Name: Produzione e microscopia multiparametrica per imaging a fluorescenza su cellule vive (FLIM) di sferoidi multicellulari (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-09T13:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Impara a produrre sferoidi multicellulari per analisi multiparametrica con microscopia FLIM su cellule vive. Questo metodo consente di studiare metabolismo cellulare e distribuzione dell'ossigeno in modelli 3D.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni del Fondo speciale per la ricerca (BOF) dell'Università di Gand (BOF/STA/202009/003; BOF/IOP/2022/058), Fondazione per la ricerca delle Fiandre (FWO, I001922N) e l'Unione Europea, fliMAGIN3D-DN Horizon Europe-MSCA-DN n. 101073507.

Formazione di sferoidi multicellulari per analisi metaboliche e ipossia basate su FLIM

Nulla da rivelare.

Gli sferoidi multicellulari stanno diventando un metodo di scelta negli studi di microambienti di nicchia di tumori e cellule staminali, nella scoperta di farmaci e nello sviluppo di "elementi costitutivi tissutali" per la biofabbricazione. L'architettura interna eterogenea degli sferoidi, i gradienti di nutrienti e l'ossigenazione possono imitare quelli dei tessuti e dei tumori in vivo in un ambiente relativamente semplificato e accessibile. Con la necessità di una maggiore trasparenza metodologica26,28 e di standardizzazione71, ci si aspetta che questi protocolli aiutino i ricercatori a scegliere il miglior metodo di formazione di sferoidi per gli esperimenti di microscopia quantitativa al telegrafo con fluorescenza dal vivo. I metodi presentati sfruttano i sensori di nanoparticelle di colorazione cellulare e l'autofluorescenza cellulare intrinseca, che può essere facilmente combinata con la colorazione della morte cellulare.
I passaggi più critici sono nel protocollo di formazione degli sferoidi; Pertanto, per il metodo a base di agarosio ad alta produttività, è essenziale equilibrare sufficientemente gli stampi di agarosio per i terreni di coltura. Un tempo di equilibrio insufficiente porterà alla diluizione dei nutrienti nel PBS rimanente e porterà ulteriori fattori per l'eterogeneità degli sferoidi 21,26,72,73. Lo stampo di agarosio appena realizzato deve essere controllato anche visivamente per la presenza di bolle d'aria, microfessure e altri difetti.
Sebbene efficiente per l'imaging, la sospensione di nanoparticelle può mostrare autoaggregazione e causare la formazione di sferoidi di forma irregolare nei metodi di formazione a basso attaccamento. Questo può spesso essere mitigato con l'aggiunta di siero al terreno di coltura o con la pre-colorazione della coltura cellulare monostrato prima della formazione degli sferoidi. Frequentemente, durante la compattazione degli sferoidi, l'aggiunta di una piccola quantità di nanoparticelle (ad esempio, il 10% della concentrazione iniziale di colorazione) può anche aiutare a colorare la zona di proliferazione degli sferoidi. Infine, è importante utilizzare puntali per pipette sterili "privi di polvere" con tutti i metodi di formazione.
Il potenziale impatto dell'illuminazione sulla vitalità cellulare deve sempre essere considerato durante gli esperimenti di imaging. Pertanto, è importante conoscere i fattori di rischio che influenzano negativamente ogni esperimento di imaging dal vivo. In generale, il fotodanneggiamento coinvolge diversi meccanismi: (1) elevato aumento locale della temperatura, (2) stress meccanico e (3) stress fotochimico (reazione ossidativa e dei radicali liberi)74. A seconda della modalità di imaging (ad esempio, imaging confocale a un fotone o multifotone, modalità di illuminazione continua o a impulsi, sensibilità dei rivelatori e potenza della sorgente luminosa a diverse lunghezze d'onda se è possibile la regolazione dell'eccitazione), tipo di cellula e tessuto (ad esempio, accumulo dipendente dal tipo di tessuto di pigmenti che assorbono la luce in modo efficiente o altre molecole di autofluorescenza, organizzazione 3D vs. 2D, composizione dei terreni di crescita e di imaging), l'origine della sonda fluorescente (ad esempio, proprietà fotosensibilizzanti) Diverse combinazioni di fattori di rischio possono provocare fototossicità durante l'imaging. Inoltre, anche se non si osserva alcun aumento della morte cellulare dopo l'illuminazione, gli effetti precoci pre-morte dipendenti dalla potenza della luce sui mitocondri e sul metabolismo possono potenzialmente interferire con l'analisi e l'interpretazione dell'esperimento55.
