Produzione e microscopia multiparametrica per imaging a fluorescenza su cellule vive (FLIM) di sferoidi multicellulari
9 agosto 2024
Qui, descriviamo diversi metodi di formazione di sferoidi multicellulari per eseguire la microscopia multiparametrica su cellule vive di follow-up. Utilizzando la microscopia a fluorescenza (FLIM), l'autofluorescenza cellulare, i coloranti di colorazione e le nanoparticelle, viene dimostrato l'approccio per l'analisi del metabolismo cellulare, dell'ipossia e della morte cellulare nel cancro tridimensionale (3D) vivo e negli sferoidi derivati da cellule staminali.
In questo lavoro, presentiamo e confrontiamo metodi di formazione di sferoidi che possono essere utilizzati per l'analisi del metabolismo cellulare e della distribuzione dell'ossigeno utilizzando la microscopia su cellule vive. Negli ultimi anni, la microscopia a fluorescenza è stata ampiamente utilizzata per studiare biomarcatori metabolici come NADPH e FAD in cellule vive, e diverse nanoparticelle fluorescenti sono state sviluppate per multiplexare tali misurazioni con l'imaging dell'ossigenazione di cellule e tessuti. Gli sferoidi multicellulari, gli organoidi e l'organo-on-a-chip possono replicare un microambiente complesso, simile a quello in vivo, riducendo al minimo la necessità di ricerca sugli animali.
Per la produzione di sferoidi, mostriamo diversi metodi di formazione, che possono variare da una bassa ad un'alta produttività. Evidenziano inoltre la loro accessibilità ottica, la compatibilità con il microscopio per imaging a fluorescenza e la possibilità di includere componenti della matrice extracellulare. Quindi, anche se i modelli 3D in vitro forniscono un contesto migliore rispetto alle colture 2D, la loro elevata variabilità, la bassa riproducibilità e la segnalazione sperimentale incompleta rimangono un problema.
Parametri come la dimensione degli sferoidi, la composizione dei nutrienti, la viscosità extracellulare e persino i metodi di formazione degli sferoidi possono portare a un aumento dell'eterogeneità cellulare. Con questo protocollo, miriamo ad armonizzare e standardizzare i metodi di produzione degli sferoidi, evidenziando aspetti chiave importanti per l'analisi continua e multiparametrica degli sferoidi utilizzando la microscopia FLIM.
Panoramica
In questo articolo vengono presentati diversi metodi per la formazione di sferoidi multicellulari al fine di analizzare il metabolismo cellulare e la distribuzione dell'ossigeno mediante microscopia su cellule vive. Lo studio evidenzia l'utilizzo della microscopia di imaging del tempo di vita della fluorescenza (FLIM) per indagare i biomarcatori metabolici in cellule vive.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Microscopia a cellule vive
Sfondo
- Gli sferoidi multicellulari e gli organoidi replicano microambienti simili a quelli in vivo.
- La microscopia a rilevamento del tempo di decadimento della fluorescenza viene utilizzata per studiare biomarcatori metabolici.
- Elevata variabilità e bassa riproducibilità rappresentano sfide nei modelli in vitro 3D.
- Possibili diversi metodi di formazione degli sferoidi possono essere impiegati per varie applicazioni.
Scopo dello studio
- Confrontare metodi di formazione di sferoidi per la microscopia di cellule vive.
- Analizzare il metabolismo cellulare, l'ipossia e la morte cellulare in modelli tridimensionali.
- Migliorare la comprensione della distribuzione dell'ossigeno in sistemi multicellulari.
Metodi Utilizzati
- Microscopia a fluorescenza con imaging del tempo di vita (FLIM)
- Analisi della autofluorescenza cellulare
- Utilizzo di coloranti istologici e nanoparticelle fluorescenti
- Diverse tecniche di formazione di sferoidi
Risultati principali
- Illustrati metodi per l'analisi del metabolismo cellulare in sferoidi 3D.
- Dimostrata la compatibilità dei sferoidi con la FLIM per studi metabolici.
- Evidenziata l'importanza dei componenti della matrice extracellulare nella formazione dei sferoidi.
- Affrontate le sfide relative alla riproducibilità e alla variabilità delle colture 3D.
