Name: Aumento del tempo della risposta alla rete alla stimolazione delle colture cellulari neuronali sulle matrici di microelettrodi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Impara a coltivare e registrare reti neuronali di tessuto E17 di topo su array di microelettrodi per studiare le dinamiche di apprendimento e memoria. Questo metodo offre risoluzione spaziotemporale superiore rispetto alle tecniche tradizionali.

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Questo lavoro è stato finanziato dalla sovvenzione della National Science Foundation CMMI-1300007. Vorremmo riconoscere ai membri del laboratorio che hanno contribuito alla progettazione di questi protocolli e al mantenimento delle culture da oltre cinque anni presso l&#39;Università George Mason: il Dr. Joseph J. Pancrazio, il Dr. Hamid Charkhkar, il Dr. Gretchen Knaack , Il dottor Franz Hamilton, Michael Maquera e Robert Graham.

<ol><li>Charkhkar, H., Frewin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+cortical+neuronal+networks+for+in+vitro+material+biocompatibility+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Use of cortical neuronal networks for in vitro material biocompatibility testing.</a> Biosens Bioelectron. 53, 316-323 (2014).</li>
<li>Bologna, L. L., Nieus, T., Tedesco, M., Chiappalone, M., Benfenati, F., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-frequency+stimulation+enhances+burst+activity+in+cortical+cultures+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Low-frequency stimulation enhances burst activity in cortical cultures during development.</a> Neuroscience. 165 (3), 692-704 (2010).</li>
<li>Fröhlich, F., McCormick, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+electric+fields+may+guide+neocortical+network+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Endogenous electric fields may guide neocortical network activity.</a> Neuron. 67 (1), 129-143 (2010).</li>
<li>Anastassiou, C. A., Perin, R., Markram, H., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ephaptic+coupling+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ephaptic coupling of cortical neurons.</a> Nature Neurosci. 14 (2), 217-223 (2011).</li>
<li>Ozen, S., Sirota, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+electric+stimulation+entrains+cortical+neuronal+populations+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transcranial electric stimulation entrains cortical neuronal populations in rats.</a> J. Neurosci. 30 (34), 11476-11485 (2010).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+bursting+in+cortical+cultures+with+closed-loop+multi-electrode+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Controlling bursting in cortical cultures with closed-loop multi-electrode stimulation.</a> J. Neurosci. 25 (3), 680-688 (2005).</li>
<li>Shahaf, G., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+in+networks+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Learning in networks of cortical neurons.</a> J. Neurosci. 21 (22), 8782-8788 (2001).</li>
<li>Marom, S., Shahaf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development%2C+learning+and+memory+in+large+random+networks+of+cortical+neurons%3A+lessons+beyond+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Q+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Development, learning and memory in large random networks of cortical neurons: lessons beyond anatomy.</a> Q Rev Biophys. 35 (1), 63-87 (2002).</li>
<li>Marom, S., Eytan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+in+ex-vivo+developing+networks+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Learning in ex-vivo developing networks of cortical neurons.</a> Prog Brain Res. 147, 189-199 (2005).</li>
<li>Li, Y., Zhou, W., Li, X., Zeng, S., Luo, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+learning+in+cultured+neuronal+networks+with+antagonists+of+glutamate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Dynamics of learning in cultured neuronal networks with antagonists of glutamate receptors.</a> Biophys. J. 93 (12), 4151-4158 (2007).</li>
<li>Li, Y., Zhou, W., Li, X., Zeng, S., Liu, M., Luo, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+synchronized+bursts+in+cultured+hippocampal+neuronal+networks+with+learning+training+on+microelectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Characterization of synchronized bursts in cultured hippocampal neuronal networks with learning training on microelectrode arrays.</a> Biosens Bioelectron. 22 (12), 2976-2982 (2007).</li>
<li>Chiappalone, M., Massobrio, P., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+plasticity+in+cortical+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Network plasticity in cortical assemblies.</a> Eur. J. Neurosci. 28 (1), 221-237 (2008).</li>
<li>le Feber, J., Stegenga, J., Rutten, W. L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+slow+electrical+stimuli+to+achieve+learning+in+cultured+networks+of+rat+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The effect of slow electrical stimuli to achieve learning in cultured networks of rat cortical neurons.</a> PloS one. 5 (1), 8871(2010).</li>
<li>Ruaro, M. E., Bonifazi, P., Torre, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+neurocomputer%3A+image+processing+and+pattern+recognition+with+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Toward the neurocomputer: image processing and pattern recognition with neuronal cultures.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 52 (3), 371-383 (2005).</li>
<li>Hamilton, F., Graham, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-Dependent+Increase+in+Network+Response+to+Stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Time-Dependent Increase in Network Response to Stimulation.</a> PloS one. 10 (11), 0142399(2015).</li>
<li>Guidelines for Euthanasia of Rodents Using Carbon Dioxide. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://oacu.oir.nih.gov/sites/default/files/uploads/arac-guidelines/rodent_euthanasia_adult.pdf">https://oacu.oir.nih.gov/sites/default/files/uploads/arac-guidelines/rodent_euthanasia_adult.pdf</a> (2016).</li>
<li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="https://mitpress.mit.edu/books/culturing-nerve-cells">Culturing Nerve Cells: Business Source</a>. , MIT Press. Cambridge. (1998).</li>
<li>Gullo, F., Maffezzoli, A., Dossi, E., Wanke, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-latency+cross-and+autocorrelation+identify+clusters+of+interacting+cortical+neurons+recorded+from+multi-electrode+array%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Short-latency cross-and autocorrelation identify clusters of interacting cortical neurons recorded from multi-electrode array.</a> J. Neurosci. Methods. 181, 186-198 (2009).</li>
<li>Eytan, D., Brenner, N., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Adaptation+in+Networks+of+Cortical+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective Adaptation in Networks of Cortical Neurons.</a> J. Neurosci. 23 (28), (2003).</li>
<li>Bonifazi, P., Ruaro, M. E., Torre, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+properties+of+information+processing+in+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Statistical properties of information processing in neuronal networks.</a> Eur. J. Neurosci. 22 (11), 2953-2964 (2005).</li>
</ol>

