Name: Multi-array di elettrodi Recordings Valanghe neuronali in Culture organotipica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 1 s
Description: Scopri la registrazione delle valanghe neuronali in colture organotipiche di corteccia e mesencefalo su array multi-elettrodo. Questo metodo permette di studiare la dinamica critica dell'attività cerebrale in vitro con precisione.

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Questo studio è stato finanziato dalla Divisione del programma di ricerca intramurale (DIRP) del National Institute of Mental Health, National Institutes of Health.

<ol><li>Spitzer, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+activity+in+early+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electrical activity in early neuronal development.</a> Nature. 444, 707-712 (2006).</li>
<li>Beggs, J. M., Plenz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+avalanches+in+neocortical+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal avalanches in neocortical circuits.</a> J. Neurosci. 23, 11167-11177 (2003).</li>
<li>Beggs, J. M., Plenz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+avalanches+are+diverse+and+precise+activity+patterns+that+are+stable+for+many+hours+in+cortical+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal avalanches are diverse and precise activity patterns that are stable for many hours in cortical slice cultures.</a> J Neurosci. 24, 5216-5229 (2004).</li>
<li>Stewart, C. V., Plenz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverted-U+profile+of+dopamine-NMDA-mediated+spontaneous+avalanche+recurrence+in+superficial+layers+of+rat+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inverted-U profile of dopamine-NMDA-mediated spontaneous avalanche recurrence in superficial layers of rat prefrontal cortex.</a> J. Neurosci. 26, 8148-8159 (2006).</li>
<li>Stewart, C. V., Plenz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostasis+of+neuronal+avalanches+during+postnatal+cortex+development+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">Homeostasis of neuronal avalanches during postnatal cortex development in vitro.</a> J. Neurosci. Meth. 169, 405-416 (2007).</li>
<li>Gireesh, E. D., Plenz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+avalanches+organize+as+nested+theta-+and+beta%2Fgamma-oscillations+during+development+of+cortical+layer+2%2F3%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Neuronal avalanches organize as nested theta- and beta/gamma-oscillations during development of cortical layer 2/3.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 7576-7581 (2008).</li>
<li>Petermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+cortical+activity+in+awake+monkeys+composed+of+neuronal+avalanches%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Spontaneous cortical activity in awake monkeys composed of neuronal avalanches.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 15921-15926 (2009).</li>
<li>Kinouchi, O., Copelli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+dynamical+range+of+excitable+networks+at+criticality%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Physics%22%5BJournal%5D)">Optimal dynamical range of excitable networks at criticality.</a> Nature Physics. 2, 348-351 (2006).</li>
<li>Shew, W. L., Yang, H., Petermann, T., Roy, R., Plenz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+avalanches+imply+maximum+dynamic+range+in+cortical+networks+at+criticality%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal avalanches imply maximum dynamic range in cortical networks at criticality.</a> J. Neurosci. 29, 15595-15600 (2009).</li>
<li>Shew, W. L., Yang, H., Yu, S., Roy, R., Plenz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Information+capacity+is+maximized+in+balanced+cortical+networks+with+neuronal+avalanches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Information capacity is maximized in balanced cortical networks with neuronal avalanches.</a> J Neurosci. 5, 55-63 (2011).</li>
<li>Karpiak, V., Plenz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+maintenance+of+organotypic+cultures+for+multi-electrode+array+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Preparation and maintenance of organotypic cultures for multi-electrode array recordings.</a> Current Protocols in Neuroscience. 1, 6-6 (2002).</li>
<li>Hammerle, H., Egert, U., Mohr, A., Nisch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+recording+in+neuronal+networks+with+substrate+integrated+microelectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Extracellular recording in neuronal networks with substrate integrated microelectrode arrays.</a> Biosens. Bioelectron. 9, 691-696 (1994).</li>
<li>Nisch, W., Bock, J., Egert, U., Hammerle, H., Mohr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thin+film+microelectrode+array+for+monitoring+extracellular+neuronal+activity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">A thin film microelectrode array for monitoring extracellular neuronal activity in vitro.</a> Biosens. Bioelectron. 9, 737-741 (1994).</li>
