Aumento del tempo della risposta alla rete alla stimolazione delle colture cellulari neuronali sulle matrici di microelettrodi

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare e associare il tessuto neuronale di topo E17, al fine di coltivare, registrare e stimolare reti neuronali su array di microelettrodi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nello studio delle dinamiche delle reti, in quanto si riferiscono ai meccanismi di base dell'apprendimento e della memoria. Il vantaggio principale di questa tecnica è che gli array di microelettrodi sono in grado di registrare da più siti contemporaneamente e quindi possono fornire una migliore risoluzione spaziale e temporale, rispetto alla più tradizionale pipetta di vetro su registrazione in un singolo sito.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle dinamiche di rete dell'apprendimento e della memoria, può anche essere utilizzato per studiare la tossicità dei farmaci o progettare paradigmi per la medicina personalizzata di prossima generazione. La dimostrazione visiva di questo processo è fondamentale, poiché la manipolazione del tessuto, durante il processo di dissezione e dissociazione, è difficile da apprendere semplicemente leggendo i protocolli. Per preparare l'array, aggiungere da 40 a 50 microlitri di laminina scongelata al centro di ciascun MEA e 0,2 millilitri di laminina alle piastre di controllo, utilizzando puntali per pipette sterili.

Coprire tutti i MEA e le piastre di controllo nella biocappa e trasferirli in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per un'ora. Dopo un'ora, rimuovere con cura la laminina in eccesso dal centro dei MEA mediante aspirazione con pipette sterili Pasteur e lasciare asciugare la superficie all'aria prima di procedere alla piastratura. Quindi, versare il terreno L-15 in quattro piastre di Petri da 100 millimetri, coprirle e metterle in un congelatore a meno 20 gradi Celsius per circa 40-60 minuti, fino a quando il mezzo non ha una consistenza fangosa, ma non è congelato.

Per prepararsi alla dissezione, posizionare una capsula di Petri di vetro a faccia in giù in un vassoio pieno di ghiaccio. Ora spruzzare il basso addome degli animali con etanolo al 70%. Usando piccole forbici chirurgiche, praticare un taglio a forma di V attraverso la pelle e il grasso sottocutaneo del basso addome, estendendo il taglio alle estremità distali della cavità toracica ed esponendo l'utero.

Usando il forcipe, solleva con cautela l'utero tra gli embrioni. Tagliare il tessuto connettivo con le forbici da dissezione fino a liberare l'intero utero. Quindi sciacquare brevemente l'utero con etanolo al 70% per rimuovere il sangue e metterlo in una delle quattro piastre di Petri riempite con L-15 freddo.

Successivamente, rilasciare ogni embrione dall'utero e dal sacco embrionale interno, utilizzando due paia di pinze a punta fine. Metti gli embrioni liberati nella seconda piastra piena di L-15 freddo, quindi trasferisci le teste nella terza capsula di Petri e i corpi nella quarta. Nella biocappa, posizionare uno spicchio di carta da filtro autoclavata sul palco della piastra di Petri in vetro refrigerato e posizionare una testa di embrione sulla carta da filtro.

Quindi posizionare il bordo tagliente del taglio inferiore delle forbici dell'iride alla base del cranio, mantenendo il taglio inferiore contro la superficie interna del cranio e lontano dal cervello, tagliare attraverso la placca occipitale e poi lungo la linea mediana tra le placche parietali. Continuare a tagliare rostralmente tra le placche craniche frontali cartilaginose. Quindi, partendo dal centro della placca occipitale, eseguire un taglio perpendicolare a sinistra e a destra del taglio centrale.

Dopodiché, fai scorrere con cautela una piccola spatola tra la superficie ventrale del cervello e le placche craniche inferiori, fino a quando non è completamente sotto il cervello. Quindi sollevare la spatola per rimuovere il cervello. Usando una spatola pulita, rimuovere prima il bulbo olfattivo, quindi sezionare il lobo frontale in uno schema trapezoidale.

Quindi, trasferire il tessuto in una provetta da centrifuga da 15 millilitri contenente il mezzo di conservazione. In questa procedura, utilizzare due lame di bisturi sterili per tritare il tessuto. Quindi aggiungere 2,5 millilitri della miscela di papaina Dnase al tessuto tritato nella capsula di Petri.