Gli autori non hanno niente da rivelare.

I passi descritti in questo protocollo forniscono sufficienti dettagli per il principiante per piegare le proprie culture neuronali sulle MEA e per registrare l&#39;attività di rete. Questo protocollo contribuirà a garantire che le culture aderiscano correttamente, formando uno strato di cellule di moquette sulle matrici degli elettrodi e rimangono sani e privi di contaminazione per mesi. Anche se è meglio aderire a tutte le parti del protocollo, ci sono passaggi per tutto il processo che sono fondamentali per l&#39;esito positivo. L&#39;uso della tecnica asettica in tutto il processo è imperativo per impedire che le culture diventino contaminate. I nuovi MEA devono essere resi idrofili, come descritto nel protocollo, altrimenti si verificherà un&#39;adeguata adesione cellulare. Evitando pipettature dure e la formazione di bolle d&#39;aria durante la dissociazione ridurrà il numero di cellule danneggiate e porterà ad una resa più elevata e più sana. Passaggio da DMEM 5/5 a DMEM + dopo il primoL&#39;alimentazione è anche importante. DMEM 5/5 contiene il siero di cavallo, che causerà le cellule gliali a dominare la cultura se usato continuamente e provocherà una cattiva attività neuronale, anche se le culture appariranno sane 17 . Nutrire le culture come previsto e mantenerle in condizioni di incubazione adeguate è anche cruciale. Le colture di cellule di placcatura su MEA implicano molte variabili che possono portare a risultati inferiori al massimo. Sebbene l&#39;obiettivo sia un &quot;tappeto&quot; perfetto delle cellule, l&#39;insuccesso di affrontare i passaggi critici sopra menzionati comporterà una maturazione della cellula povera o una contaminazione. Anche la cattiva adesione cellulare, diversa dalla maturazione della cellula povera, è anche una preoccupazione. Ciò può essere causato da diversi fattori, tra cui la preparazione povera di MEA prima della placcatura o dell&#39;utilizzo di vecchi supporti. Se vecchio mezzo contenente una forma stabilizzata di L-glutamina e senza supplemento di siero per la coltura di cellule neurali (cfr), Le cellule inizialmente si aderiscono, ma poi galleggiano dopo circa due settimane. Se la contaminazione batterica è un problema persistente, un antibiotico, ad esempio ampicillina o pen-strep, può essere aggiunto al mezzo. Ci sono anche fungicidi disponibili per trattare la contaminazione fungina. Queste sono alcune delle variabili più comuni che possono influenzare l&#39;esito delle culture. Ci sono molti altri che verranno incontrati solo dopo il tempo e l&#39;esperienza. In confronto all&#39;uso di microelettrodi di vetro, questa tecnica è eccellente per studiare le dinamiche di rete e le risposte farmacologiche. Consente l&#39;uso di molti differenti modelli di stimolazione spaziometrica e temporale e consente la registrazione delle risposte neuronali da più aree contemporaneamente. I gruppi precedenti hanno dimostrato risultati interessanti utilizzando protocolli simili a quelli descritti qui 18 . Poiché le culture durano per settimane o mesi e le stesse culture possono essere riutilizzate, questa tecnica è anche unaPer esperimenti multipli nel tempo sulla stessa rete. Tuttavia, esistono limitazioni a questa tecnica. I MEA sono non invasivi. Pertanto, possono registrare solo attività extracellulare, in contrasto con la registrazione delle patch o la registrazione intracellulare con pipette. Inoltre, poiché ogni elettrodo in una matrice è coperto da diverse cellule, non è possibile risolvere l&#39;attività di un singolo neurone. Al contrario, perché queste sono culture in vitro , non possono riprodurre completamente le proprietà strutturali delle reti nel cervello. Inoltre, l&#39;attività può essere registrata solo per meno di 30 minuti alla volta senza un meccanismo che fornisce un&#39;atmosfera di CO 2 per le cellule per mantenere il loro equilibrio del pH. Una volta acquisita questa tecnica, possono essere esplorate manipolazioni farmacologiche con o senza stimolazione elettrica. Possono anche essere progettati e testati nuovi protocolli per sondare l&#39;apprendimento e la formazione della memoria nelle reti neuronali, insieme a pRotocoli per reti ippocampali o midollo spinale. I protocolli per la stimolazione e la formazione delle reti sono stati precedentemente pubblicati e alcuni di questi sono stati ulteriormente sviluppati in protocolli in vivo , come ad esempio l&#39;adattamento selettivo proposto da Eytan et al. 19 . Sono stati testati diversi protocolli. Tuttavia, solo i risultati di una modifica alla procedura del tetano proposto da Ruaro nel 2005 sono presentati qui 14 , 20 .