Per escludere l'impatto fototossico sui risultati sperimentali, il ricercatore dovrebbe eseguire un monitoraggio generale della vitalità cellulare e dei cambiamenti nella morfologia cellulare rispetto al controllo intatto o utilizzando sonde di morte cellulare per stimare l'aumento del tasso di morte cellulare dopo l'illuminazione. Se gli esperimenti metabolici vengono eseguiti, l'ottimizzazione dei parametri di imaging deve essere eseguita di conseguenza negli esperimenti pilota per stimare e ridurre al minimo l'impatto dell'imaging sui parametri metabolici misurati. Nel caso di sonde sensibili all'ossigeno, il sovradosaggio leggero può essere facilmente rintracciato da un improvviso aumento della durata e dell'intensità della fosforescenza del colorante sensibile all'O2 (corrispondenti variazioni del rapporto di intensità di riferimento al colorante sensibile all'O2) dovuto al cosiddetto effetto "consumo fotoindotto di O2"53,75. Questo può essere fatto facilmente mediante l'analisi della curva cinetica di esperimenti time-lapse con diversi parametri di potenza luminosa utilizzando, ad esempio, il seguente protocollo25 pubblicato. A "difesa" dell'illuminazione a impulsi (ad esempio, utilizzata nella microscopia TCSPC-F(P)LIM), gli studi recenti hanno dimostrato il suo impatto minimo sulla produzione di ROS e sul fotosbiancamento della sonda rispetto alle misure di illuminazione in stato stazionario76,77, indicando un ulteriore vantaggio del TCSPC-FLIM rispetto all'approccio convenzionale basato sull'intensità.
Il limite principale dei metodi di formazione degli sferoidi presentati risiede nelle applicazioni di monitoraggio diretto e a lungo termine. Gli stampi per agarosio richiedono un obiettivo a lunga distanza di lavoro (o un microscopio verticale aggiuntivo o uno stereomicroscopio a fluorescenza) a causa dello spesso strato di agarosio e il materiale della piastra sferica 5D può interferire con le misurazioni nei canali fluorescenti rossi (sonda O2 ). La dimensione degli sferoidi prodotta con i metodi ad alta produttività è limitata dal diametro del micropozzetto e richiede frequenti scambi di terreno per evitare l'esaurimento e l'acidificazione dei terreni. Con tutte queste limitazioni, consigliamo le piastre di Petri 3D (MicroTissue) per esperimenti che richiedono metodi ad alta produttività (ad esempio, per applicazioni di bioprinting 3D) e a basso attaccamento per studi di base "a media produttività", che richiedono anche un numero inferiore di cellule.
Il monitoraggio raziometrico dell'ossigenazione e gli esperimenti convenzionali di microscopia a fluorescenza su cellule vive basati su coloranti sono convenienti su microscopi invertiti ampiamente disponibili se dotati di una telecamera sensibile al vicino infrarosso (NIR), di un'eccitazione basata su diodi a emissione di luce (LED) e di un obiettivo25 appropriato. Per un sezionamento ottico e FLIM più appropriati, si consigliano i sistemi di microscopio confocale commerciali disponibili in commercio (come quelli descritti qui). Mentre descriviamo anche un metodo per rilevare l'autofluorescenza del NAD(P)H, che richiede un più costoso microscopio FLIM a due fotoni, ci sono molti approcci diversi, compatibili e utili per i sistemi FLIM confocali, dotati idealmente di laser a luce bianca e rivelatori ibridi o SPAD. Questi includono la valutazione del metabolismo cellulare, le proteine del biosensore FRET-FLIM, l'imaging della meccanica cellulare e tissutale, l'autofluorescenza di specifici tipi di cellule e tessuti e le interazioni recettore-farmaco visualizzate tramite FLIM-FRET31.
Il software di acquisizione e analisi FLIM fornito dal fornitore può influire sul successo dell'esperimento, in quanto non è sempre possibile esportare l'IRF o le immagini in un formato compatibile con l'analisi open source a valle. La post-elaborazione è una parte importante del flusso di lavoro dell'analisi FLIM e non è ancora universalmente standardizzata o accettata. L'adattamento della curva richiede un numero maggiore di fotoni e una maggiore potenza di calcolo rispetto all'approccio fasoriale. FLIMfit45 (fitting globale e pixel per pixel) e Flimview78 sono tra i software aperti utilizzati per l'analisi dell'adattamento delle curve, mentre PAM79, FLUTE64 e AlliGator80 sono utilizzati per l'analisi dei fasori. FLIMJ46 è un utile plugin ImageJ che funziona con entrambi gli approcci. Nel complesso, queste opzioni aiutano a migliorare la routine di post-elaborazione e a renderla più veloce, versatile e facile da usare.