<li>Egert, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+organotypic+long-term+culture+of+the+rat+hippocampus+on+substrate-integrated+multielectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A novel organotypic long-term culture of the rat hippocampus on substrate-integrated multielectrode arrays.</a> Brain Res. Protoc. 2, 229-242 (1998).</li>
<li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAltman%2C+J+%22Atlas+of+Prenatal+Rat+Brain+Development%22">Atlas of Prenatal Rat Brain Development</a>. , CRC Press. Boca Raton. (1995).</li>
<li>Clauset, A., Shalizi, C. R., Newman, M. E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Power-law+distributions+in+empirical+data%5BTitle%5D)+AND+%22arXiv%22%5BJournal%5D)">Power-law distributions in empirical data.</a> arXiv. , (2009).</li>
<li>Plenz, D., Thiagarajan, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organizing+principles+of+neuronal+avalanches%3A+cell+assemblies+in+the+cortex%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The organizing principles of neuronal avalanches: cell assemblies in the cortex?</a> Trends Neurosci. 30, 101-110 (2007).</li>
<li>Cäser, M., Bonhoeffer, T., Bolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+organization+and+development+of+slice+cultures+from+rat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular organization and development of slice cultures from rat visual cortex.</a> Exp. Brain Res. 477, 234-244 (1989).</li>
<li>Cäser, M., Schüz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+neurons+in+neocortical+slice+cultures.+A+light+and+electron+microscopic+study+on+in+situ+and+in+vitro+material%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hirnforsch%22%5BJournal%5D)">Maturation of neurons in neocortical slice cultures. A light and electron microscopic study on in situ and in vitro material.</a> J. Hirnforsch. 33, 429-443 (1992).</li>
<li>Götz, M., Bolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+vasoactive+intestinal+polypeptide+%28VIP%29-containing+neurons+in+organotypic+slice+cultures+from+rat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Development of vasoactive intestinal polypeptide (VIP)-containing neurons in organotypic slice cultures from rat visual cortex.</a> Neurosci. Lett. 107, 6-11 (1989).</li>
<li>Götz, M., Bolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+Preservation+of+cortical+layers+in+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Formation and Preservation of cortical layers in slice cultures.</a> J. Neurobiol. 23, 783-802 (1992).</li>
<li>Bolz, J., Novak, N., Götz, M., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+target-specific+neuronal+projections+in+organotypic+slice+cultures+from+rat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Formation of target-specific neuronal projections in organotypic slice cultures from rat visual cortex.</a> Nature. 346, 359-362 (1990).</li>
<li>Bolz, J., Novak, N., Staiger, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+specific+afferent+connections+in+organotypic+slice+cultures+from+rat+visual+cortex+cocultured+with+lateral+geniculate+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus.</a> J. Neurosci. 12, 3054-3070 (1992).</li>
<li>Novak, N., Bolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+specific+efferent+connections+in+organotypic+slice+cultures+from+rat+visual+cortex+cocultured+with+lateral+geniculate+nucleus+and+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Formation of specific efferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus and superior colliculus.</a> Eur. J. Neurosci. 5, 15-24 (1993).</li>
<li>Plenz, D., Aertsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+dynamics+in+cortex-striatum+co-cultures.+I.+Anatomy+and+electrophysiology+of+neuronal+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural dynamics in cortex-striatum co-cultures. I. Anatomy and electrophysiology of neuronal cell types.</a> Neurosci. 70, 861-891 (1996).</li>
<li>Plenz, D., Aertsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+dynamics+in+cortex-striatum+co-cultures.+II.+Spatio-temporal+characteristics+of+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal dynamics in cortex-striatum co-cultures. II. Spatio-temporal characteristics of neuronal activity.</a> Neurosci. 70, 893-924 (1996).</li>
<li>Plenz, D., Kitai, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+cortex-striatum-mesencephalon+cultures%3A+the+nigro-striatal+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Organotypic cortex-striatum-mesencephalon cultures: the nigro-striatal pathway.</a> Neurosci. Lett. 209, 177-180 (1996).</li>
<li>Plenz, D., Kitai, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up%27+and+%27down%27+states+in+striatal+medium+spiny+neurons+simultaneously+recorded+with+spontaneous+activity+in+fast-spiking+interneurons+studied+in+cortex-striatum-substantia+nigra+organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Up' and 'down' states in striatal medium spiny neurons simultaneously recorded with spontaneous activity in fast-spiking interneurons studied in cortex-striatum-substantia nigra organotypic cultures.</a> J. Neurosci. 18, 266-283 (1998).</li>