Le matrici di microelettrodi (MEAs) possono essere utilizzate per indagare la tossicità dei farmaci, i paradigmi di progettazione per la medicina personalizzata di nuova generazione e la dinamica di rete di studio nelle culture neuronali 1 . Contrariamente a metodi più tradizionali, come ad esempio il bloccaggio delle patch, che può registrare solo attività da una singola cella o registrazione in campo con una pipetta di vetro, in grado di registrare risposte extracellulari dai neuroni che circondano l&#39;elettrodo in un unico sito-MEAs possono simultaneamente Registrare da siti multipli in una coltura cellulare senza richiedere l&#39;arduo compito di posizionare ciascun elettrodo individualmente. Ciò consente di studiare le interazioni dinamiche tra gruppi di cellule che formano una rete all&#39;interno di quella cultura. Inoltre, gli effetti della stimolazione elettrica sugli schemi di cottura di rete 2 , 3 , 4 , 5 e il controllo di rete 6 &lt;/ Sup&gt; nelle culture neuronali sono state ben documentate e numerose configurazioni di stimolazione elettrica e controlli possono essere facilmente applicati all&#39;interno della stessa configurazione sperimentale, consentendo di esplorare un&#39;ampia gamma di dinamiche spazio-temporali. Una delle dinamiche chiave di interesse in questi studi in vitro è stata la misura in cui le reti coltivate mostrano proprietà che indicano l&#39;apprendimento 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Il Peixoto Lab ha esaminato in precedenza gli effetti dei segnali di allenamento ad alta frequenza, come descritto in Ruaro et al. 14 , sulle reti dei neuroni del mouse placcati sugli array di microelettrodi 15 . In questi esperimenti, le reti hanno mostrato un aumento della risposta in seguitoG allenamento indotto dalla stimolazione elettrica. L&#39;aumento della risposta è stata considerata una forma di apprendimento tramite il riconoscimento dello stimolo, in base alle quali le reti hanno risposto in modo coerente a una modifica dello stimolo dopo l&#39;applicazione di un protocollo di stimolazione specifica ( es . Questo protocollo dimostra come coltivare le cellule neuronali in MEA, registrare con successo da oltre il 95% dei piatti placcati, stabilire un protocollo per formare le reti per rispondere a modelli di stimolazione, ordinare l&#39;attività a singola unità, istogrammi della trama e interpretare i risultati Tali esperimenti. È stato dimostrato l&#39;uso di un sistema proprietario (vedi tabella dei materiali ) per la stimolazione e la registrazione delle culture neuronali, nonché l&#39;applicazione di pacchetti software (vedi tabella dei materiali ) per ordinare le unità neuronali . Un&#39;interfaccia utente grafica personalizzata (vedere la tabella dei materiali ) viene utilizzata per visualizzare i post-sGli istogrammi temporali di timulus, gli intervalli interpolati e la durata di scoppio, nonché di confrontare la risposta cellulare alla stimolazione prima e dopo un protocollo di allenamento.