Gli sferoidi multicellulari rappresentano un gruppo di modelli tissutali 3D ottenuti dall'autoaggregazione di cellule e che esibiscono una forma sferica. Sono ampiamente utilizzati per imitare l'interazione cellula-cellula e cellula-matrice in vitro e per riprodurre un contesto 3D all'interno di una moltitudine di costrutti derivati da cancro e cellule staminali. Diverse tecniche sono impiegate per ridurre l'attaccamento cellulare e promuovere l'aggregazione. Questi includono il metodo della goccia sospesa che si basa sulla tensione superficiale1; metodi di repulsione dell'attacco cellulare come piastre di attacco ultra-basse, microstampi e micropozzetti 2,3; approccio basato sulle onde acustiche4; metodi di aggregazione indotta dal flusso (palloni rotanti, bioreattori e dispositivi microfluidici)5; formazione assistita da particelle magnetiche6 e utilizzo di matrici e scaffold sintetici e basati su ECM che promuovono l'aggregazione 7,8,9.
Nella ricerca, nello sviluppo e nella validazione di nuove terapie farmacologiche sul cancro, gli sferoidi sono un modello attraente grazie alla loro capacità di ricapitolare i gradienti di nutrienti, prodotti di scarto e O2 limitati dalla diffusione spaziale, portando spesso alla formazione di un nucleo necrotico, tipico dei tumori solidi10,11. Questi modelli in vitro più affidabili e sofisticati sfidano la necessità di un uso estensivo di modelli animali (Food and Drug Administration [FDA] Modernization Act 2.012), secondo il principio delle 3R della ricerca sugli animali (sostituzione, riduzione e perfezionamento). Oltre al cancro, gli sferoidi trovano la loro applicazione nella ricerca sulle cellule staminali. Ad esempio, le cellule staminali pluripotenti hanno la capacità di formare corpi embrioidi (EB), che possono essere utilizzati per la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) verso tipi di cellule specializzate che sono difficili da ottenere direttamente dai pazienti, come le cellule precursori neurali13 o le cellule della granulosa ovarica 13,14. Inoltre, la formazione di un EB è spesso il primo passo nello sviluppo di modelli di organoidi più complessi, ad esempio neurale15, retinale16, cardiaco17, fegato18, stomaco19 e organoidi intestinali20. Fattori quali le dimensioni, la riproducibilità, la produttività e le applicazioni a valle dovrebbero essere considerati quando si sceglie un metodo di formazione di sferoidi appropriato per gli esperimenti.
L'aumento della complessità della cultura 3D può portare a una maggiore variabilità rispetto alla cultura 2D. Fattori come la composizione dei nutrienti21, l'evaporazione dei terreni22, la viscosità23, il controllo del pH24, il metodo di formazione degli sferoidi e persino il tempo trascorso nella coltura25,26 possono portare all'ottenimento di sferoidi di diversa morfologia, dimensioni, vitalità e diversa chemioresistenza27,28. Recenti ricerche hanno dimostrato che i gradienti di ossigeno sferoidale non sono sempre statici e sono influenzati dal metodo di formazione, dalle dimensioni degli sferoidi e dalla viscosità extracellulare, influenzando l'eterogeneità degli sferoidi29. Per migliorare la riproducibilità e l'accessibilità dei dati sugli sferoidi, è stata sviluppata la base di conoscenze MISpheroID26, identificando la linea cellulare, il terreno di coltura, il metodo di formazione e la dimensione degli sferoidi come informazioni minime per un risultato riproducibile. Pertanto, è stato effettuato un confronto dettagliato tra più metodi ad alta produttività (SphericalPlate 5D, microstampi realizzati in laboratorio e stampi per microtessuti) e a basso attaccamento (ad esempio, piastre a 96 pozzetti Biofloat e Lipidure-coated sia senza scaffold che basate su scaffold) (Figura 1 e Tabella 1), tra cui la dimensione del pozzetto (data una stima della dimensione massima dello sferoide), i materiali di consumo utilizzati, il tempo di preparazione e la possibilità di monitorare gli sferoidi senza trasportarli in piastre di microscopia. Quest'ultimo consente studi a lungo termine, mentre gli sferoidi prodotti con metodi ad alto rendimento spesso si traducono in esperimenti finali. Tutti i metodi, ad eccezione delle griglie della piastra 5DspheriLast, non apportano un'autofluorescenza indesiderata, consentendone così l'uso diretto in microscopia.