<li>Plenz, D., Herrera-Marschitz, M., Kitai, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+organization+of+the+globus+pallidus-subthalamic+nucleus+system+studied+in+organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Morphological organization of the globus pallidus-subthalamic nucleus system studied in organotypic cultures.</a> J. Comp. Neurol. 397, 437-457 (1998).</li>
<li>Plenz, D., Kitai, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+basal+ganglia+pacemaker+formed+by+the+subthalamic+nucleus+and+external+globus+pallidus+%5Bsee+comments%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A basal ganglia pacemaker formed by the subthalamic nucleus and external globus pallidus [see comments].</a> Nature. 400, 677-682 (1999).</li>
<li>Plenz, D., Kitai, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+high-frequency+oscillations+in+local+circuits+of+rat+somatosensory+cortex+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Generation of high-frequency oscillations in local circuits of rat somatosensory cortex cultures.</a> J Neurophysiol. 76, 4180-4184 (1996).</li>
<li>Klostermann, O., Wahle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+spontaneous+activity+and+morphology+of+interneuron+types+in+organotypic+cortex+and+thalamus-cortex+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci%22%5BJournal%5D)">Patterns of spontaneous activity and morphology of interneuron types in organotypic cortex and thalamus-cortex cultures.</a> Neurosci. 92, 1243-1259 (1999).</li>
<li>Cowan, R. L., Wilson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+firing+patterns+and+axonal+projections+of+single+cortico-striatal+neurons+in+the+rat+medial+agranular+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Spontaneous firing patterns and axonal projections of single cortico-striatal neurons in the rat medial agranular cortex.</a> J. Neurophysiol. 71, 17-32 (1994).</li>
<li>Porter, L. L., Rizzo, E., Hornung, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+affects+parvalbumin+expression+during+cortical+development+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dopamine affects parvalbumin expression during cortical development in vitro.</a> J Neurosci. 19, 8990-9003 (1999).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

1. Questioni tecniche: <ol><li> Tecnica sterile. La preparazione del MEA e preparazione culturale sono tutti eseguiti all&#39;interno di una cappa a flusso laminare in condizioni sterili. Gli antibiotici, che influenzano l&#39;attività neuronale, non vengono utilizzati in qualsiasi momento durante il processo di preparazione e cultura. </li><li> Plasma / trombina coagulazione e l&#39;aderenza del tessuto sul MEA. Tissue sopravvivenza sulla MEA richiede un attento equilibrio tra il tempo richiesto per il plasma / trombina coagulazione e il tempo di esposizione dei tessuti per l&#39;atmosfera. Un tempo di coagulazione breve rischi prematuro distacco di sezioni dalla MEA, mentre l&#39;esposizione prolungata in atmosfera provoca una degenerazione dei tessuti. Perché la forza della soluzione di trombina determina la velocità del processo di coagulazione, è un parametro molto importante per attaccare con successo, le culture sane in superficie MEA. Si ottengono risultati migliori con 1000 unità (1KU; 1 unità NIH = 0,324 ± 0,073 mg). Importante, incompleta miscelazione del plasma / soluzione di trombina risultati nella coagulazione spazialmente eterogeneo promozione plasma rotture durante la coltura. &#39;Buchi&#39; queste plasma gravemente nuocere alla salute della cultura e staccare la cultura dal microelettrodi, compromettendo così la qualità della registrazione elettrofisiologica. Lavorare con piastre di raffreddamento durante la MEA / tessuto assemblaggio rallenta la coagulazione e consente la miscelazione omogenea del plasma / soluzione di trombina e il posizionamento corretto delle sezioni di tessuto. Allo stesso modo, con l&#39;aggiunta di medie gocce solo alla camera di cultura di sommergere la cultura dopo soli 5 minuti di coagulazione, riduce notevolmente il rischio di distacchi del tessuto a causa di tensioni superficiali. Una cultura di successo si appiattisce sulla MEA e leggermente ampliare mostrando una crescita sana per settimane, senza alcun segno importante di incompleta tessuto-MEA contatto o degenerazione dei tessuti (es. fig. 1D). </li><li> Dissezione dei tessuti. Coltelli Micro hanno notevolmente migliorato il nostro processo di dissezione. Noi usiamo due lame di rasoio bordo (Strumenti Belle Scienza - fragili lame di bisturi - 100050-00), da cui abbiamo diviso ~ 2 mm di larghezza &#39;lame&#39; con una pinza, e tenerli con un supporto bisturi. Campioni di tessuto sezionato dalla fetta coronale con una superficie liscia, movimento verticale fermo della lama quindi riducendo notevolmente lo stress meccanico a causa della trazione del tessuto complessivo miglioramento della salute della cultura. </li><li> Tessuto di raffreddamento. Il corretto raffreddamento delle fette e sezioni di tessuto durante la preparazione è essenziale per il successo della cultura. Noi usiamo piatti freddi su misura costruito