Visualizzazione e analisi quantitativa di angiogenesi embrionale in
25 maggio 2017
Questo protocollo dimostra un metodo basato su fluorescenza per visualizzare la vascolarizzazione e per quantificare la sua complessità in Xenopus tropicalis . I vasi sanguigni possono essere immagazzinati minuti dopo l'iniezione di un colorante fluorescente nel cuore battente di un embrione dopo manipolazioni genetiche e / o farmacologiche per studiare lo sviluppo cardiovascolare in vivo .
L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare la vascolarizzazione dei girini di Xenopus tropicalis. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia cardiovascolare, ad esempio su come viene regolata l'angiogenesi. Il principale vantaggio di questa tecnica è che i vasi sanguigni in un embrione intatto di tipo selvatico possono essere visualizzati mediante una semplice iniezione di un colorante fluorescente.
Cominciare utilizzando un microcaricatore per riempire una micropipetta di vetro conica con circa cinque microlitri di soluzione chiara di diI-LDL acetilato, avendo cura di non caricare particelle precipitate. Sotto un microscopio stereoscopico, utilizzare una pinzetta fine numero 55 per tagliare la punta della pipetta al fine di regolare il volume del complesso caricato e impostare il sistema di iniezione controllato a pressione per espellere circa cinque nanolitri di soluzione per iniezione. Successivamente, immergere la punta della pipetta nel MS-222 allo 0,04% in soluzione salina di Barth modificata 0,1X o MBS, all'interno di uno stampo in Sylgard su misura.
Trasferire successivamente l'embrione di Xenopus tropicalis nel mold in Sylgard e confermare la completa sedazione mediante l'assenza di risposta alla stimolazione della pinna dorsale. Sotto il microscopio stereoscopico, posizionare l'embrione con il lato ventrale rivolto verso l'alto nella scanalatura a forma di V del mold, in posizione leggermente obliqua. Inserire saldamente due pinzette minutiane da 0,1 millimetri in un supporto per pinzette e utilizzarne una per forare la pelle sopra il cuore, che dovrebbe essere visibilmente pulsante.
Inserire il perno attraverso il foro nello spazio tra il cuore e la pelle senza perforare il cuore e posizionare la punta inserita nella regione in cui verrà effettuata l'incisione. Quindi sfregare il secondo perno contro il perno inserito per creare un'incisione lineare e utilizzare entrambi i perni insieme per allargare delicatamente l'incisione, esponendo il cuore. Per iniettare la soluzione di DiI LDL acetilata, inserire la punta della pipetta di vetro nel cuore e iniettare da 50 a 60 nanolitri di DiI LDL acetilata in circa 10 impulsi di espulsione.
Dopo aver somministrato completamente la soluzione di colorante, verificare che il cuore stia ancora battendo e trasferire l'embrione in una nuova capsula di Petri contenente MBS 0,1X. Dopo cinque-dieci minuti, la rana deve riprendersi dall'anestesia e cominciare a muoversi. Dopo aver effettuato le iniezioni su un numero adeguato di embrioni, esaminare visivamente gli embrioni correttamente etichettati e anestetizzati al microscopio a fluorescenza, scartando gli animali che presentano marcatura di altri organi.
Gli embrioni che sono stati etichettati in modo insufficiente possono essere iniettati nuovamente. Successivamente, acquisire immagini degli embrioni correttamente etichettati. Per un'analisi più approfondita dei vasi sanguigni, fissare gli embrioni anestetizzati in paraformaldeide al 4% per un'ora a temperatura ambiente, protetti dalla luce, per la visualizzazione mediante microscopia confocale.
Se viene iniettata una quantità sufficiente di LDL marcati con diI acetylato nel cuore, la vena cardinale posteriore, o PCV, dovrebbe essere immediatamente visibile al microscopio a fluorescenza. Le vene intersomitiche, o ISV, emergono dorsalmente dalla PCV in un'onda che procede dall'anteriore al posteriore, iniziando allo stadio 36 e terminando intorno allo stadio 40-41, diventando leggermente ramificate intorno allo stadio 43. La PCV e le ISV crescono secondo un modello angiogenico stereotipato, sottoposto a un rigoroso controllo dello sviluppo.