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66845/66845fig01.jpg"> Figura 1: Spiegazione dei metodi di formazione degli sferoidi. Metodi ad alta produttività come la SphericalPlate 5D, che ha integrato micropozzetti brevettati nella piastra, mentre i microstampi prodotti in laboratorio e gli stampi MicroTissue utilizzano timbri per realizzare più micropozzetti in agarosio (blu). Le placche a basso attaccamento come Lipidure (Amsbio) e Biofloat (Sarstedt) utilizzano un rivestimento non aderente che inibisce l'adesione cellula-superficie e promuove l'autoaggregazione cellulare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66845/66845fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Piastra SpheriPlate 5D</td>
			<td>Microstampi autoprodotti</td>
			<td>Microtessuto</td>
			<td>Metodi di fissaggio bassi</td>
		</tr><tr><td>Numero di sferoidi/pozzetto</td>
			<td>750</td>
			<td>1589</td>
			<td>81</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>Diametro pozzetto</td>
			<td>90 μm</td>
			<td>400 μm</td>
			<td>800 μm</td>
			<td>1 millimetro</td>
		</tr><tr><td>Volume di coltura</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>5 ml</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>200 μl</td>
		</tr><tr><td>Altri materiali di consumo</td>
			<td>/</td>
			<td>7 mL di agarosio al 3%</td>
			<td>500 μl di agarosio al 2%</td>
			<td>/ *</td>
		</tr><tr><td>Tempo di preparazione</td>
			<td>10 minuti</td>
			<td>2 ore + 3 giorni di adattamento dei media</td>
			<td>0,5 ore + 15 minuti di adattamento multimediale</td>
			<td>10-30 min + 1 ora di asciugatura</td>
		</tr><tr><td>Monitoraggio</td>
			<td>Sì</td>
			<td>No**</td>
			<td>Sì</td>
			<td>Sì</td>
		</tr><tr><td>Autofluorescente</td>
			<td>Sì</td>
			<td>No</td>
			<td>No</td>
			<td>No</td>
		</tr><tr><td>Riutilizzabile</td>
			<td>No</td>
			<td>Sì</td>
			<td>Sì</td>
			<td>No**</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Costo</td>
			<td rowspan="2">€€</td>
			<td rowspan="2">€</td>
			<td rowspan="2">€€€€</td>
			<td>€€€€: Rivestimento e Matrigel</td>
		</tr><tr><td>€€: Piastra commerciale a 96 pozzetti</td>
		</tr><tr><td colspan="3">*Alcune linee cellulari richiedono l'aggiunta di ECM (cioè 2%-5% di Matrigel) per formare sferoidi compatti.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="5">**Il rivestimento è riutilizzabile fino all'esaurimento. Tuttavia, ogni lastra consumerà una piccola quantità di materiale e la polvere può accumularsi nel tempo. La sterilizzazione del filtro è regolarmente necessaria.</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Confronto tra più metodi di formazione di sferoidi29. "Monitoraggio": la capacità di monitorare lo sferoide senza la necessità di trasferirlo su una capsula di microscopia. €: 0-50€, €€: 50-150€ , €€€: 150-500€ , €€€€: &gt;500€
La microscopia a fluorescenza consente il monitoraggio diretto degli aspetti biologici chiave all'interno degli sferoidi, tra cui la morte cellulare, la vitalità, la proliferazione, il metabolismo, la viscosità e persino le proprietà meccaniche30. La microscopia a fluorescenza (FLIM) fornisce un'ulteriore dimensione quantitativa per lo studio delle interazioni delle sonde fluorescenti all'interno del loro (micro)ambiente 31,32,33,34, consentendo di risolvere gli spettri di emissione sovrapposti in base a diverse durate di emissione 35,36 e sondare il metabolismo cellulare basato sull'autofluorescenza cellulare intrinseca. Pertanto, composti autofluorescenti cellulari così diffusi come la nicotinammide adenina dinucleotide fosfato (NAD(P)H), la flavina mononucleotide (FMN), la flavina adenina dinucleotide (FAD), la protoporfirina