su elementi Peltier attaccato sotto ad un disco di metallo. Il calore prodotto dall&#39;elemento Peltier viene rimosso attraverso la perfusione acqua fredda. Questo riduce notevolmente i tempi di preparazione e standardizza il raffreddamento durante ogni fase della preparazione (Labs Dold &amp; Engineering 131 Plantation Dr. Seguin, TX 78155;. (830) 560-1471)). </li><li> Condizione incubatrice. Una misura incubatore con precise condizioni a dondolo interno è stato fondamentale per il nostro successo nel coltivare le fette su MEA. Sulla base di un originale in-house di progettazione Multichannelsystems (attualmente non disponibile in commercio), il dispositivo a dondolo interno è costituito da vassoi che sono collegati a due ruote laterali di grandi dimensioni. Motori passo-passo e controlli computerizzati consentono una precisa traiettoria a dondolo (angolo a dondolo, dondolo velocità e intermittenti pause). In ultima analisi, culture fetta devono essere esposti a medio ambiente e la cultura in alternanza lento. L&#39;approccio tradizionale è quello di posizionare le culture fetta in tubi stretti che ruotano lentamente lungo ci asse più lungo. Qui, lenta rotazione non produce sollecitazioni meccaniche dovute alla stessa rotazione e la velocità di rotazione è abbastanza alta da ottenere un ottimale &#39;alimentazione / respirare&#39; ciclo di circa 5 - durata 10 min. L&#39;interno, più compatto della camera di MEA, il suo volume totale di circa 2 cc, e il piccolo volume di terreno di coltura richiesta per il condizionamento di media dal tessuto stesso, pone una sfida significativa. Facendo scorrere l&#39;MEA tra ± ~ 70 ° angolo (tempo di ciclo: ~ 200 s), rallentando la velocità a dondolo come le transizioni cultura tra la fase liquida e l&#39;atmosfera, e ad arrestare la dondolo agli angoli estremi per la prolungata esposizione all&#39;atmosfera è stato essenziale per la sopravvivenza della cultura. </li></ol> 2. Età evolutiva di culture corteccia per studiare valanghe neuronale Fette acuta da corteccia di ratto sono comunemente prese a PND 0-1 e colto per molte settimane sulla MEA. I primi studi hanno chiaramente dimostrato che singole culture fetta corteccia, dopo diverse settimane in vitro, mantenere una struttura a strati con tipi di cellule identificabili che possono essere facilmente rispetto alle classi di cellule in vivo 18,18-21. L&#39;organizzazione a strati in questo sistema in vitro è stato convenientemente utilizzata per lo studio del talamoinnervazione della corteccia durante lo sviluppo 22-24, così come per la guida delle strutture sottocorticali, come lo striato 25,26. In effetti, la specificità nella formazione di connessioni neuronali all&#39;interno e tra regioni del cervello permette per la costruzione di complessi sistemi in vitro che riprendono numerosi sistemi di proiezione dettagliate, ad esempio quello della corteccia, dei gangli basali circuiti 27-30. Dopo 4 - 6 settimane in vitro, solo fette corteccia 31 e fettine di corteccia co-coltura con striato 26 o 32 talamo manifestazione spontanea e GIÙ stati tipicamente presenti in vivo sul ratto anestetizzato uretano 33. L&#39;organizzazione bel temporale di questi Stati-up porta il marchio di garanzia di annidati θ e γ-oscillazioni indicativo di una rete elettrofisiologico maturo di neuroni piramidali e interneuroni GABAergici fast-spiking 31. È importante sottolineare che, in assenza di recettori della dopamina D2-stimolazione, la maturazione degli interneuroni corticali parvalbumina-positivi è ritardata di circa 2 settimane nelle culture fetta corteccia 34. In linea con questi risultati, la durata dello sviluppo di annidati θ-, β-e γ-oscillazioni corrisponde a quella in vivo, quando fette corteccia sono co-coltura con l&#39;area tegmentale ventrale (VTA), che contiene i neuroni dopaminergici che proiettano la corteccia 6. Questi studi indicano che quando si studia valanghe neuronale, che dipendono essenzialmente dal maturo inibizione veloce GABAergici e si trovano negli strati superficiali della corteccia 2,4, grande cura deve essere presa per assicurare corretta maturazione del tessuto corticale. Mentre valanghe neuronale sorgono nelle culture corteccia singolo nel corso di tempo di 2 - 5 settimane 4, quando si richiede un corso evolutivo tempo che è abbinato al vivo nello sviluppo, fette corteccia bisogno di un appropriato stimolazione del recettore della dopamina, ad esempio di co-coltura fette corteccia con la VTA 6.