Isolamento simultaneo di cardiomiociti di alta qualità, cellule endoteliali e fibroblasti da un cuore di ratto adulto

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare simultaneamente cardiomiociti, cellule endoteliali e fibroblasti vitali dal cuore di ratto per le loro analisi individuali in vitro. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in campo cardiovascolare sui meccanismi di segnalazione coinvolti nell'ipertrofia cardiaca, nel danno da ischemia e riperfusione, nella funzione endoteliale e nella fibrosi cardiaca. Il vantaggio principale di questa tecnica è che tutte le principali cellule cardiache possono essere isolate contemporaneamente, riducendo potenzialmente i costi di ricerca associati e il numero di animali da esperimento.

Dopo un lavaggio con acqua distillata e un mezzo Powell da 50 millilitri, sostituire il terreno con 80 millilitri di terreno Powell fresco e utilizzare una pipetta Pasteur di vetro dal cilindro di vetro per perfondere continuamente il terreno con carbogeno. Quindi, utilizzare due paia di pinze curve sottili per montare un cuore di ratto appena raccolto attraverso l'aorta sul sistema di perfusione di Langendorff e posizionare l'estremità della cannula del sistema di perfusione tra il primo ramo aortico e la valvola aortica. Fissare l'aorta con una pinza a coccodrillo.

Aprire la valvola della cannula, quindi fissare il cuore con una sutura chirurgica. Lasciare che 35 millilitri del mezzo di perfusione passino attraverso il cuore a goccia, rimuovendo eventuali residui di sangue. Posizionare l'imbuto di raccolta sotto il cuore e avviare la pompa peristaltica per far ricircolare il mezzo di perfusione dall'imbuto di raccolta al serbatoio.

Aggiungere la soluzione di collagenasi al mezzo di perfusione e perfondere il cuore con la soluzione di collagenasi a ricircolo per 30 minuti. Al termine della digestione, con le forbici, rimuovere il cuore dal sistema di Langendorff e metterlo in una capsula di Petri di vetro. Ora rimuovi sia gli atri che il tessuto adiposo residuo dal cuore.

Per evitare la contaminazione delle cellule epiteliali, utilizzare due pinze per staccare con cura il pericardio. Taglia il cuore al centro e posiziona le metà nel tritafazzoletti. Tritare il cuore due o tre volte e trasferire i pezzi di tessuto in una provetta conica da 15 millilitri contenente 12 millilitri di tampone digestivo dalla perfusione di Langendorff.

Digerire i frammenti di tessuto a bagnomaria per cinque-10 minuti, mescolando di tanto in tanto con una pipetta di plastica usa e getta da cinque millilitri. Quindi filtrare la sospensione cellulare attraverso un setaccio da 100 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri. Lavare il sistema di perfusione con un minimo di un litro di acqua distillata seguito da 100 millilitri di idrossido di sodio normale 0,1 per 30 minuti, quindi lavare il sistema con altri due o tre litri di acqua distillata e asciugare l'apparecchio con aria pulita.

Raccogliere le cellule filtrate mediante centrifugazione e utilizzare una pipetta monouso per trasferire con cura la cellula endoteliale e il fibroblasto contenente surnatante in una nuova provetta da 50 millilitri. Risospendere il pellet in sei millilitri di soluzione di calcio uno. Dopo un minuto, raccogliere le cellule con una seconda centrifugazione e risospendere il pellet in sei millilitri di soluzione di calcio due.

Dopo un minuto, diluire la sospensione cellulare con l'aggiunta di 12 millilitri di soluzione di calcio tre, e mescolare bene inclinando delicatamente. Dopo un'altra centrifugazione, risospendere il pellet in 20 millilitri di terreno CCT preriscaldato. Quindi aliquotare un millilitro di cellule in ciascuna delle 20 piastre sterili per colture cellulari da 35 millimetri pre-rivestite con laminina e posizionare le cellule in un incubatore per colture cellulari prive di anidride carbonica, sostituendo il terreno con due millilitri di terreno CCT fresco per rimuovere eventuali cellule morte dopo due ore.

Ora centrifugare la cellula endoteliale e il fibroblasto contenente surnatante e risospendere il pellet in 1,5 millilitri di tampone di isolamento delle cellule endoteliali. Trasferire le cellule in una provetta da due millilitri e aggiungere l'anticorpo CD31 anti-ratto di topo alle cellule per un'incubazione di 30 minuti a quattro gradi Celsius con rotazione end-to-end. Al termine dell'incubazione, aggiungere le perle di IGG Pan anti-topo per un 20 in incubazione a quattro gradi Celsius, con rotazione end-to-end.

Al termine dell'incubazione delle microsfere, posizionare le cellule in una rastrelliera magnetica per due minuti e utilizzare una pipetta da un millilitro per rimuovere con cura il surnatante per lo più contenente fibroblasti. Guarda i fibroblasti su un piatto di coltura di 10 centimetri contenente 10 millilitri di terreno di coltura cellulare per fibroblasti e posiziona le cellule in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per un'ora. Quindi, aggiungere un millilitro di tampone di lavaggio al tubo di cellule endoteliali e tappare il tubo.

Agitare delicatamente le cellule quattro o cinque volte per risospendere le perline. Quindi riposizionare il tubo nel magnete e rimuovere il tampone di lavaggio dopo un minuto. Dopo l'ultimo lavaggio, sostituire il tampone di lavaggio con un millilitro di terreno di coltura cellulare endoteliale MV2 e seminare le cellule endoteliali in un singolo pozzetto di una piastra a 12 pozzetti, per la loro coltura notturna nell'incubatore per colture cellulari.

Al termine dell'incubazione dei fibroblasti, lavare le cellule attaccate con un volume appropriato di PBS preriscaldato due o tre volte. Quindi, aggiungere alle cellule un terreno di coltura cellulare di fibroblasti fresco preriscaldato e rimettere i fibroblasti nell'incubatore di coltura cellulare. La mattina successiva, sostituire il surnatante sulla coltura di cellule endoteliali con un terreno di coltura di cellule endoteliali fresco e rimettere le cellule nell'incubatore, sostituendo il terreno ogni due o tre giorni, fino alla semi-confluenza.

Quindi lavare la coltura di cellule di fibroblasti attaccate con PBS fresco preriscaldato come appena dimostrato e nutrire le cellule con terreno fresco preriscaldato. La procedura di isolamento dei cardiomiociti produce una popolazione di cellule cardiache striate a forma di bastoncello, pura, pura al 70-80%. È quindi possibile eseguire l'analisi intracellulare dell'oscillazione del calcio di cardiomiociti isolati caricati con fura AM, in risposta alla ripurfusione dell'ischemia nei cardiomiociti, nonché l'analisi dei cambiamenti nella segnalazione del calcio nelle cellule endoteliali isolate da biglie magnetiche e nei fibroblasti, dopo l'aggiunta di ATP.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in tre ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di impostare correttamente questo sistema di perfusione e di fissare prontamente il cuore nel sistema non appena è pronto. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della ricerca cardiovascolare per esplorare la segnalazione coinvolta in diverse fisiopatologie cardiovascolari.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione dei principi di base dell'isolamento e della coltura delle cellule cardiache. Non dimenticare che lavorare con strumenti chirurgici e reagenti per colture cellulari può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni, come l'uso attento degli strumenti e l'uso di guanti.