IX e altri possono essere misurati con FLIM a uno e due fotoni e fungere da "sensori" intrinseci del catabolismo del glucosio, della fosforilazione ossidativa (OxPhos) e fornire una panoramica generale dello stato redox cellulare. Il NAD(P)H esiste in forme citoplasmatiche libere o in forme mitocondriali legate a proteine37,38. Allo stesso modo, lo stato ossidato del FAD è fluorescente con una durata più lunga della forma libera. Le microscopie NAD(P)H e FAD di solito utilizzano FLIM eccitate a due fotoni, con l'obiettivo di prevenire il fotodanneggiamento del campione39. Spesso, l'imaging metabolico ottico FLIM può essere combinato con l'uso di sonde basate su coloranti, biosensori geneticamente codificati, microscopia per imaging a tempo di fosforescenza (PLIM) e misurazioni basate sull'intensità raziometrica al fine di fornire un quadro più completo del metabolismo, dell'ossigenazione, della proliferazione e della vitalità cellularedi sferoidi o organoidi 29,30,31 . Inoltre, FLIM può anche essere combinato con il metodo di trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) per misurare la variazione del tempo di vita del fluoroforo donatore quando è a stretto contatto con l'accettore per studiare il legame di un farmaco con il suo dominio target 33,40,41.
Le immagini FLIM acquisite vengono in genere analizzate per calcolare la durata pixel per pixel. Attualmente, ci sono almeno 3 strategie comuni utilizzate per ottenere il tempo di vita della fluorescenza: "FLIM veloce" semiquantitativo (a volte indicato come "senso tau"43,44), adattamento della curva di decadimento, utilizzando l'adattamento a uno, due o tre esponenziali e approccio "senza adattamento" con trasformazione dei fasori e analisi del diagramma dei fasori. A seconda del fornitore, per gestire i dati FLIM misurati è possibile utilizzare il software fornito (LAS X, Symphotime, SPCImage, ecc.) o open source (ad esempio, FLIMfit45, FLIMJ46 o altri47). In genere, il software fornito dal fornitore è utile per l'analisi preliminare dei dati, mentre le soluzioni open source possono fornire studi più accurati utilizzando, ad esempio, grafici dei fasori e visualizzazione 3D.
Nonostante l'utilità e l'attrattiva di FLIM come metodo per lo studio degli sferoidi, sono disponibili pochissimi protocolli sperimentali e c'è una generale mancanza di conoscenza nella scelta del metodo di formazione più appropriato per il successo degli esperimenti di microscopia multiparametrica dal vivo che coinvolgono FLIM. Qui, viene presentato un confronto dettagliato dei protocolli di formazione di sferoidi comunemente usati in base alla loro morfologia, vitalità e ossigenazione con il nanosensore di rilevamento dell'ossigeno (MMIR1) recentemente convalidato e caratterizzato nel lontano rosso e nel vicino infrarosso (NIR). La nanoparticella cationica è impregnata con due coloranti reporter, l'aza insensibile al riferimento O 2-BODIPY (eccitazione 650 nm, emissione 675 nm) e la metalloporfirina NIR O2-sensibile, PtTPTBPF (eccitazione 620 nm, emissione 760 nm). L'MMIR1 consente l'analisi in tempo reale dei gradienti di ossigeno su un microscopio a fluorescenza convenzionale (utilizzando l'analisi raziometrica) o un microscopio a fosforescenza (PLIM) senza introdurre tossicità cellulare e consentendo segnali stabili, monitoraggio a lungo termine e multiplexing25,29. A seconda della necessità di colorare con coloranti o nanosensori, della produttività degli sferoidi o del tipo di cellula, è possibile scegliere il protocollo di formazione più appropriato. Poiché gli studi sulla vitalità e l'ossigenazione degli sferoidi sono rilevanti per gli studi sul cancro e sugli sferoidi derivati da cellule staminali, i protocolli presentati includono anche esempi e risultati tipici attesi di NAD(P)H-FLIM e FAD-FLIM con questi modelli. Le pipeline di imaging e analisi presentate si rivolgono alle più diffuse piattaforme di microscopia FLIM basate sul conteggio di singoli fotoni correlati nel tempo.