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> Array integrato multielectrode planare </td><td> I sistemi multicanale ( <a href="www.multichannelsystems.com">www.multichannelsystems.com</a> ) ALA Scientific Instruments (Www.alascience.com) </td><td> <a href="http://www.multichannelsystems.com/products-mea/product-details/products/158/20030ir-ito-wo.html">200/30iR-ITO-w/o</a> </td><td> Nitrato di titanio (TiN) elettrodi (30 mm di diametro) hanno grande superficie con conseguente bassa impedenza (~ 1,5 kΩ a 1 kHz) ed eccellenti registrazioni a larga banda (w / o - senza anello) </td></tr><tr><td> Camera di vetro </td><td> www.aceglass.com </td><td> 7620-32 </td><td> Cilindro di vetro filettato </td></tr><tr><td> Camera di tappo </td><td> www.aceglass.com </td><td> 7622-114 </td><td> Cappuccio di plastica con inserto in teflon </td></tr><tr><td> Sylgard 184 </td><td> www.wpiinc.com </td><td> SYLG184 </td><td> Due parti in silicone elastomero </td></tr><tr><td> Poli-D-lisina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P6407-5mg </td><td> γ-irradiati, polvere liofilizzata, cellule in coltura testato. Ricostituito con 5 ml di acqua deionizzata prima dell&#39;uso. </td></tr><tr><td> Sale Gey La soluzione bilanciata </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G9779-500mL </td><td> sterile filtrata e colta testato </td></tr><tr><td> pollo al plasma </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P3266-5ml </td><td> Liofilizzato, ricostituire con 5 ml di acqua deionizzata prima dell&#39;uso. </td></tr><tr><td> trombina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6634-1KU </td><td> dal plasma bovino, sotto forma di polvere liofilizzata. </td></tr><tr><td> siero di cavallo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H1138-100 ml </td><td> mandria donatore, inattivato con il calore, la cultura cellulari testate </td></tr><tr><td> Basale medio Aquila </td><td> Invitrogen </td><td> 21010-046 </td><td> 1x, 500 ml - (+) Earle Sali, (-) L-glutamina), </td></tr><tr><td> Soluzione salina tamponata di Hank </td><td> Invitrogen </td><td> 24020-117 </td><td> 500 ml - (+) Magnesio, (+) di calcio, w / rosso fenolo) </td></tr><tr><td> Camera di diapositive </td><td> Lab-Tek-Camera scorrere w / cover (Nunc), sterile </td><td> 177429 </td><td></td></tr><tr><td> Uridina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> U3003 </td><td></td></tr><tr><td> ARA-C citosina-β-D-arabinofuranoside </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C6645 </td><td></td></tr><tr><td> 5-fluoro-2&#39;-deossiuridina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0503 </td><td></td></tr></tbody></table>

multi-array di elettrodi recordings valanghe neuronali in culture organotipica

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

La corteccia è attiva spontaneamente, anche in assenza dei fattori di produzione o di uscita del motore. Durante lo sviluppo, questa attività è importante per la migrazione e la differenziazione dei tipi di cellule della corteccia e la formazione di connessioni neuronali 1. Nel animale adulto, l&#39;attività in corso riflette il passato e il presente stato di un animale in cui gli stimoli sensoriali sono perfettamente integrati per calcolare le azioni future. Così, una chiara comprensione dell&#39;organizzazione del corso dell&#39;attività ovvero spontanea è un prerequisito per capire la funzione della corteccia. Tecniche di registrazione ha rivelato che numerose attività in corso nella corteccia si compone di molti neuroni le cui singole attività transitoriamente somma ai grandi eventi che possono essere rilevati nel potenziale di campo locale (LFP) con microelettrodi extracellulari, o nel elettroencefalogramma (EEG), il magnetoencephalogram (MEG ), e il segnale BOLD dalla risonanza magnetica funzionale (fMRI). La LFP è attualmente il metodo di scelta quando si studia l&#39;attività neuronale popolazione con alta risoluzione temporale e spaziale alla scala mesoscopica (diverse migliaia di neuroni). Al microelettrodo extracellulare, localmente attività sincronizzata del spazialmente neighbored risultato neuroni deviazioni rapido l&#39;LFP fino a diverse centinaia di microvolt. Quando si utilizza una serie di microelettrodi, le organizzazioni di tali deviazioni possono essere comodamente controllati nello spazio e nel tempo. Valanghe neuronale descrivere la scala-invariante organizzazione spazio-temporale in corso di attività neuronale del cervello 2,3. Essi sono specifici per gli strati superficiali della corteccia, come stabilito in 4,5 vitro, in vivo nel ratto anestetizzato 6, e nella scimmia sveglio 7. È importante sottolineare che gli studi teorici ed empirici suggeriscono che le valanghe 2,8-10 neuronale indicano una dinamica squisitamente equilibrato stato critico della corteccia che ottimizza il trasferimento di informazioni e di elaborazione delle informazioni. Al fine di studiare i meccanismi di sviluppo valanga neuronale, la manutenzione e la regolamentazione, in preparati in vitro sono di grande beneficio, in quanto consentono di registrazioni stabile di attività valanghiva a condizioni ben controllate. L&#39;attuale protocollo descrive come studiare valanghe neuronali in vitro, sfruttando lo sviluppo strato superficiale in organotipica corteccia culture, culture fetta cioè, coltivate su planare, array di microelettrodi integrati (MEA, vedi anche 11-14).

Un metodo efficace per studiare valanghe neuronale, cioè scala-invarianti spazio-temporale scoppia attività, indicativa delle dinamiche condizioni critiche nella corteccia. Valanghe emergere spontaneamente nello sviluppo di strati superficiali della corteccia cerebrale in coltura che permette di misure a lungo termine delle attività con gli array planare integrata multi-elettrodi (MEA), a condizioni ben controllate.