<table><tbody><tr><td>Acido ascorbico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4403</td><td>Make 4 mg/mL aliquote</td></tr><tr><td>B-27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>Integratore senza siero per colture cellulari neurali. Preparare 1 mL di aliquote e congelare</td></tr><tr><td>Bicchieri - vetro - 100 mL</td><td>VWR</td><td>13912-160</td><td></td></tr><tr><td>Becher - vetro - 500 mL</td><td>VWR</td><td>10754-956</td><td></td></tr><tr><td>Pinza per pollice a punta smussata</td><td>World Precision Instruments</td><td>500365-G</td><td></td></tr><tr><td>Fiala criogenica - sterile, 2 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-500-26</td><td></td></tr><tr><td>Fiala criogenica - sterile, 5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-500-27</td><td></td></tr><tr><td>DMEM con Glutamax</td><td>Gibco Life Technology</td><td>10569-010</td><td>Terreni di coltura cellulare che contengono una forma stabilizzata di L-glutammina</td></tr><tr><td>DNasi Worthington</td><td>Biochemical</td><td>LK003172</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>ATCC</td><td>30-2030</td><td></td></tr><tr><td>Pinze</td> <td>per pollice a punta fineWorld Precision Instruments</td><td>501324-G</td><td></td></tr><tr><td>Pipette in vetro</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX -- I (100X)</td><td>Gibco Life Technology</td><td>35050-061</td><td>Una forma stabilizzata di L-glutammina utilizzata come chip emocitometro supplementare</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>22-600-101</td><td></td></tr><tr><td>Ibernazione EB completa</td><td>BrainBits</td><td>D00118</td><td>CO2</td></tr><tr><td>Siero di cavallo</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12195H</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2020-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Amplificatore per filtri MCS</td><td>Sistema multicanale</td><td>FA60SBC</td><td></td></tr><tr><td>Headstage/preamplificatore MCS</td><td>Sistema multicanale</td><td>MEA1060-INV</td><td></td></tr><tr><td>Array di microelettrodi MCS</td><td>Sistema multicanale</td><td>60MEA200/ Alimentatore 10iR-ITO</td><td></td></tr><tr><td>MCS Sistema</td><td>Multicanale</td><td>PS20W</td><td></td></tr><tr><td>Divisore di segnale MCS</td><td>Sistema Multicanale</td><td>SDMEA</td><td></td></tr><tr><td>Generatore di stimoli MCS</td><td>Sistema multicanale</td><td>STG4002</td><td></td></tr><tr><td>Regolatore di temperatura MCS</td><td>Sistema multicanale</td><td>TC02</td><td></td></tr><tr><td>Flacone per supporti - vetro 500 mL</td><td>VWR</td><td>10754-818</td><td>Provette</td></tr><tr><td>per microcentrifuga per autoclave - 0,4 mL</td> Provette per microcentrifuga <td>per autoclave</td><td>Thermo Fisher</td><td>3485</td></tr><tr><td>- 2 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>3434ECONO</td> Puntali per micropipette <td>per autoclave</td></tr><tr><td>- 10 &mu; L</td><td>VWR</td><td>37001-166</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per micropipette per autoclave - 1.000 &; L&nbsp;</td><td>VWR</td><td>13503-464</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per micropipette per autoclave - 200 &mu; L&nbsp;</td><td>VWR</td><td>37001-596</td> Micropipettatore <td>per autoclave</td></tr><tr><td>- 10 &mu; L&nbsp;</td><td>Micropipettatore Thermo Fisher</td><td>4641170N</td><td></td></tr><tr><td>- 1.000 &000 L&nbsp;</td><td>Micropipettatore Thermo Fisher</td><td>4641210N</td><td></td></tr><tr><td>- 200 &mu; L&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>4641230N</td><td></td></tr><tr><td>Papaina - 0,22</td><td>Filtrato Worthington Biochimico</td><td>LK003178</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina (Pen Streptomyc)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>piastre Petri -100 mm monouso</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>piastre Petri -100 mm vetro</td><td>VWR</td><td>10754-788</td><td></td></tr><tr><td>piastre Petri -35 mm&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100A</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tampone fosfato (PBS) (1x)</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di pulizia al plasma</td><td>Plasma Etch, Inc.</td><td>PE-50</td><td></td></tr><tr><td>Bromidrato di poli-D-lisina (PDL)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Provetta conica (centrifuga) in polietilene -15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-527-90</td><td></td></tr><tr><td>Provetta conica (centrifuga) in polipropilene -50 mL</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Maschere procedurali</td><td>Imco</td><td>1530-imc</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4562-5G</td><td></td></tr><tr><td>Lame per bisturi</td><td>World Precision Instruments</td><td>&nbsp; 500237-G</td><td></td></tr><tr><td>Forbici - iris</td><td>World Precision Instruments</td><td>14111-G</td><td></td></tr><tr><td>Forbici - grandi</td><td>World Precision Instruments</td><td>14214</td><td></td></tr><tr><td>Forbici - piccole chirurgiche</td><td>World Precision Instruments</td><td>&nbsp; 501733-G</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta sierologica - sterile, 1 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89130-892</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta sierologica - sterile, 2 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89130-894</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta sierologica - sterile, 25 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89130-900</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta sierologica - sterile, 50 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89130-902</td><td></td></tr><tr><td>Software: Matlab GUI</td><td>Peixoto Lab</td><td>npeixoto@gmu.edu</td><td>Utilizzato per analizzare i file .mat. Disponibile gratuitamente su richiesta. Contatta npeixoto@gmu.edu per richiederne una copia.</td></tr><tr><td>Software: MCS MC_Rack</td><td>MultiChannel System</td><td>N/A</td><td>Utilizzato per l'acquisizione dei dati</td></tr><tr><td>Software: NeuroExplorer</td><td>Plexon&nbsp;</td><td>http://www.plexon.com/products/neuroexplorer</td><td>Utilizzato per convertire i file .nex in .mat</td></tr><tr><td>Software: Ordinatore offline</td><td>Plexon&nbsp;</td><td>http://www.plexon.com/products/offline-sorter</td><td>Utilizzato per ordinare i picchi neurali e convertire i file di dati in .plx e quindi in .nex</td></tr><tr><td>Manuale del software: MCS MC_Rack</td><td>MultiChannel System</td><td></td><td>https://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/MC_Rack_Manual.pdf</td></tr><tr><td>Manuale del software: NeuroExplorer</td><td>Plexon&nbsp;</td><td></td><td>Manuale del</td></tr><tr><td>software https://www.neuroexplorer.com/downloads/Nex3Manual.pdf: Smistatore offline</td><td>Plexon</td><td></td><td>www.plexon.com/system/files/downloads/Offline%20Sorter%20v2.8%20Manual.pdf</td></tr><tr><td>Spatola - piccoli strumenti di precisione a doppia estremità</td><td>del mondo</td><td>&nbsp; 503440</td><td></td></tr><tr><td>Stericup 0.22 &micro; m filtro pori - 250 mL</td><td>Millipore</td><td>SCGVU02RE</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta di trasferimento - foro grande&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>335-1S</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta di trasferimento - foro piccolo&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>242-1S</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8154-20ML</td><td></td></tr><tr><td>Carta da filtro Whatman</td><td>Whatman</td><td>1442 150</td><td>Tagliare in 8 spicchi di torta e autoclavare in una capsula di Petri di vetro</td></tr></tbody></table>