<table><tbody><tr><td>0,05% Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>Disponibile anche da Sigma</td></tr><tr><td>10 mL sierologico pipette</td><td>VWR</td><td>612-3700</td><td>Prodotti simili sono disponibili anche da Sarstedt, Corning, VWR e altre aziende</td></tr><tr><td>Piastre per colture cellulari a 12 pozzetti, sterili</td><td>Greiner bio-one</td><td>665-180</td><td>Prodotti simili sono disponibili anche da Sarstedt, Corning e altre aziende.</td></tr><tr><td>Vetrino da camera a 12 pozzetti, rimovibile</td><td>Ibidi</td><td>81201</td><td>Disponibile anche da Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific e altri</td></tr><tr><td>Provette da centrifuga da 15 mL</td><td>Nerbe plus</td><td>02-502-3001</td><td>Prodotti simili sono disponibili anche da Sarstedt, Corning, VWR e altre aziende</td></tr><tr><td>Microstampi per piastre di Petri 3D Microtissue</td><td></td><td>Z764000-6EA</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture cellulari a 6 pozzetti,</td><td>sterili Greiner bio-one</td><td>657160</td><td>Prodotti simili sono disponibili anche da Sarstedt, Corning, VWR e altre aziende</td></tr><tr><td>70% etanolo</td><td>ChemLab</td><td>CL02.0537.5000</td><td></td></tr><tr><td>Biofloat</td><td>Sarstedt</td><td>83.3925.400</td><td>Piastra rivestita a 96 pozzetti disponibile in commercio per la formazione di sferoidi</td></tr><tr><td>Calcein Green-AM</td><td>Tebubio</td><td>AS-89201</td><td>Applicare in diluizione 1:1000</td></tr><tr><td>CellSens Dimension software</td><td>Olympus</td><td>versione 3</td><td></td></tr><tr><td>Collagene da placenta umana, tipo IV</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td>Per la preparazione di piastre per microscopia rivestite di poli-D-lisina da 0,07 mg/mL e 0,03 mg/mL di lenti per microscopia</td></tr><tr><td>Confocal FLIM Leica</td><td>Microsystems</td><td>N/A</td><td>Microscopio invertito Stellaris 8 Falcon con laser a luce bianca, rivelatori HyD X, camera di controllo climatica / T (OkoLab), obiettivo 25x/0,95 W</td></tr><tr><td>D(+)-Glucosio</td><td>Merck</td><td>8342</td><td>Preparare 1 M di soluzione madre, 1:100 per la preparazione del terreno di imaging (concentrazione finale 10 mM)</td></tr><tr><td>Terreno di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM), privo di rosso fenolo, glucosio, piruvato e glutammina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5030-10X1L</td><td>Per la preparazione del terreno di imaging</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino&nbsp;( FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270-098</td><td>Disponibile anche da Sigma. Deve essere inattivato a caldo prima dell'uso.</td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>Diluizione 1/100 per la preparazione del terreno di imaging (concentrazione finale 10 mM)</td></tr><tr><td>Cellule tumorali del colon umano HCT116</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>versione 1.54f</td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite X (LAS X)</td><td>Leica Microsystems</td><td>versione 4.6.1.27508</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td>Disponibile anche da Sigma. Applicare in diluizione 1:100.</td></tr><tr><td>Lipidure-CM5206</td><td>Amsbio</td><td>AMS.52000034GB1G</td><td></td></tr><tr><td>McCoy's 5A, richiede l'aggiunta di 1 mM di piruvato di sodio e 10 mM HEPES</td><td>VWR</td><td>392-0420</td><td>Terreno di crescita standard per cellule HCT116</td></tr><tr><td>timbri PDMS stampati in 3D MICRO-PATTERNED</td><td>N/</td><td>A N/A</td><td>Fornito dal Centre for Microsystems Technology, Professor Dr. Jan Vanfleteren, Università di Gand</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Chemlab</td><td>CL00.1429.100</td><td></td></tr><tr><td>Camera di couting Neubauer</td><td>Fisher Scientific</td><td>15980396</td><td></td></tr><tr><td>Sonde O2: MMIR1</td><td>N/A</td><td>N/A La</td><td>caratterizzazione completa, la convalida e alcune applicazioni sono disponibili all'indirizzo: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.12.11.571110 v1</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher scientific</td><td>Gibco18912014</td><td>Sciogliere la compressa di PBS in 500 mL di acqua distillata.</td></tr><tr><td>Pen Strep :P enicillina (10.000 U/mL) / streptomicina (10.000 &mu; g/mL) 100x soluzione</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Disponibile anche da Sigma. Applicare in diluizione 1:100.</td></tr><tr><td>Poli-D-lisina</td><td>Sigma</td><td>P6407-5mg</td><td>Per la preparazione di 0,07 mg/mL di collagene e 0,03 mg/mL di piastre per microscopia rivestite di poli-D-lisina</td></tr><tr><td>Ioduro di propidio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25535-16-4</td><td>Colorazione della morte cellulare, utilizzare 1 & micro; g/mL a 1 ora di incubazione</td></tr><tr><td>Filtro per siringa PVDF 0,22 & micro; m</td><td>Novolab</td><td>A35149</td><td>Prodotti simili sono disponibili anche da Sarstedt, Corning, VWR e altre aziende</td></tr><tr><td>Piruvato di sodio (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>Diluizione 1/100 per la preparazione del terreno di imaging (concentrazione finale 1mM)</td></tr><tr><td>Piastra sferica 5D a 24 pozzetti</td><td>Kugelmeiers</td><td>SP5D-24W</td><td></td></tr><tr><td>petridish sterile</td><td>Greiner bio-one</td><td>633181</td><td>Prodotti simili sono disponibili anche da Sarstedt, Corning, VWR e altre aziende</td></tr><tr><td>Pallone per coltura tissutale (25 cm&sup2; )</td><td>VWR</td><td>734-2311</td><td>Prodotti simili sono disponibili anche da Sarstedt, Corning, VWR e altre aziende</td></tr><tr><td>Pallone per coltura tissutale (75 cm&sup2;)</td><td>VWR</td><td>734-2313</td><td>Prodotti simili sono disponibili anche da Sarstedt, Corning, VWR e altre aziende</td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti con fondo a U</td><td>VWR</td><td>10062-900</td><td>Prodotti simili sono disponibili anche da Sarstedt, Corning, Greiner Bio-one e altre aziende</td></tr><tr><td>Agarosio ultrapuro</td><td>Invitrogen (Life Technologies)</td><td>16500-500</td><td>Altri tipi di agarosio come l'agarosio a basso punto di fusione (A-9414, Sigma), l'agarosio per uso di routine (A-9539, Sigma)</td></tr><tr><td>Microscopio invertito a fluorescenza a campo largo</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td>Microscopio a fluorescenza invertito IX81, con controllo motorizzato dell'asse Z, CoolLED pE4000 (16 canali, 365-770 nm), telecamera cMOS ORCA-Flash4.0LT (Hamamatsu), piastra riscaldante in vetro Okolab, software CellSens Dimension v.3 e obiettivi ad aria 4x/0,13 UPlanFLN e 40x/0,6 LUCPlanFLN. (Opzionale, per immagini ad alta risoluzione) 60x/1.0 LUMPLFLN acqua</td></tr></tbody></table>