Conclusioni
- Diversi metodi di formazione di sferoidi possono migliorare l'analisi delle cellule vive.
- La FLIM fornisce informazioni preziose sui processi metabolici nei modelli tridimensionali.
- Lo sviluppo continuo di questi metodi può ridurre la dipendenza dai modelli animali.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La produzione standardizzata e l'analisi multiparametrica mediante FLIM di sferoidi multicellulari affrontano sfide fondamentali nella modellizzazione dei microambienti tumorali per la scoperta di farmaci. L'armonizzazione della formazione degli sferoidi e dei flussi di lavoro di imaging su cellule vive migliora l'affidabilità predittiva dei risultati metabolici e correlati all'ipossia, sostenendo decisioni solide nelle fasi iniziali dello sviluppo. Questo approccio rafforza la continuità traslazionale e riduce il rischio biologico nei portafogli di ricerca e sviluppo in oncologia e nelle cellule staminali.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette l'analisi di vie metaboliche e gradienti di ossigeno in modelli tridimensionali fisiologicamente rilevanti.
- Supporta la validazione funzionale del bersaglio quantificando i biomarcatori NADPH e FAD in sferoidi vivi.
- Facilita la riduzione del rischio biologico mediante misurazioni multiplex di metabolismo e ipossia.
- Migliora la sicurezza predittiva per il legame al bersaglio e la modulazione della via in sistemi complessi.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Prepara modelli riproducibili di sferoidi 3D compatibili con piattaforme FLIM a campo ampio, confocali e a due fotoni.
- Standardizza le condizioni del saggio per ridurre la variabilità e migliorare l'affidabilità dei risultati quantitativi.
- Consente schermature scalabili ad alto rendimento degli effetti dei composti sul metabolismo cellulare e sulla vitalità.
- Supporta una valutazione robusta dell'integrazione di biosensori e nanosensori per letture multiplex.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i profili metabolici e di ipossia in vitro con microambienti tumorali rilevanti per la malattia.
- Garantisce continuità dalla scoperta alla validazione preclinica, riducendo la dipendenza dai modelli animali.
- Consente decisioni di avanzamento corrette per il rischio basate su dati quantitativi e multiparametrici.
- Facilita lo sviluppo di biomarcatori traslazionali mediante l'uso di dati FLIM ottenuti da cellule vive.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo flusso di lavoro armonizzato integra le fasi iniziali della scoperta fino all'identificazione dei composti promettenti e alla validazione preclinica, sfruttando la produzione standardizzata di sferoidi e l'analisi FLIM.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi in contesti tridimensionali simili all'in vivo.
- Screening: Fornisce letture quantitative e riproducibili del metabolismo e dell'ipossia per il triage dei composti.
- Analisi: Consente misurazioni multiplex del tempo di decadimento della fluorescenza per confronti affidabili tra condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati ottenuti in vitro ai modelli preclinici riproducendo le caratteristiche del microambiente tumorale.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per diversi programmi di ricerca e sviluppo in oncologia e nelle cellule staminali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nei sistemi di modelli 3D.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la scalabilità dei flussi di lavoro di imaging su cellule vive.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione e l'efficienza del capitale fornendo dati robusti e quantitativi.
- Impatto sul portafoglio: Consente una priorizzazione e un avanzamento adeguati al rischio di candidati con rilevanza biologica validata.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura cellulare 3D, nella microscopia a cellule vive e nell'analisi FLIM.
- Necessita dell'accesso a strumentazione FLIM a campo ampio, confocale o a due fotoni e a software di analisi compatibili.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per la produzione degli sferoidi e i protocolli di acquisizione delle immagini.
- Potrebbe richiedere adattamenti per diversi tipi cellulari, matrici extracellulari o integrazione di sensori.
- La variabilità nella dimensione e nella composizione degli sferoidi può influenzare la riproducibilità e l'interpretazione dei dati.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
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Introduction
1:51
High‐Throughput Generation of Multicellular Spheroids from Human Cancer Cell Line for Live 3D Imaging
4:15
Assessing the Impact of Spheroid Formation Methods in 3D Cell Culture Systems Using Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)