aumento del tempo della risposta alla rete alla stimolazione delle colture cellulari neuronali sulle matrici di microelettrodi

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Le matrici di microelettrodi (MEAs) possono essere utilizzate per studiare la tossicità di farmaci, i paradigmi di progettazione per la medicina personalizzata di nuova generazione e la dinamica di rete di studio nelle culture neuronali. Contrariamente a metodi più tradizionali, quali la patch-clamping, che possono registrare solo attività da una singola cella, i MEA possono registrare contemporaneamente da più siti in una rete, senza richiedere l&#39;arduo compito di posizionare ciascun elettrodo singolarmente. Inoltre, numerose configurazioni di controllo e stimolazione possono essere facilmente applicate nella stessa configurazione sperimentale, consentendo di esplorare un&#39;ampia gamma di dinamiche. Una delle dinamiche chiave di interesse in questi studi in vitro è stata la misura in cui le reti coltivate mostrano proprietà che indicano l&#39;apprendimento. Le cellule neuronali del mouse coltivate in MEA mostrano un aumento della risposta dopo la formazione indotta dalla stimolazione elettrica. Questo protocollo illustra come coltivare le cellule neuronali sulle MEA; Riuscito con successoCavo da oltre il 95% dei piatti placcati; Istituire un protocollo per formare le reti per rispondere a modelli di stimolazione; E ordinare, tracciare e interpretare i risultati di tali esperimenti. È stato dimostrato l&#39;uso di un sistema proprietario per stimolare e registrare culture neuronali. I pacchetti software vengono utilizzati anche per ordinare le unità neuronali. Un&#39;interfaccia utente grafica personalizzata viene utilizzata per visualizzare gli istogrammi del tempo post-stimolo, gli intervalli interpolati e la durata di scoppio, nonché confrontare la risposta cellulare alla stimolazione prima e dopo un protocollo di allenamento. Infine, vengono discussi risultati rappresentativi e indicazioni future di questo sforzo di ricerca.