Agitare delicatamente la piastra di Petri per assicurarsi che tutto il tessuto sia libero nella soluzione e non aderisca al fondo della capsula. Successivamente, mettere il piatto in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Nella biocappa, utilizzare una pipetta di trasferimento sterile a foro largo per trasferire tutti i terreni e i tessuti in una provetta criogenica sterile da cinque millilitri.

Posizionare la punta della stessa pipetta di trasferimento vicino al fondo della provetta e scalpitare delicatamente la miscela da 10 a 15 volte. Quindi aggiungere due millilitri di DMEM 5/5 riscaldato alla miscela di celle dissociate e tappare la provetta da centrifuga. Mescolate delicatamente per inversione e centrifugatela a 573 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente.

Nella biocappa, scartare tutto il surnatante senza rompere il pallet. Successivamente, aggiungere un millilitro di DMEM 5/5 riscaldato al pallet nel tubo per risospendere le celle. Utilizzare una pipetta di trasferimento sterile di piccolo diametro per rompere il pallet pipettando delicatamente su e giù fino a ottenere una miscela omogenea.

Quindi trasferire 10 microlitri della sospensione cellulare in una provetta da microcentrifuga. All'esterno della biocappa, aggiungere 10 microlitri di blu di tripano ai 10 microlitri di sospensione cellulare nella provetta per microcentrifuga. Quindi caricare 10 microlitri della sospensione cellulare di tripano blu su un chip emocitometrico per lo smaltimento per contare le cellule.

Nella biocappa, utilizzare una micropipetta sterile per trasferire 50 microlitri di sospensione cellulare al centro di ogni array e di ogni piastra di Petri di controllo. Quindi posizionare le piastre di Petri coperte in un'incubatrice impostata a 37 gradi Celsius per tre o quattro ore. Quindi, aggiungere delicatamente un millilitro di DMEM 5/5 riscaldato a ciascun MEA.

Aggiungere con cura il terreno una goccia alla volta attorno ai bordi interni del MEA ed evitare di lavare le celle lontano dal centro dell'array. Successivamente, posizionare un tappo contenente una membrana FEP permeabile ai gas su ciascun MEA prima di rimetterli nell'incubatore. Dopo due giorni, eseguire una sostituzione completa del terreno con DMEM+ riscaldato estraendo il mezzo dal piatto.

Posizionare con cautela la punta della pipetta sulla parete interna ed erogare un millilitro di DMEM+ riscaldato Per le poppate successive, estrarre 500 microlitri di terreno dal piatto ed erogare nuovamente 500 microlitri di DMEM+ riscaldato. In questa procedura, ispezionare i campioni di piatto a giorni alterni al microscopio, per verificare la copertura cellulare sull'array e la contaminazione da parte di batteri o funghi. Prima di estrarre le colture dall'incubatore, collegare il regolatore di temperatura e accendere il sistema, consentendo alla piastra di base riscaldata del preamplificatore di raggiungere i 35 gradi Celsius.

Quindi posizionare la coltura condensata nel preamplificatore, in modo che la linea nera nel MEA si allinei bene con la massa di riferimento. Assicurarsi che i pin del preamplificatore siano allineati in modo che la parte superiore del preamplificatore sia fissata e che il tappo di coltura sia ancora acceso. Quindi, premere start nell'ambiente software per iniziare a visualizzare i segnali.

Nella finestra principale selezionare Picchi, Rilevamento, Automatico, modificare il valore della deviazione standard in meno cinque e fare clic su Aggiorna per reimpostare la soglia. Dopo aver visualizzato i segnali, fare clic su Stop, Record e Riproduci per iniziare l'attività di registrazione. I neuroni embrionali di topo sono placcati su MEA a 60 canali, che consentono la registrazione simultanea dell'attività neuronale attraverso la rete da ciascun elettrodo.

Ecco un grafico raster rappresentativo dell'attività di otto elettrodi in risposta alla stimolazione prima e dopo l'allenamento. La linea rossa verticale indica il momento dello stimolo e i segni di spunta neri indicano i potenziali d'azione. Nel pre-allenamento c'è una risposta immediata all'impulso dello stimolo attraverso i canali.

Nel post-allenamento, la rete mostra una risposta all'attività più prolungata, così come la risposta immediata alla stimolazione. Qui è mostrata la media di 12 reti addestrate e 10 reti di controllo, le reti addestrate indicano frequenze di picco significativamente alterate. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come isolare e associare il tessuto neuronale da topi embrionali ed essere in grado di coltivare, registrare e stimolare reti neuronali da array di microelettrodi.