È interessante notare che l'inibizione del segnale di TIE-2 mediante morpholini antisense riduce la lunghezza e la complessità dei vasi intersomiti (ISV), mentre l'espressione della forma costitutivamente attiva di TIE-2 induce un'eccessiva ramificazione degli ISV. Un Indice di Complessità Venosa può essere calcolato per valutare la complessità degli ISV e possono essere generate traiettorie rese graficamente per visualizzare l'architettura complessiva del sistema vascolare dell'embrione di Xenopus tropicalis. Il protocollo originale è stato descritto da Levin e Colics per l'uso in Xenopus laevis e noi lo abbiamo adattato per Xenopus tropicalis.
Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in un'ora se eseguita correttamente. Prima di questa procedura, è possibile effettuare manipolazioni genetiche e farmacologiche per rispondere a ulteriori domande, ad esempio su quali geni e vie di segnalazione regolano lo sviluppo vascolare. Utilizzando questa procedura, la vascolarizzazione marcata può essere visualizzata in un animale intatto in tempo reale, fornendo uno strumento potente per studiare la dinamica dello sviluppo vascolare.
Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come iniettare il LDL marcatore diI acetilato nel cuore di una tadpa di Xenopus tropicalis per visualizzarne la vascolarizzazione.
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Panoramica
Questo protocollo illustra un metodo basato sulla fluorescenza per visualizzare la vascolarizzazione e quantificarne la complessità in Xenopus tropicalis. La tecnica consente l’imaging dei vasi sanguigni poco dopo l’iniezione di un colorante fluorescente nel cuore dell’embrione, facilitando studi sullo sviluppo cardiovascolare in vivo.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia cardiovascolare
- Angiogenesi
- Biologia dello sviluppo
Sfondo
- Xenopus tropicalis è un organismo modello per lo studio dello sviluppo vertebrale.
- Comprendere lo sviluppo vascolare è fondamentale per ottenere informazioni su varie malattie.
- Le tecniche di imaging fluorescente migliorano la visualizzazione delle strutture biologiche.
- Questo metodo consente l'osservazione in tempo reale dei cambiamenti vascolari.
Scopo dello studio
- Visualizzare la vascolarizzazione delle larve di Xenopus tropicalis.
- Studiare la regolazione dell'angiogenesi.
- Fornire un metodo semplice ed efficace per lo studio dello sviluppo cardiovascolare.
Metodi Utilizzati
- Iniezione di un colorante fluorescente nel cuore dell'embrione.
- Utilizzo di un microcaricatore e di una micropipetta di vetro conica per un'erogazione precisa del colorante.
- Visualizzazione dei vasi sanguigni al microscopio stereoscopico.
- Applicazione di manipolazioni genetiche e farmacologiche per studiarne gli effetti sulla vascolarizzazione.
Risultati principali
- Visualizzazione riuscita dei vasi sanguigni in embrioni integri.
- Quantificazione della complessità vascolare ottenuta mediante imaging.
- Informazioni ottenute sulla dinamica dello sviluppo cardiovascolare.
- Efficacia dimostrata del metodo di iniezione del colorante fluorescente.
Conclusioni
- Il protocollo fornisce un metodo affidabile per lo studio dello sviluppo vascolare.
- L'imaging fluorescente è uno strumento potente per l'analisi in tempo reale.