Le cellule neuronali del mouse coltivate su matrici multi-elettrodi mostrano un aumento della risposta dopo stimolazione elettrica. Questo protocollo illustra come coltivare i neuroni, come registrare l&#39;attività e come stabilire un protocollo per formare le reti per rispondere a modelli di stimolazione.

Aumento del tempo della risposta alla rete alla stimolazione delle colture cellulari neuronali sulle matrici di microelettrodi

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare e associare tessuto neuronale di topo E17, al fine di coltivare, registrare e stimolare reti neuronali su matrici di microelettrodi. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nello studio della dinamica delle reti, in relazione ai meccanismi di base dell'apprendimento e della memoria. Il principale vantaggio di questa tecnica è che le matrici di microelettrodi sono in grado di registrare da più siti simultaneamente e quindi possono fornire una risoluzione spaziale e temporale migliore rispetto alla registrazione tradizionale con pipetta di vetro su un singolo sito.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle dinamiche di rete apprendimento e memoria, può anche essere utilizzato per indagare la tossicità dei farmaci o progettare paradigmi per la medicina personalizzata di prossima generazione. La dimostrazione visiva di questo processo è fondamentale, poiché la manipolazione del tessuto durante le fasi di dissezione e dissociazione è difficile da apprendere semplicemente leggendo i protocolli. Per preparare l'array, aggiungere da 40 a 50 microlitri di laminina scongelata al centro di ogni MEA e 0,2 millilitri di laminina alle piastre di controllo, utilizzando punte di pipetta sterili.Coprire tutte le MEA e le piastre di controllo nell'ambiente sterile e trasferirle in un incubatore a 37 gradi Celsius per un'ora. Dopo un'ora, rimuovere con attenzione l'eccesso di laminina al centro delle MEA utilizzando una pipetta Pasteur sterile con aspirazione, e lasciare asciugare all'aria la superficie prima della semina. Successivamente, versare il mezzo L-15 in quattro piastre di Petri da 100 millimetri, coprirle e porle in un congelatore a meno 20 gradi Celsius per circa 40-60 minuti, fino a quando il mezzo non assume una consistenza simile a quella di una poltiglia, ma non è completamente congelato.Per prepararsi alla dissezione, posizionare una piastra di Petri di vetro capovolta in un vassoio pieno di ghiaccio. Spruzzare ora l'addome inferiore dell'animale con etanolo al 70%. Utilizzando forbici chirurgiche piccole, effettuare un'incisione a forma di V attraverso la pelle e il tessuto adiposo sottocutaneo dell'addome inferiore, estendendo l'incisione fino alle estremità distali della cavità toracica, esponendo così l'utero.Utilizzando una pinzetta, sollevare con attenzione l'utero tra gli embrioni. Tagliare il tessuto connettivo con forbici da dissezione fino a quando l'utero non è completamente libero. Quindi risciacquare brevemente l'utero con etanolo al 70% per rimuovere qualsiasi traccia di sangue e collocarlo in una delle quattro capsule di Petri contenenti L-15 freddo.Successivamente, rilasciare ogni embrione dall'utero e dalla sacca embrionale interna utilizzando due paia di pinzette a punta fine. Posizionare gli embrioni liberati nel secondo piatto contenente L-15 freddo, quindi trasferire le teste nel terzo piatto di Petri e i corpi nel quarto. All'interno della cappa biologica, posizionare un cuneo di carta da filtro sterilizzata sul piatto di vetro refrigerato e collocare una testa embrionale sulla carta da filtro.Successivamente, posizionare il bordo tagliente della lama inferiore delle forbici per iride alla base del cranio, mantenendo la lama inferiore a contatto con la superficie interna del cranio e lontano dal cervello; tagliare attraverso la piastra occipitale e quindi lungo la linea mediana tra le piastre parietali. Continuare il taglio in senso rostrale tra le piastre craniche frontali cartilaginee. Quindi, partendo dal centro della piastra occipitale, effettuare un taglio perpendicolare a sinistra e a destra del taglio centrale.Successivamente, inserire con attenzione una piccola spatola tra la superficie ventrale del cervello e le placche ossee inferiori del cranio, fino a quando non si trova completamente al di sotto del cervello. Sollevare quindi la spatola per rimuovere il cervello. Utilizzando una spatola pulita, rimuovere innanzitutto il bulbo olfattivo, quindi dissezionare il lobo frontale secondo un modello trapezoidale.Successivamente, trasferire il tessuto in un tubo da centrifuga da 15 millilitri contenente il mezzo di conservazione. In questa procedura, utilizzare due lame di bisturi sterili per tritare il tessuto. Quindi aggiungere 2,5 millilitri della miscela di Dnasi