Multi-array di elettrodi Recordings Valanghe neuronali in Culture organotipica

La corteccia è spontaneamente attiva, anche in assenza di qualsiasi input specifico o output motorio. Durante lo sviluppo, tale attività è importante per il...

L'obiettivo di questo esperimento è studiare l'auto-organizzazione dell'attività cerebrale sana in valanghe neuronali, il segno distintivo della dinamica in stato critico nella corteccia. Questo risultato si ottiene combinando una sezione coronale stratificata della corteccia con una sezione del mesencefalo, che fornisce importanti input dopaminergici, cruciali nello sviluppo, alla corteccia. Come secondo passo, la coltura co-colturale di corteccia e mesencefalo viene sviluppata su un array multielettrico, che permette la stimolazione e la registrazione dell'attività neuronale in più punti all'interno della coltura.Successivamente, permettiamo alla coltura co-coltivata di appiattirsi, espandersi e attaccarsi alla superficie della MEA durante le prime una-due settimane in un incubatore appositamente progettato, che espone la coltura alternativamente all'aria normale e alla condizione di coltura. Si ottengono risultati fluidi che mostrano l'auto-organizzazione spontanea di raffiche di potenziali di campo locali spaziotemporali in valanghe neuronali. Tali risultati si basano su registrazioni effettuate mediante MEA e su un'analisi offline delle valanghe, che identifica la legge di potenza nelle dimensioni delle valanghe.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come le colture disassociate, è il suo aspetto di neuroscienza sistemica. Possiamo coltivare insieme molte regioni cerebrali e queste colture multiregionali stabiliscono un'organizzazione cerebrale corretta su larga scala, come i livelli corticali e i sistemi di proiezione. Le applicazioni di questa tecnica vanno oltre lo studio delle avalanché di neuroni.Ad esempio, possiamo studiare lo stimolo in risposta a livello di rete in condizioni in vitro rigorosamente controllate. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché l'applicazione corretta della miscela di trombina plasmatica e il posizionamento del tessuto sull'MEA sono operazioni difficili da apprendere. Questi passaggi richiedono un'accurata tempistica, il giusto gradiente di temperatura e l'evitare di toccare direttamente la delicata superficie dell'MEA.Per preparare una camera di vetro sterile e sigillabile per le registrazioni, tagliare prima dei cilindri di vetro filettati con un cappuccio in plastica in teflon, approssimativamente a due millimetri dal fondo del filetto. Questi sono necessari per garantire una chiusura sicura e stagna della camera di coltura. Successivamente, pulire gli anelli di vetro risciacquandoli con acqua per tre volte, quindi facendoli bollire per cinque minuti in alcol etilico al 200 proof.Mettere da parte per far asciugare; è necessaria una soluzione di silicone per fissare gli anelli di vetro alla superficie della MEA. Utilizzare un kit di elastomero siliconico Cell Guard 180 4 e mescolare accuratamente 15 millilitri delle parti A e B. Successivamente, lasciare riposare per 15 minuti per eliminare le bolle d'aria.Separare la soluzione in un millilitro di Eloqua e conservarla a meno 20 gradi Celsius per un uso futuro. Incollare ora un anello di vetro all'MEA prelevando un millilitro di silicone a 23 gradi Celsius con una siringa munita di ago sottile e applicandolo sulla superficie tagliata non lucidata dell'anello di vetro. Quindi centrare l'anello di vetro sull'MEA e applicare uno strato aggiuntivo di silicone attorno all'esterno dell'anello per sigillare meglio.Lasciare indurire per uno o due ore a circa 60 gradi Celsius su una piastra riscaldante. Successivamente, sterilizzare la camera MEA e i tappi della camera in cappa a flusso laminare risciacquandoli tre volte con acqua deionizzata e poi tre volte con alcol al 70% per l'ultimo risciacquo. Lasciare la camera in ammollo nell'alcol per 10 minuti.Successivamente, esporre l'interno della camera e del coperchio alla luce UV per 10 minuti. Autoclavare a 120 gradi Celsius per 45 minuti. Una volta sterilizzati, lasciare asciugare.Ora ricoprire la superficie della MEA all'interno della camera di coltura con poli-D-lisina. Le nuove MEA utilizzate in questo esperimento sono piuttosto lipofiliche, quindi procedere al rivestimento mediante gocce ripetute. Aspirare la soluzione dalla griglia degli elettrodi.Applicare il cappuccio per sigillare la camera MEA durante la conservazione e per utilizzi futuri. Questa procedura consente di ottenere sezioni della corteccia e della VTA per circa 12 colture co-coltivate ed deve essere eseguita all'interno di un'area a flusso laminare in condizioni sterili, utilizzando animali sani di uno o due