Generazione di sferoidi da linee cellulari: un metodo di coltura cellulare tridimensionale (3D)

Coltiva la linea cellulare desiderata come un monostrato 2D aderente. Rimuovere il terreno di coltura e lavare con soluzione fisiologica tamponata con fosfato o PBS. Quindi, aggiungere la tripsina e incubare mentre le cellule si staccano dalla superficie del pallone e diventano di forma rotonda. Aggiungere terreni freschi per neutralizzare la tripsina e sospendere le cellule. Trasferire la miscela in una provetta conica e utilizzare una centrifuga per pellettare le cellule.

Sostituire il surnatante con un terreno fresco e risospendere il pellet della cella. Utilizzare un emocitometro per contare il numero di cellule e calcolare una concentrazione di lavoro. Quindi, trasferire la giusta quantità di miscela cellulare in una piastra a pozzetti a bassissima adesione a fondo tondo e incubare. Le cellule si depositano sul fondo e si aggregano. Alla fine si attaccheranno l'uno all'altro e formeranno un assemblaggio compatto di celle 3D, lo sferoide.

Nel protocollo di esempio, vedremo come generare sferoidi 3D da una linea cellulare di cancro del colon e come viene applicato l'imaging dal vivo per tracciare la loro formazione. Inizia lavando la linea cellulare di cancro del colon-retto di interesse con cinque millilitri di PBS e rimuovendo le cellule dal fondo del pallone con 0,5 millilitri di tripsina per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Dopo aver confermato il distacco al microscopio, neutralizzare l'enzima di dissociazione cellulare con 10 millilitri di terreno completo e raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Risospendere il pellet in cinque millilitri di terreno completo fresco per il conteggio e risospendere le cellule a una concentrazione di 1,5 volte 10 per le terze cellule per millilitro.

Quindi seminare 20 microlitri di cellule in ciascun pozzetto di una piastra a fondo tondo a 96 pozzetti e posizionare la piastra in un apparato di imaging automatizzato all'interno di un incubatore a 37 gradi Celsius con il 5% di CO2 e il 95% di umidità. Accedere al software di acquisizione dell'apparecchio e selezionare Programma acquisizione, Avvio Aggiungi nave, Scansione in base alla pianificazione e Crea nave, Nuovo. Quindi, selezionare Tipo di scansione, Sferoide e selezionare i canali di campo chiaro e fluorescenza appropriati di interesse. Impostare l'ingrandimento su 10 volte e selezionare il modello di lastra e la sua posizione all'interno del cassetto dell'apparecchio di imaging. Seleziona la posizione dei pozzetti da visualizzare e inserisci la descrizione dell'esperimento, inclusi il nome, il tipo di celle e il numero di celle.

Per l'impostazione dell'analisi, selezionare Rinvia analisi a più tardi, fare clic con il pulsante destro del mouse sulla sequenza temporale e selezionare Imposta intervallo gruppo di scansione selezionato, quindi impostare Aggiungi scansioni ogni quattro ore e Per un totale di 24 ore. Quindi impostare l'ora di inizio su almeno un'ora dopo l'incubazione nell'apparato di imaging automatizzato. Per controllare l'andamento della crescita degli sferoidi, ogni due giorni, accedere al software di imaging e selezionare Visualizza scansioni recenti. Fare doppio clic sull'esperimento di interesse e selezionare Campo chiaro nel pannello Canali immagine. Quindi utilizzare lo strumento Misura caratteristiche immagine per misurare il diametro degli sferoidi. Aggiunta di 50 microlitri di terreno completo per pozzetto al quarto giorno per limitare qualsiasi mezzo di effetti di apparizione.