Produzione e microscopia multiparametrica per imaging a fluorescenza su cellule vive (FLIM) di sferoidi multicellulari
August 9th, 2024
Qui, descriviamo diversi metodi di formazione di sferoidi multicellulari per eseguire la microscopia multiparametrica su cellule vive di follow-up. Utilizzando la microscopia a fluorescenza (FLIM), l'autofluorescenza cellulare, i coloranti di colorazione e le nanoparticelle, viene dimostrato l'approccio per l'analisi del metabolismo cellulare, dell'ipossia e della morte cellulare nel cancro tridimensionale (3D) vivo e negli sferoidi derivati da cellule staminali.
In questo lavoro, presentiamo e confrontiamo metodi di formazione di sferoidi che possono essere utilizzati per l'analisi del metabolismo cellulare e della distribuzione dell'ossigeno utilizzando la microscopia su cellule vive. Negli ultimi anni, la microscopia a fluorescenza è stata ampiamente utilizzata per studiare biomarcatori metabolici come NADPH e FAD in cellule vive, e diverse nanoparticelle fluorescenti sono state sviluppate per multiplexare tali misurazioni con l'imaging dell'ossigenazione di cellule e tessuti. Gli sferoidi multicellulari, gli organoidi e l'organo-on-a-chip possono replicare un microambiente complesso, simile a quello in vivo, riducendo al minimo la necessità di ricerca sugli animali.
Per la produzione di sferoidi, mostriamo diversi metodi di formazione, che possono variare da una bassa ad un'alta produttività. Evidenziano inoltre la loro accessibilità ottica, la compatibilità con il microscopio per imaging a fluorescenza e la possibilità di includere componenti della matrice extracellulare. Quindi, anche se i modelli 3D in vitro forniscono un contesto migliore rispetto alle colture 2D, la loro elevata variabilità, la bassa riproducibilità e la segnalazione sperimentale incompleta rimangono un problema.
Parametri come la dimensione degli sferoidi, la composizione dei nutrienti, la viscosità extracellulare e persino i metodi di formazione degli sferoidi possono portare a un aumento dell'eterogeneità cellulare. Con questo protocollo, miriamo ad armonizzare e standardizzare i metodi di produzione degli sferoidi, evidenziando aspetti chiave importanti per l'analisi continua e multiparametrica degli sferoidi utilizzando la microscopia FLIM.
Panoramica
Questo articolo presenta vari metodi per formare sfere multicellulari per analizzare il metabolismo cellulare e la distribuzione di ossigeno utilizzando la microscopia di cellule vive. Lo studio evidenzia l'uso della microscopia di imaging del tempo di vita della fluorescenza (FLIM) per investigare i biomarcatori metabolici nelle cellule vive.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Imaging di cellule vive
Sfondo
- Le sfere multicellulari e gli organoid replicano microambienti simili a quelli in vivo.
- La microscopia di imaging del tempo di vita della fluorescenza viene utilizzata per studiare i biomarcatori metabolici.
- Alta variabilità e bassa riproducibilità sono sfide nei modelli in vitro 3D.
- Diversi metodi di formazione di sfere possono essere impiegati per varie applicazioni.
Scopo dello studio
- Confrontare i metodi di formazione delle sfere per la microscopia di cellule vive.
- Analizzare il metabolismo cellulare, l'ipossia e la morte cellulare nei modelli 3D.
- Migliorare la comprensione della distribuzione di ossigeno nei sistemi multicellulari.
Metodi utilizzati
- Microscopia di imaging del tempo di vita della fluorescenza (FLIM)
- Analisi dell'autofluorescenza cellulare
- Uso di coloranti di colorazione e nanoparticelle fluorescenti
- Diversi tecniche di formazione delle sfere
Principali risultati
- Metodi dimostrati per analizzare il metabolismo cellulare in sfere 3D.
- Compatibilità mostrata delle sfere con FLIM per studi metabolici.
- Evidenziata l'importanza dei componenti della matrice extracellulare nella formazione delle sfere.
- Affrontate le sfide nella riproducibilità e variabilità delle colture 3D.
Conclusioni
- Diversi metodi di formazione delle sfere possono migliorare l'analisi delle cellule vive.
- FLIM fornisce preziose informazioni sui processi metabolici nei modelli 3D.
- Il continuo sviluppo di questi metodi può ridurre la dipendenza dai modelli animali.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Standardized production and multi-parameter FLIM analysis of multicellular spheroids address critical challenges in modeling tumor microenvironments for drug discovery. Harmonizing spheroid formation and live-cell imaging workflows enhances predictive confidence in metabolic and hypoxia-related readouts, supporting robust early-stage decision-making. This approach strengthens translational continuity and reduces biological risk across oncology and stem cell R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of metabolic pathways and oxygen gradients in physiologically relevant 3D models.
- Supports functional target validation by quantifying NADPH and FAD biomarkers in live spheroids.
- Facilitates biological de-risking through multiplexed metabolic and hypoxia measurements.
- Improves predictive confidence for target engagement and pathway modulation in complex systems.
Screening & Assay Development
- Prepares reproducible 3D spheroid models compatible with widefield, confocal, and two-photon FLIM platforms.
- Standardizes assay conditions to reduce variability and enhance quantitative output reliability.
- Enables scalable, high-throughput screening of compound effects on cell metabolism and viability.
- Supports robust evaluation of bio- and nanosensor integration for multiplexed readouts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro metabolic and hypoxia profiles with disease-relevant tumor microenvironments.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by minimizing animal model reliance.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative, multiparametric data.
- Facilitates translational biomarker development using live-cell FLIM outputs.
Pipeline & Workflow Integration
This harmonized workflow integrates from early discovery through lead identification and preclinical validation, leveraging standardized spheroid production and FLIM analytics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in 3D, in vivo-like contexts.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative metabolic and hypoxia readouts for compound triage.
- Analytics: Provides multiplexed fluorescence lifetime measurements for robust condition comparison.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models by recapitulating tumor microenvironment features.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse oncology and stem cell R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in 3D model systems.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of live-cell imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust, quantitative data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of candidates with validated biological relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D cell culture, live-cell microscopy, and FLIM analytics.
- Demands access to widefield, confocal, or two-photon FLIM instrumentation and compatible analysis software.
- Necessitates cross-team standardization of spheroid production and imaging protocols.
- May require adaptation for different cell types, extracellular matrices, or sensor integration.
- Variability in spheroid size and composition can impact reproducibility and data interpretation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:51
High‐Throughput Generation of Multicellular Spheroids from Human Cancer Cell Line for Live 3D Imaging
4:15
Assessing the Impact of Spheroid Formation Methods in 3D Cell Culture Systems Using Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)