giorni dopo la nascita; il tempo totale per il prelievo del tessuto non deve superare un'ora. Dopo la decapitazione, iniziare il prelievo del cervello effettuando due incisioni laterali con le forbici per rimuovere la cute dal cuoio capelluto.Rimuovere quindi aprire il cranio utilizzando forbici da occhio fini, effettuando un taglio sagittale mediano e un taglio coronale alla giunzione tra corteccia e cervelletto. Ribaltare all'indietro tutte e quattro le lembi ossee per esporre il cervello. Successivamente, con una spatola affilata, tagliare in senso frontale attraverso il bulbo olfattivo.Quindi avanzare la spatola a quarti sotto il cervello. Sollevare delicatamente il cervello dal cranio e farlo scivolare nella soluzione di fissazione fredda per un rapido raffreddamento e un immagazzinamento temporaneo.Ripetere la procedura sopra descritta per altri due cervelli. Per ottenere il tessuto della VTA, trasferire i cervelli su una piastra di Petri sterile e asciutta. Utilizzando una spatola piccola, rimuovere il liquido in eccesso facendo scivolare delicatamente ciascun cervello lateralmente di circa un centimetro.Quindi, utilizzare un rasoio per rimuovere il bulbo allungato effettuando un taglio verticale coronale a livello del cervelletto. Ora incollare un blocco di agar su un disco di montaggio per stabilizzare meccanicamente i cervelli durante la procedura di taglio. Successivamente, posizionare una sottile linea di colla istantanea, alcuni millimetri davanti al blocco di agar sul disco, facendo attenzione a non far toccare la colla all'agar, utilizzando una piccola spatola.Trasferire e montare ciascun emisfero cerebrale con il polo frontale rivolto verso il basso. Assicurarsi che i poli frontali siano incollati al disco di montaggio e che i lati ventrali tocchino l'agar senza residui di colla. Questo garantisce una corretta stabilizzazione meccanica durante il taglio e facilita il sollevamento delle sezioni tagliate.Successivamente, immergere con attenzione e fissare il disco di montaggio con i cervelli montati in un vassoio vibram riempito con soluzione di gaze fredda. Quindi, utilizzando una lametta da rasoio accuratamente pulita, effettuare sezioni coronali dello mesencefalo spesse 400 micrometri alla massima frequenza di vibrazione e a una velocità di avanzamento relativamente bassa; raccogliere e trasferire le sezioni contenenti la VTA, mediante una pipetta per pasta invertita con bulbo a vuoto, in piatti di Petri da 35 per 10 millimetri riempiti con soluzione di gaze sterile e fredda destinata alle sezioni corticali. Ripetere i passaggi precedenti di sezionamento, ma eseguire un taglio verticale tra la corteccia e il cervelletto, quindi montare i quattro cervelli con il polo frontale rivolto verso l'alto.Prelevare circa tre sezioni coronali dello spessore di 350 micrometri a partire dal livello dello striato. Utilizzando ora un microbisturi realizzato con lame di rasoio spezzate, dissezionare al microscopio stereoscopico sezioni coronali larghe circa due millimetri di corteccia frontale e aree del mesencefalo contenenti la VTA. Raccogliere il tessuto separatamente in piccole capsule riempite con soluzione fisiologica fredda.Per iniziare il montaggio del tessuto nella camera MEA, posizionare innanzitutto la MEA a temperatura ambiente sotto un microscopio stereoscopico, mettendo a fuoco la matrice di elettrodi. Successivamente, centrare una goccia di 25 microlitri di plasma sulla matrice di elettrodi pulita, priva di polvere e sterile. Utilizzando una spatola piccola, inserire con attenzione una sezione di corteccia e di area tegmentale ventrale (VTA) all'interno della goccia di plasma.Ora posizionare la MEA su una piastra refrigerante e riacquisire il fuoco. Lasciare raffreddare per circa 15 secondi prima di aggiungere 25 microlitri di trombina nella goccia di plasma. Quindi, utilizzando la punta della pipetta contenente la trombina, distribuire con attenzione la miscela di plasma e trombina mediante piccoli movimenti circolari sulla MEA.Attenzione a non toccare direttamente l'array di elettrodi fragile. Successivamente, posizionare delicatamente la corteccia sull'array con il margine dorsale lungo la seconda fila di elettrodi dell'array. In questo modo, gli strati superficiali in via di sviluppo copriranno infine il resto dell'array.Quindi posizionare l'ATV adiacente al margine ventrale della sezione corticale. Ora chiudere e sigillare leggermente la camera MEA per mantenere un'alta umidità. Lasciare l'assemblaggio della coltura MEA a riposo per circa sei minuti all'interno della cappa a temperatura ambiente, in modo da permettere la coagulazione, la trombina plasmatica e la retrazione.Nel frattempo, ripetere la procedura per preparare altre tre colture. Successivamente, aggiungere