Visualizzazione e analisi quantitativa di angiogenesi embrionale in Xenopus tropicalis

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare la vascolarizzazione dei girini di Xenopus tropicalis. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia cardiovascolare, come ad esempio come viene regolata l'angiogenesi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i vasi sanguigni in un embrione di tipo pozzetto intatto possono essere visualizzati con una semplice iniezione di colorante fluorescente.

Iniziare utilizzando un micro caricatore per riempire una micropipetta di vetro conico con circa cinque microlitri di soluzione LDL acetilata diI trasparente, facendo attenzione che non vengano caricate particelle precipitate. Sotto un microscopio da dissezione, utilizzare un paio di pinze numero 55 per agganciare la punta della pipetta per regolare il volume del complesso caricato e impostare il sistema di iniezione a pressione controllata per espellere circa cinque nano litri di soluzione per iniezione. Quindi immergere il puntale della pipetta in MS-222 0,04% in soluzione salina di Barth modificata 0,1X o MBS in uno stampo Sylgard personalizzato.

Successivamente, trasferire l'embrione di Xenopus tropicalis nello stampo Sylgard e confermare la sedazione completa con una mancanza di risposta alla stimolazione della pinna dorsale. Al microscopio da dissezione, caricare l'embrione con il lato ventrale rivolto verso l'alto nella rientranza a forma di V dello stampo in posizione leggermente obliqua. Montare saldamente due spilli da 0,1 millimetri su un supporto per spilli e utilizzare uno spillo per perforare la pelle sopra il cuore che dovrebbe essere visibilmente pulsante.

Inserire il perno attraverso il foro nello spazio tra il cuore e la pelle senza perforare il cuore e posizionare la punta inserita all'interno della regione in cui verrà praticata l'incisione. Quindi strofinare il secondo perno contro il perno inserito per praticare un'incisione lineare e utilizzare entrambi i perni insieme per allargare delicatamente l'incisione, esponendo il cuore. Per iniettare la soluzione di LDL acetilato DiI, inserire il puntale della pipetta di vetro nel cuore e iniettare da 50 a 60 nano litri di LDL acetilato DiI in circa 10 impulsi di eiezione.

Quando tutta la soluzione colorante è stata erogata, confermare che il cuore sta ancora battendo e trasferire l'embrione in una nuova capsula di Petri contenente 0,1X MBS. Dopo 5-10 minuti il girino dovrebbe riprendersi dall'anestesia e iniziare a muoversi. Dopo che è stato iniettato un numero adeguato di embrioni, esaminare visivamente gli embrioni anestetizzati correttamente etichettati al microscopio a fluorescenza, scartando tutti gli animali che hanno altri organi etichettati.

Gli embrioni che non sono stati sufficientemente marcati possono essere iniettati di nuovo. Quindi cattura le immagini degli embrioni correttamente etichettati. Per un imaging più accurato dei vasi sanguigni, fissare gli embrioni rianestetizzati in paraformaldeide al 4% per un'ora a temperatura ambiente al riparo dalla luce per la visualizzazione mediante microscopia confocale.

Se una quantità sufficiente di LDL diI acetilato viene iniettata nel cuore, la vena cardinale posteriore, o PCV, deve essere immediatamente visibile al microscopio a fluorescenza. Le vene intersomitiche, o ISV, emergono dorsalmente dal PCV in un'onda anteriore e posteriore che inizia allo stadio 36 e termina intorno allo stadio 40-41 diventando leggermente ramificata intorno allo stadio 43. Il PCV e l'ISV crescono in un modello angiogenico stereotipato che è sotto stretto controllo dello sviluppo.

È interessante notare che l'abbattimento della segnalazione di TIE-2 da parte dei morfalini antisenso diminuisce la lunghezza e la complessità degli ISV, mentre l'espressione della forma costitutivamente attiva di TIE-2 induce un'eccessiva ramificazione dell'ISV. È possibile calcolare un indice di complessità venosa per valutare la complessità degli ISV e generare percorsi renderizzati per visualizzare l'architettura complessiva del sistema vascolare embrionale di Xenopus tropicalis. Il protocollo originale è stato descritto per l'uso di Xenopus laevis da Levin e Colics e lo abbiamo adattato per Xenopus tropicalis.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in un'ora se eseguita correttamente. Prima di questa procedura, possono essere eseguite manipolazioni genetiche e farmacologiche per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio quali geni e vie di segnalazione regolano lo sviluppo vascolare. Utilizzando questa procedura, il sistema vascolare marcato può essere visualizzato in un animale intatto in tempo reale, fornendo un potente strumento per studiare le dinamiche dello sviluppo vascolare.

Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come iniettare LDL acetilato nel cuore di un girino di Xenopus tropicalis per visualizzarne la vascolarizzazione.