produzione e microscopia multiparametrica per imaging a fluorescenza su cellule vive (flim) di sferoidi multicellulari

Production and Multi-Parameter Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) of Multicellular Spheroids

Gli sferoidi tumorali multicellulari sono un popolare modello di microaggregato tissutale 3D per la riproduzione del microambiente tumorale, il test e l'ottimizzazione di terapie farmacologiche e l'utilizzo di biosensori e nanosensori in un contesto 3D. La loro facilità di produzione, le dimensioni prevedibili, la crescita e i gradienti di nutrienti e metaboliti osservati sono importanti per ricapitolare il microambiente cellulare di nicchia 3D. Tuttavia, l'eterogeneità degli sferoidi e la variabilità dei loro metodi di produzione possono influenzare il metabolismo cellulare complessivo, la vitalità e la risposta ai farmaci. Ciò rende difficile scegliere la metodologia più appropriata, considerando i requisiti di dimensioni, variabilità, esigenze di biofabbricazione e utilizzo come modelli di tessuto 3D in vitro nella biologia delle cellule staminali e tumorali. In particolare, la produzione di sferoidi può influenzare la loro compatibilità con microscopie quantitative dal vivo, come l'imaging metabolico ottico, la microscopia a fluorescenza (FLIM), il monitoraggio dell'ipossia sferoidale con nanosensori o la vitalità. Qui vengono presentati una serie di protocolli convenzionali di formazione di sferoidi, evidenziando la loro compatibilità con le microscopie a campo largo, confocale e a due fotoni. Viene inoltre presentato l'imaging di follow-up alla pipeline di analisi con FLIM multiplexato in autofluorescenza e, utilizzando vari tipi di cancro e sferoidi di cellule staminali.

Qui, descriviamo diversi metodi di formazione di sferoidi multicellulari per eseguire la microscopia multiparametrica su cellule vive di follow-up. Utilizzando la microscopia a fluorescenza (FLIM), l'autofluorescenza cellulare, i coloranti di colorazione e le nanoparticelle, viene dimostrato l'approccio per l'analisi del metabolismo cellulare, dell'ipossia e della morte cellulare nel cancro tridimensionale (3D) vivo e negli sferoidi derivati da cellule staminali.

Produzione e microscopia multiparametrica per imaging a fluorescenza su cellule vive (FLIM) di sferoidi multicellulari

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug ...

production-multi-parameter-live-cell-fluorescence-lifetime-imaging

Research

Ricerca

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

Lifetime Imaging di fluorescenza (FLIM) è emersa come una tecnica fondamentale per l'immagine l'ambiente e l'interazione di proteine ​​specifiche e coloranti nelle cellule viventi. FLIM fluorescenti di rotori molecolari consente mappatura di viscosità in cellule viventi.