e papaina al tessuto tritato nella piastra di Petri.Agitare delicatamente la piastra di Petri per assicurarsi che tutti i tessuti siano liberi nella soluzione e non aderiscano al fondo della piastra. Successivamente, posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Nella cappa a flusso laminare, utilizzare una pipetta sterile a grande apertura per trasferire tutti i mezzi e i tessuti in un tubo criogenico sterile da cinque millilitri.Avvicinare la punta della stessa pipetta di trasferimento al fondo del tubo e pipettare delicatamente la miscela da 10 a 15 volte. Aggiungere quindi due millilitri di DMEM 5/5 riscaldato alla miscela di cellule dissociate e chiudere il tubo da centrifuga. Mescolare delicatamente capovolgendo il tubo e centrifugare a 573 ×g per cinque minuti a temperatura ambiente.Nella cappa biologica, scartare tutto il soprannatante senza rompere il pellet. Successivamente, aggiungere un millilitro di DMEM 5/5 riscaldato al pellet nel tubo per risospendere le cellule. Utilizzare una pipetta sterile a capillare sottile per disintegrare il pellet, aspirando e dispensando delicatamente più volte fino a ottenere una sospensione omogenea.Quindi trasferire 10 microlitri della sospensione cellulare in un tubo da microcentrifuga. Fuori dalla cappa biologica, aggiungere 10 microlitri di blu di tripano ai 10 microlitri di sospensione cellulare nel tubo da microcentrifuga. Successivamente, caricare 10 microlitri della sospensione cellulare al blu di tripano su un chip monouso di emocitometro per contare le cellule.Nell'ambiente sterile, utilizzare una micropipetta sterile per trasferire 50 microlitri di sospensione cellulare al centro di ogni matrice e di ogni piastra di Petri di controllo. Successivamente, posizionare le piastre di Petri coperte in un incubatore impostato a 37 gradi Celsius per tre o quattro ore. Poi, aggiungere delicatamente un millilitro di DMEM 5/5 riscaldato a ciascun MEA.Aggiungere con attenzione il mezzo, una goccia alla volta, lungo i bordi interni della MEA, evitando di allontanare le cellule dal centro dell'array. Successivamente, posizionare un tappo contenente una membrana FEP permeabile ai gas su ogni MEA prima di riporle nell'incubatore. Dopo due giorni, effettuare un completo rinnovo del mezzo con DMEM+ riscaldato, rimuovendo il mezzo presente nella piastra.Posizionare con attenzione la punta della pipetta sulla parete interna e dispensare un millilitro di DMEM+ riscaldato. Per i successivi alimentamenti, aspirare 500 microlitri di mezzo dalla piastra e dispensare nuovamente 500 microlitri di DMEM+ riscaldato. In questa procedura, ispezionare i campioni della piastra ogni due giorni al microscopio, per verificare la copertura cellulare dell'array e la contaminazione da parte di batteri o funghi. Prima di rimuovere le colture dall'incubatrice, collegare il controllore di temperatura e accendere il sistema, permettendo alla piastra riscaldata del preamplificatore di raggiungere 35 gradi Celsius.Quindi posizionare la coltura con il tappo nell'amplificatore preiniziale, in modo che la linea nera nel pozzetto MEA sia allineata con il riferimento di massa. Assicurarsi che i perni dell'amplificatore preiniziale siano allineati in modo che la parte superiore dell'amplificatore sia fissata e che il tappo della coltura sia ancora presente. Successivamente, premere Avvia nell'ambiente software per iniziare la visualizzazione dei segnali.Nella finestra principale selezionare Spikes, Rilevamento, Automatico, modificare il valore della deviazione standard a meno cinque e fare clic su Aggiorna per reimpostare la soglia. Dopo aver visualizzato i segnali, fare clic su Arresta, Registra e Riproduci per iniziare la registrazione dell'attività. Neuroni di topo embrionali sono seminati su MEA a 60 canali, che permettono la registrazione simultanea dell'attività neuronale attraverso la rete da ciascun elettrodo.Di seguito è riportato un esempio di grafico raster dell'attività registrata da otto elettrodi in risposta a stimolazione prima e dopo l'addestramento. La linea rossa verticale indica il momento dello stimolo, mentre i trattini neri indicano i potenziali d'azione. Prima dell'addestramento si osserva una risposta immediata all'impulso di stimolo su tutti i canali.Dopo l'addestramento, la rete mostra una risposta di attività più prolungata, oltre alla risposta immediata alla stimolazione. Qui viene mostrata la media di 12 reti addestrate e di 10 reti di controllo; le reti addestrate mostrano frequenze di potenziali d'azione significativamente alterate. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare e associare tessuto neuronale da topi embrionali, e si dovrebbe essere in grado di coltivare, registrare e stimolare reti neuronali mediante array di microelettrodi.

