Produzione e microscopia multiparametrica per imaging a fluorescenza su cellule vive (FLIM) di sferoidi multicellulari

Qui, descriviamo diversi metodi di formazione di sferoidi multicellulari per eseguire la microscopia multiparametrica su cellule vive di follow-up. Utilizzando la microscopia a fluorescenza (FLIM), l'autofluorescenza cellulare, i coloranti di colorazione e le nanoparticelle, viene dimostrato l'approccio per l'analisi del metabolismo cellulare, dell'ipossia e della morte cellulare nel cancro tridimensionale (3D) vivo e negli sferoidi derivati da cellule staminali.

In questo lavoro, presentiamo e confrontiamo metodi di formazione di sferoidi che possono essere utilizzati per l'analisi del metabolismo cellulare e della distribuzione dell'ossigeno utilizzando la microscopia su cellule vive. Negli ultimi anni, la microscopia a fluorescenza è stata ampiamente utilizzata per studiare biomarcatori metabolici come NADPH e FAD in cellule vive, e diverse nanoparticelle fluorescenti sono state sviluppate per multiplexare tali misurazioni con l'imaging dell'ossigenazione di cellule e tessuti. Gli sferoidi multicellulari, gli organoidi e l'organo-on-a-chip possono replicare un microambiente complesso, simile a quello in vivo, riducendo al minimo la necessità di ricerca sugli animali.

Per la produzione di sferoidi, mostriamo diversi metodi di formazione, che possono variare da una bassa ad un'alta produttività. Evidenziano inoltre la loro accessibilità ottica, la compatibilità con il microscopio per imaging a fluorescenza e la possibilità di includere componenti della matrice extracellulare. Quindi, anche se i modelli 3D in vitro forniscono un contesto migliore rispetto alle colture 2D, la loro elevata variabilità, la bassa riproducibilità e la segnalazione sperimentale incompleta rimangono un problema.

Parametri come la dimensione degli sferoidi, la composizione dei nutrienti, la viscosità extracellulare e persino i metodi di formazione degli sferoidi possono portare a un aumento dell'eterogeneità cellulare. Con questo protocollo, miriamo ad armonizzare e standardizzare i metodi di produzione degli sferoidi, evidenziando aspetti chiave importanti per l'analisi continua e multiparametrica degli sferoidi utilizzando la microscopia FLIM.