Generazione di sferoidi/organoidi tridimensionali da colture cellulari bidimensionali utilizzando un nuovo dispositivo di timbro

Lo scopo della nostra ricerca è quello di stabilire un protocollo efficiente e riproducibile per la generazione di colture cellulari tridimensionali utilizzando un innovativo sistema di micropozzetti a gradini in stampi di agarosio. Il nostro obiettivo è quello di rispondere a come creare un ambiente semplificato e controllato che promuova colture 3D uniformi e di alta qualità per test farmacologici, ingegneria genetica e applicazioni correlate. I recenti progressi nei sistemi di coltura cellulare 3D migliorano le interazioni cellulari e creano ambienti più simili a quelli in vivo.

Questo approccio migliora la formazione di organoidi sferoidi, rendendolo uno strumento promettente per la ricerca biomedica. Le attuali tecnologie per la coltura cellulare 3D includono gocce sospese, colture cellulari rotanti, plastiche a basso attacco, piastre con pozzetti conici, scaffold microporosi, perline magnetiche e idrogel privi di scaffold. Questi metodi consentono la formazione di strutture cellulari 3D, ognuna con i propri vantaggi e limiti.

Il nostro protocollo affronta la sfida di generare sferoidi e organoidi 3D uniformi con dimensioni e qualità costanti su larga scala. Risolve i problemi di vitalità e densità cellulare, le difficoltà di gestione e l'instabilità durante il processo, dimostrandosi una soluzione economica e riproducibile per una ricerca affidabile su colture cellulari 3D. Ci impegniamo a perseguire il miglioramento degli strumenti di ricerca, la generazione di organoidi sferoidi di cellule beta produttrici di insulina per l'analisi in vitro e l'incapsulamento in biopolimeri, puntando alla reversione del diabete di tipo I e alla generazione di organoidi sferoidi da cellule di carcinoma mammario umano triplo negativo come piattaforma di screening farmacologico prima del trattamento del paziente.

Progetta il dispositivo di timbro utilizzando il software specificato. Lavare il timbro su misura con una spugna a setole morbide e acqua distillata per rimuovere eventuali residui. Esporre il timbro pulito alla luce ultravioletta per cinque-10 minuti per garantire la sterilità.

Per preparare una soluzione di agarosio dall'1 al 2%, pesare la quantità necessaria di polvere di agarosio puro e scioglierla in PBS. Scaldare la soluzione in un forno a microonde fino a quando l'agarosio non si sarà completamente sciolto. Quindi, pipettare circa tre millilitri della soluzione di agarosio a 40 gradi Celsius in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti.

Posiziona il timbro al centro del pozzetto e lascia solidificare l'agarosio per 5-10 minuti. Dopo la solidificazione, rimuovere il timbro con delicati movimenti avanti e indietro per rilasciare il vuoto senza danneggiare i micropozzetti. Lavare i micropozzetti tre volte con PBS per rimuovere i residui.

Esporre la piastra alla luce ultravioletta per 10 minuti per eliminare la contaminazione microbica. Aggiungere tre millilitri di terreno di coltura a ciascun pozzetto della piastra a sei pozzetti e incubare la piastra per una notte a 37 gradi Celsius in un incubatore ad anidride carbonica. Per ottenere una sospensione omogenea di isole pancreatiche suine, aggiungere tripsina a una coltura cellulare bidimensionale per dissociare le cellule.

Quindi, contare le cellule e regolare la concentrazione per ottenere il numero desiderato di cellule per micropozzetto di una piastra a sei pozzetti. Pipettare tre millilitri di sospensione cellulare sui micropozzetti di agarosio e agitare la piastra per garantire una distribuzione uniforme. Lasciare che le celle si depositino per gravità per 10-15 minuti.

Quindi, osservare le cellule stabilizzate al microscopio. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius in un incubatore al 5% di anidride carbonica. Ogni due o tre giorni, sostituisci il 50% del terreno vecchio o esaurito con un terreno fresco.

Continuare la coltura fino a quando le strutture compatte e tridimensionali non sono completamente formate. Per raccogliere sferoidi o organoidi, rimuovere il terreno di coltura e, utilizzando una punta di pipetta tagliata, raccogliere le strutture tridimensionali mediante un pipettaggio vigoroso. Strutture tridimensionali compatte sono state formate con successo in 48 ore di coltura in micropozzetti di agarosio, come osservato attraverso l'aggregazione cellulare dipendente dal tempo.

Le strutture tridimensionali vitali sono state mantenute dopo la rimozione dai micropozzetti di agarosio con colorazione verde che indicava cellule vive all'interno delle strutture, confermando la vitalità e la stabilità cellulare.