- Questo approccio può facilitare ulteriori ricerche nella biologia cardiovascolare.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo consente la visualizzazione diretta e la quantificazione della complessità vascolare in un modello vertebrale, supportando la validazione precoce di bersagli nei percorsi di angiogenesi. Fornendo parametri quantitativi sulla formazione di nuovi vasi e sul loro ramificarsi, facilita la riduzione del rischio meccanicistico sui bersagli vascolari prima di intraprendere campagne di identificazione di composti promettenti. Il sistema Xenopus tropicalis offre una piattaforma pertinente alle malattie per valutare fenotipi angiogenici con un'elevata affidabilità predittiva nella ricerca cardiovascolare preclinica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo di Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche riguardanti regolatori angiogenici come la segnalazione di TIE-2, attraverso l'osservazione diretta dei modelli di gemmazione vascolare.
- Valore operativo: Fornisce un flusso di lavoro rapido, della durata di una settimana, per valutare l'impatto di geni o vie metaboliche sullo sviluppo vascolare, senza richiedere modelli geneticamente modificati.
- Valore predittivo: Parametri quantificabili come l'Indice di Complessità Venosa supportano una valutazione oggettiva degli effetti della modulazione del bersaglio, utili per decisioni di selezione del portafoglio.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Genera un'etichettatura vascolare standardizzata e riproducibile, compatibile con le analisi e i flussi di lavoro di imaging successivi.
- Output quantitativo: Consente la misurazione della lunghezza delle vene intersomitiche e della complessità della ramificazione come parametri rispondenti al dosaggio per lo screening di composti.
- Scalabilità: Una semplice iniezione del colorante e una procedura di imaging supportano la valutazione di media capacità di perturbazioni farmacologiche o genetiche.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Modella l'angiogenesi stereotipica in Xenopus tropicalis, fornendo informazioni sui percorsi dello sviluppo vascolare umano.
- Continuità traslazionale: Collega le scoperte iniziali alla validazione preclinica attraverso meccanismi angiogenici conservati.
- Riduzione del rischio meccanicistico: Permette di testare rapidamente modulatori di percorsi per chiarire la biologia del bersaglio prima di investire in studi su modelli mammiferi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dal test dell'ipotesi sul bersaglio all'identificazione del composto promettente, fornendo dati sul fenotipo vascolare che orientano le decisioni di avanzamento o interruzione nei programmi focalizzati sull'angiogenesi.
- Biologia della scoperta: Supporta la chiarificazione dei percorsi biologici collegando perturbazioni genetiche o farmacologiche a modifiche quantificabili nell'architettura vascolare.
- Screening: Fornisce letture riproducibili basate sull'imaging, adatte per valutare gli effetti dei composti sulla formazione di nuovi vasi sanguigni.
- Analisi: Offre metriche quantitative della complessità vascolare che consentono confronti oggettivi tra diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Sfrutta meccanismi conservati dell'angiogenesi per garantire continuità dai modelli embrionali ai sistemi vascolari dei mammiferi.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile di fenotipizzazione vascolare applicabile a diversi progetti mirati all'angiogenesi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione dei bersagli angiogenici attraverso una visualizzazione diretta e quantitativa delle reti vascolari.
- Valore operativo: Standardizza la valutazione vascolare mediante semplice iniezione di colorante e imaging riproducibile, minimizzando la variabilità tra esperimenti.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo una riduzione precoce dei rischi associati ai bersagli vascolari, riducendo il rischio di fallimento in fasi avanzate dei programmi cardiovascolari.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione corretta per rischio dei modificatori dell'angiogenesi in base a risultati fenotipici quantitativi.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in tecniche microchirurgiche per la manipolazione degli embrioni e la microiniezione cardiaca.
- È dipendente da infrastrutture per microscopia a fluorescenza per la visualizzazione dei vasi e l'acquisizione delle immagini.
- Necessita di una standardizzazione dello stadio embrionale e del momento dell'iniezione per un'etichettatura vascolare costante.
- Comporta considerazioni di adattamento quando si estendono i risultati ad altri sistemi modello o contesti di rilevanza umana.
- I limiti pratici includono la dipendenza dall'accessibilità embrionale e la necessità di un'attenta ottimizzazione della concentrazione del colorante per evitare un'etichettatura non specifica.
