tutta la notte a 4 gradi Celsius, fino a quando la soluzione diventa limpida e di colore giallo paglierino, senza solidi visibili.

Passare la soluzione attraverso un filtro da 0,45 micrometri per rimuovere eventuali frammenti non disciolti e diluire 1:5 milligrammi per millilitro della soluzione filtrata nel mezzo di coltura appropriato. Quindi filtrare il mezzo integrato con metilcellulosa attraverso un setaccio da 0,22 micrometri. Successivamente, all'interno di una cappa a sicurezza biologica, lavare una sotto-coltura al 70% di confluenza con PBS ed eseguire il distacco delle cellule utilizzando tre millilitri di tampone di associazione tripsina-EDTA in un incubatore per colture cellulari.

Dopo alcuni minuti, osservare le cellule al microscopio ottico con un ingrandimento 10x. Quando le cellule si sono staccate dalla piastra, neutralizzare la reazione con sette millilitri di mezzo di coltura integrato con siero. Trasferire la soluzione cellulare in un nuovo tubo da 15 millilitri e quindi raccogliere le cellule liberate mediante centrifugazione.

La causa più comune di un'insoddisfacente formazione degli sferoidi, a parte la presenza di particelle contaminanti, è l'uso di concentrazioni subottimali di metilcellulosa o siero per l'aggregazione e la crescita della linea cellulare specifica. NARRATORE: utilizzando una micropipetta P1000 con punta filtrante, triturare il pellet da tre a cinque volte con un millilitro di mezzo di formazione degli sferoidi, premendo la punta della pipetta contro il fondo del tubo con un leggero angolo, mentre si pipetta lentamente senza espellere completamente il contenuto della punta, al fine di tagliare il pellet. Dopo il conteggio, diluire la sospensione cellulare a una concentrazione di 1 × 10⁴ cellule per millilitro e risciacquare un serbatoio sterile per pipetta multicanale con acqua ultrapura filtrata per rimuovere polveri e fibre.

Distribuire le cellule nel serbatoio e utilizzare punte filtranti per trasferire 100 microlitri di cellule in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con fondo a U e superficie repellente per le cellule, mescolando periodicamente la sospensione cellulare per evitare che le cellule si depositino sul fondo del serbatoio. Una volta che tutte le cellule si sono depositate, posizionare la piastra nell’incubatrice per colture cellulari e ispezionare i pozzetti quotidianamente per verificare la formazione di sferoidi. Le cellule dovrebbero depositarsi sul fondo di ciascun pozzetto entro sei ore e generalmente aggregarsi in un sferoide entro 24-48 ore.

Per confermare la formazione di uno sferoide riuscito, utilizzare una punta P10 sotto un microscopio ottico per pipettare delicatamente il mezzo sopra lo sferoide. Gli sferoidi correttamente formati si staccheranno dalla piastra e rotoleranno, confermando la loro struttura tridimensionale. Per incorporare gli sferoidi nel collagene, utilizzare la pipettatura al contrario per ricoprire uniformemente il fondo di ogni pozzetto di una camera da coltura cellulare a otto pozzetti con almeno 50 microlitri di collagene neutralizzato per pozzetto.

Una volta ricoperti tutti i pozzetti, posizionare la camera portaoggetti in una piastra da coltura tissutale da 35 millimetri riempita con acqua ultrapura all'interno di una piastra da coltura tissutale da 10 centimetri e incubare la piastra da 10 centimetri a 37 gradi Celsius per circa un'ora. Quando il collagene si sarà polimerizzato, utilizzare una punta filtrante P1000 per trasferire con attenzione gli sferoidi preformati in provette microcentrifuga da 1,5 millilitro. È fondamentale che gli strati di base di collagene vengano incubati fino a quando non si saranno completamente polimerizzati, per evitare di disturbare il collagene durante l'aggiunta degli sferoidi o del mezzo.

Narratore Raccogliere gli sferoidi raccolti in una microcentrifuga da banco e utilizzare una pipetta P200 per rimuovere i soprannatanti, asportando l’eccesso di soprannatante capovolgendo i tubi su un tovagliolo di carta pulito, se necessario. Utilizzando una punta per pipetta P200 a largo diametro, risospendere immediatamente gli sferoidi in 50 microlitri di collagene neutralizzato e trasferire con attenzione le miscele di sferoidi e collagene in ciascun pozzetto della camera da coltura tessutale con otto pozzetti. Riporre la camera nell’incubatrice fino al completamento della polimerizzazione del collagene.

Dopo circa un'ora, aggiungere lentamente almeno 100 microlitri di mezzo di coltura riscaldato contenente il trattamento appropriato di interesse in ogni pozzetto per un'ulteriore incubazione. Quindi utilizzare un microscopio a fluorescenza per acquisire sezioni di imaging ottico attraverso gli sferoidi invasivi. Utilizzando questo protocollo, gli sferoidi possono essere generati da una varietà di linee cellulari.

Nelle appropriate condizioni di trattamento con metilcellulosa e siero, le singole cellule si depositano e aderiscono tra loro al centro della pozzetta, formando sferoidi con una minima adesione al fondo della pozzetta. Alcune linee cellulari sono in grado di aderire a piastre repulsive per le cellule in assenza o a basse concentrazioni di metilcellulosa, portando alla formazione di uno sferoide circondato da un monostrato cellulare. In generale, concentrazioni più elevate di metilcellulosa impediscono alle cellule di aderire alla pozzetta.

Tuttavia, una concentrazione troppo elevata di metilcellulosa riduce l'adesione tra cellula e cellula e impedisce alle cellule di sedimentare sul fondo della pozzetta, portando alla formazione di aggregati lenti e numerosi sferoidi satelliti. I sferoidi inclusi nel collagene possono essere trattati con un chemiotattante per indurre l'invasione di cellule singole dal sferoide verso l'esterno, all'interno della matrice circostante. I sferoidi fissati inclusi nel collagene possono essere analizzati mediante microscopia a campo chiaro per quantificare la distanza e il numero di cellule invasive, oppure mediante microscopia a fluorescenza immunoistochimica per visualizzare le strutture invasive formate dalle cellule in migrazione.

È importante prevedere un tempo sufficiente affinché le cellule si aggreghino in sferoidi strutturalmente stabili, abbastanza robusti da poter essere manipolati senza frammentarsi e facili da raccogliere per il loro utilizzo in saggi successivi. Il nostro protocollo di crescita cellulare può essere ulteriormente adattato per diversi saggi di biologia cellulare. Ad esempio, coltivare le cellule in mezzi supplementati con alte concentrazioni di metilcellulosa può essere utilizzato per valutare la resistenza anoica cellulare.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare sferoidi cellulari tridimensionali mediante aggregazione, che rappresenterà uno strumento prezioso per numerose applicazioni in biologia cellulare.