Lifetime Imaging di fluorescenza di rotori molecolari nelle cellule viventi

Presentato qui è un protocollo per la fabbricazione di un dispositivo di imaging sferoide. Questo dispositivo consente l'imaging a fluorescenza dinamica o longitudinale degli sferoidi delle cellule tumorali. Il protocollo offre anche una semplice procedura di elaborazione delle immagini per l'analisi dell'invasione delle cellule tumorali.

Imaging a fluorescenza risolta nel tempo e analisi dell'invasione delle cellule tumorali nel modello sferoide 3D

Il protocollo descrive la generazione di sferoidi ad alto rendimento per la bioprinting utilizzando l'analisi multiparametrica della loro ossigenazione e morte cellulare su un microscopio a fluorescenza standard. Questo approccio può essere applicato per controllare la vitalità degli sferoidi ed eseguire la standardizzazione, che è importante nella modellazione del tessuto 3D, del microambiente tumorale e della biofabbricazione (micro)tissutale di successo.

Biofabbricazione assistita da microscopia dell'ossigeno a prezzi accessibili di sferoidi multicellulari

Un metodo per l'assemblaggio di gradienti adesivi e solubile in una camera per gli studi di microscopia vivi migrazione cellulare è descritto. L'ambiente di ingegneria combina superfici antivegetative e le tracce adesive con pendenze soluzione e permette quindi di determinare l'importanza relativa di spunti di orientamento.

Creazione di sfumature adesivi e solubile per la migrazione di imaging cellulare con microscopia a fluorescenza

Questo protocollo descrive come utilizzare la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale per visualizzare e tracciare singoli recettori sulla superficie delle cellule viventi e quindi analizzare la mobilità laterale del recettore, le dimensioni dei complessi recettoriali e per visualizzare le interazioni transitorie recettore-recettore. Questo protocollo può essere esteso ad altre proteine di membrana.

Ad alta risoluzione Spatiotemporal Analisi del recettore Dynamics per singola molecola di microscopia a fluorescenza

La distribuzione spaziale e la dinamica temporale delle proteine e dei lipidi della membrana plasmatica è un argomento caldo in biologia. Qui questo problema è affrontato da un'analisi di fluttuazione dell'immagine spazio-temporale che fornisce concettualmente le stesse quantità fisiche di tracciamento di singole particelle, ma utilizza piccole etichette molecolari e configurazioni di microscopia standard.

Da Veloce imaging di fluorescenza di Molecular legge Diffusione su membrane cellulare dal vivo in un microscopio commerciale

Un nuovo protocollo di imaging è stato sviluppato utilizzando un attuatore meccanico motorizzato personalizzato per consentire la misurazione delle risposte in tempo reale alla deformazione meccanica nelle cellule vive. Rilevante per la meccanobiologia, il sistema può applicare deformazioni fino al 20% consentendo l'imaging quasi in tempo reale con microscopia confocale o a forza atomica.

Imaging Live Cell durante meccanica Stretch

Imaging di entrambi, l'isolato della membrana plasmatica e il volume intracellulare circostante, sarà presentato un microscopio avanzato che consentono veloce e ad alta risoluzione. L'integrazione di filatura disco e totale microscopia di fluorescenza di riflessione interna in un'unica configurazione permette esperimenti dal vivo imaging al prezzo di acquisizione alta fino a 3,5 s per serie di immagini.

Visualizzazione di formazione di aderenze in cellule per mezzo di avanzati filatura microscopia di fluorescenza di riflessione interna totale disco

Vi presentiamo un dispositivo microfluidico centricomotore a motore in grado di coltivare sferoidi cellulari. Utilizzando questo dispositivo, sferoidi di tipo cellulare singolo o multiplo potrebbe essere facilmente costati in condizioni di alta gravità.

Piattaforma lab-on-a-CD per la generazione di spheroid tridimensionali multicellulari

Il metodo presentato prevede lo stiramento uniassiale di idrogel morbidi 3D incorporati nella gomma siliconica, consentendo al contempo la microscopia confocale viva. Vengono dimostrate la caratterizzazione dei ceppi idrogel esterni e interni e l'allineamento delle fibre. Il dispositivo e il protocollo sviluppati possono valutare la risposta delle cellule a vari regimi di deformazione.

Ceppo controllato di idrogel 3D in imaging a microscopia dal vivo

Impara a produrre sferoidi multicellulari per analisi multiparametrica con microscopia FLIM su cellule vive. Questo metodo consente di studiare metabolismo cellulare e distribuzione dell'ossigeno in modelli 3D.

Produzione e microscopia multiparametrica per imaging a fluorescenza su cellule vive (FLIM) di sferoidi multicellulari

Esplora altri video