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Questo protocollo fornisce le informazioni necessarie per l'impostazione, la cura, la registrazione e stimolando elettricamente culture su MEA.

Come la cultura, record e stimolare reti neuronali sulla micro-array di elettrodi (MEA)

Un metodo efficace per studiare valanghe neuronale, cioè scala-invarianti spazio-temporale scoppia attività, indicativa delle dinamiche condizioni critiche nella corteccia. Valanghe emergere spontaneamente nello sviluppo di strati superficiali della corteccia cerebrale in coltura che permette di misure a lungo termine delle attività con gli array planare integrata multi-elettrodi (MEA), a condizioni ben controllate.

Multi-array di elettrodi Recordings Valanghe neuronali in Culture organotipica

Il video dimostra come utilizzare un array di microelettrodi (MEA) per registrare l'attività elettrofisiologica dei neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC). L'attività elettrofisiologica di un MEA multipozzetto contenente una co-coltura neurone-astrocitario viene registrata per rilevare potenziali d'azione da più neuroni nella rete, confermando il successo della differenziazione delle hiPSC in neuroni.

Misurazione dell'attività elettrofisiologica delle reti neuronali utilizzando array di microelettrodi

Questo video mostra la procedura di utilizzo dell'array multielettrodo (MEA) per misurare la fisiologia sinaptica in sfere di cocoltura 3D. Questo metodo consente di comprendere le dinamiche della rete neurale e l'attività del burst della rete sinaptica all'interno delle sfere 3D.

Utilizzo di array multielettrodo per misurare la fisiologia sinaptica in sfere di cocoltura 3D

In questo lavoro, un nuovo modello sperimentale in cui le colture neuronali 3D sono accoppiate a array di microelettrodi planari (MEA) è presented. 3D le reti sono costruite seminando i neuroni in un'impalcatura composta da microsfere di vetro su cui i neuroni crescono e formano strutture 3D interconnesse.

Interfacciamento 3D Engineered neuronali Culture a Micro-Electrode Array: Un innovativo<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello sperimentale

Presentiamo un protocollo per la coltura di espianti di neuroni gangliari murini a spirale primaria su array multi-elettrodi per studiare i profili di risposta neuronale e ottimizzare i parametri di stimolazione. Tali studi mirano a migliorare l'interfaccia neurone-elettrodo degli impianti cocleari a vantaggio dell'udito nei pazienti e del consumo energetico del dispositivo.

Ganglio spirale Neuron Espianto cultura e Elettrofisiologia su Multi Electrode Array

L'esposizione alle tossine ambientali possa avere un impatto acutamente gli embrioni in via di sviluppo. Sistema endocrino prodotti chimici come bisfenoli sono noti per influenzare negativamente il sistema nervoso. Qui descriviamo un protocollo utilizzando un modello di rete di un neurone del vertebrato (embrione) in vitro per studiare l'impatto funzionale di esposizione tossina su embrioni in anticipo.

Valutazione degli effetti di composti sullo sviluppo della funzione di vertebrati rete neurale utilizzando array di multi-elettrodi sistema endocrino

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Microfluidica di interfacciamento con microelettrodi per studiare comunicazione neuronale e propagazione del segnale assonale

Questo articolo contiene una serie di protocolli per lo sviluppo di reti di cardiomiociti derivate da cellule staminali derivate da cellule staminali derivate dall'uomo (hiPSC-CM) coltivate su piastre MEA multiwell per elettropolarmente la membrana cellulare per misurazioni potenziali di azione. Le registrazioni ad alta velocità vengono ottenute ripetutamente dagli stessi siti cellulari nel corso di giorni.

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Una piattaforma di array multi-elettrodo per la modellazione dell'epilessia utilizzando assembloidi cerebrali derivati da cellule staminali pluripotenti umane

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