con attenzione in piccole gocce 600 microlitri di mezzo di coltura nelle camere di coltura, utilizzando una siringa da un cc con un ago da 25 per cinque ottavi di pollice. Quindi chiudere ermeticamente la camera MEA e posizionare l'assemblato di coltura MEA sul vassoio oscillante all'interno dell'incubatrice.Dopo due giorni in vitro, aggiungere 10 microlitri di inibitore della mitosi. Successivamente, rinnovare il 60% del mezzo di coltura a quattro giorni in vitro e ogni quattro giorni successivi. Durante la crescita normale, la coltura si appiattirà notevolmente ed espanderà leggermente in direzione dorsale.A causa dello sviluppo di strati corticali superficiali, una coltura sana è identificata dal suo tessuto opaco di colore grigiastro in campo chiaro. Al contrario, vescicole brillanti e riflettenti, caratteristiche di cellule morte in degenerazione circa 10-12 giorni dopo la preparazione delle colture, indicano che queste sono pronte per la registrazione e la stimolazione. Per iniziare una sessione di registrazione, l'MEA viene trasferita dal vassoio di conservazione al supporto della testa di registrazione.Per registrare il potenziale di campo locale o LFP, utilizzare un filtro passa-banda da uno a 200 hertz. L'attività multiunità può essere studiata anche mediante un filtro passa-banda da 300 a 3000 hertz. L'attività spontanea sana tende a verificarsi in scariche di dimensioni e durata variabili.Per studiare la relazione tra attività del potenziale di campo locale (LFP) e attività delle unità, possiamo calcolare le medie di LFP sincronizzate con gli eventi di scarica. Per queste colture corticali, le deflessioni negative del LFP sono correlate alla generazione di potenziali d'azione nei neuroni, al fine di registrare l'attività evocata dallo stimolo. Innanzitutto, la forma d'onda temporale e l'ampiezza degli stimoli vengono definite mediante un software che controlla un generatore di stimoli.Un paradigma di stimolazione utile è lo shock singolo controllato in corrente, neutro in carica, con forma d'onda quadrata bipolare. Successivamente, si seleziona un elettrodo che verrà utilizzato per erogare gli stimoli. Le risposte LFP tipiche evocate dallo stimolo risultano simili ai burst di attività spontanea.Il circuito di blanking disconnette gli amplificatori durante la stimolazione per ridurre gli artefatti del segnale e prevenire la saturazione dell'amplificatore. L'elettrodo di stimolazione richiede diversi secondi per ripristinarsi dopo la stimolazione e pertanto non può essere utilizzato per registrare l'attività di risposta. Sulla MEA l'attività tende a manifestarsi in aggregati spaziotemporali, con attività in un elettrodo spesso accompagnata da attività in altri siti.Nello stesso tempo, qui vengono mostrate le forme d'onda tipiche del potenziale di campo locale (LFP) durante questi periodi di attività, sovrapponendo tre cluster che si verificano a diversi secondi di distanza l'uno dall'altro per ciascun cluster. Deflessioni negative del LFP possono essere osservate in diversi elettrodi all'interno di una finestra di un secondo quando si estraggono i picchi di NLFP che superano una soglia di più deviazioni standard negative; l'attività sotto forma di tempi di picco di NLFP è convenientemente visualizzata in un Rasta in cui colonne di punti rappresentano NPS quasi coincidenti in diversi elettrodi. L'organizzazione spaziotemporale di questa attività è piuttosto complessa.Colonne che appaiono più o meno omogenee a bassa risoluzione temporale risultano composte da cluster distinti ad alta risoluzione temporale e così via. L'emergere di cluster spaziali, GEOTEMPORALI e di potenziali di campo locali (LFP) è altamente organizzato nelle reti corticali. Più specificamente, l'organizzazione è invariante rispetto alla scala negli avalanche neuronali.Questo viene dimostrato calcolando la probabilità delle dimensioni degli aggregati a una data risoluzione temporale, Delta T. In questo caso, gli aggregati sono composti da NL FPS che si verificano nella stessa finestra temporale o in finestre consecutive; quando la dimensione di un tale aggregato viene espressa come numero totale di NFPS per aggregato o come ampiezze integrate di NLFP per aggregato, la distribuzione delle dimensioni degli aggregati rivela una legge di potenza con un esponente prossimo a meno 1,5. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come dissezionare con attenzione il tessuto cerebrale e coltivare preparati su array multiellettrici al fine di studiare l'auto-organizzazione dell'attività neuronale.Questi metodi sono stati utilizzati anche per studiare la relazione tra attività spontanea e attività evocata da stimolo nelle reti corticali.

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