Multi-array di elettrodi Recordings Valanghe neuronali in Culture organotipica

L'obiettivo di questo esperimento è studiare l'auto-organizzazione dell'attività cerebrale sana in valanghe neuronali, il segno distintivo delle dinamiche di stato critico nella corteccia. Ciò si ottiene combinando una fetta di corteccia stratificata coronale insieme a una fetta di mesencefalo, che fornisce input dopaminergici importanti per lo sviluppo alla corteccia. Come seconda fase, la co-coltura del mesencefalo Cortex viene coltivata su un array multi-elettrodo, che consente la stimolazione multi-sito e la registrazione delle attività neuronali nella coltura.

Successivamente, lasciamo che la co-coltura si appiattisca, si espanda e si attacchi alla superficie MEA durante le prime una o due settimane in un incubatore progettato su misura, che fa circolare la coltura attraverso l'esposizione all'aria normale e alla coltura. Si ottengono risultati fluidi che mostrano l'auto-organizzazione spontanea del potenziale di campo locale spazio-temporale che esplode in valanghe neuronali. Sulla base delle registrazioni MEA e dell'analisi delle valanghe offline che identifica la legge di potenza in valanghe.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come le colture dissociate, è il suo aspetto sistemico e neuroscientifico. Possiamo co-coltivare molte regioni del cervello insieme e queste culture multi-regione stabiliscono un'organizzazione cerebrale che è corretta su larga scala come gli strati corticali e i sistemi di proiezione. Le applicazioni di questa tecnica vanno oltre il semplice studio delle valanghe di neuroni.

Ad esempio, possiamo studiare lo stimolo in risposta a livello di rete in condizioni di vitro controllate con precisione. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto la corretta applicazione della miscela di trombina plasmatica e il posizionamento del tessuto sul MEA sono difficili da imparare. Questi passaggi richiedono un tempismo adeguato, il giusto gradiente di temperatura ed evitare di toccare direttamente la delicata superficie MEA.

Per preparare una camera di vetro sterile e sigillabile per le registrazioni, tagliare prima dei cilindri di vetro filettati con un tappo di plastica in teflon, a circa due millimetri dal fondo della filettatura. Questi sono necessari per una chiusura sicura e ermetica della camera di coltura. Pulite quindi gli anelli di vetro sciacquandoli tre volte con acqua, quindi facendo bollire per cinque minuti in alcool etilico a 200 gradi.

Metterli da parte per asciugarli, è necessaria una soluzione di silicone per fissare gli anelli di vetro alla superficie MEA. Utilizzare un kit di elastomeri siliconici cell guard 180 4 e miscelare accuratamente 15 millilitri di parti A e B. Poi sediamoci per 15 minuti per eliminare le bolle d'aria.

Separare la soluzione in un millilitro di Eloqua e conservarla a meno 20 gradi Celsius per un uso futuro. Ora incolla un anello di vetro al MEA prendendo un millilitro di silicio a 23 gradi Celsius in una siringa con un ago di piccolo calibro e applicandolo sulla superficie tagliata non lucidata dell'anello di vetro. Quindi centrare l'anello di vetro sul MEA e applicare uno strato aggiuntivo di silicone attorno all'esterno dell'anello per una tenuta più forte.

Lasciate indurire per una o due ore a circa 60 gradi Celsius su una piastra calda. Successivamente, sterilizzare la camera MEA e i tappi della camera sotto la cappa di flusso della lamina risciacquando tre volte in acqua deionizzata e tre volte con alcol al 70% per l'ultimo risciacquo. Lasciare riposare la camera per 10 minuti nell'alcol.

Successivamente esponendo la camera e l'interno del tappo alla luce UV per 10 minuti. Autoclavare a 120 gradi Celsius per 45 minuti. Una volta sterilizzati, lasciarli asciugare.

Ora rivestire la superficie MEA all'interno della camera di coltura con poli-D lisina. I nuovi meas utilizzati in questo esperimento sono piuttosto lipofili, quindi rivestiti da goccioline ripetute. Aspirazione della soluzione dalla griglia degli elettrodi.

Fissare il tappo per sigillare la camera MEA per la conservazione e l'uso futuro. Questa procedura produce sezioni di corteccia e VTA per circa 12 co-colture e dovrebbe essere eseguita all'interno di una cappa a flusso di lamina in condizioni sterili utilizzando animali sani dopo la nascita di uno o due giorni, il tempo totale per la raccolta dei tessuti dovrebbe essere inferiore a un'ora. Dopo la decapitazione, iniziare la rimozione del cervello eseguendo prima due tagli laterali a forbice per rimuovere la pelle dal cuoio capelluto.

Rimuovi, quindi apri il cranio usando le forbici per gli occhi, facendo un taglio sagittale sulla linea mediana su un taglio coronale alla giunzione della corteccia del cervelletto. Capovolgi tutti e quattro questi lembi del cranio per esporre il cervello. Quindi con una spatola affilata, tagliare frontalmente attraverso il bulbo olfattivo.

Quindi fai avanzare la spatola trimestralmente sotto il cervello. Solleva delicatamente il cervello dal cranio e lascialo scivolare in uno sguardo freddo. Soluzione per il raffreddamento rapido e lo stoccaggio temporaneo.

Ripeti la procedura di cui sopra per altri due cervelli. Per ottenere il tessuto VTA, trasferire il cervello su una capsula di Petri sterile e asciutta. Usando una piccola spatola, rimuovere il liquido in eccesso facendo scorrere delicatamente ciascun cervello lateralmente di circa un centimetro.

Quindi utilizzare una lama di rasoio per rimuovere il tronco encefalico praticando un taglio verticale coronale a livello del cervelletto. Ora incolla un blocco di agar su un disco di montaggio per la stabilizzazione meccanica del cervello durante la procedura di affettatura. Posiziona quindi una linea sottile di super colla, qualche millimetro davanti al blocco di agar sul disco, ma evita che la colla tocchi l'agar usando una piccola spatola.

Trasferisci e monta ogni polo frontale del cervello verso il basso. Assicurarsi che i pali frontali siano incollati al disco di montaggio e che i lati ventrali tocchino l'agar senza residui di colla. Ciò garantisce una corretta stabilizzazione meccanica durante il taglio e un facile sollevamento delle fette tagliate.

Quindi, immergere con cura e fissare il disco di montaggio con i cervelli montati in un vassoio vibram riempito con una soluzione di sguardo raffreddata. Quindi, con un taglio a lama di rasoio accuratamente pulito, sezioni coronali del mesencefalo spesse 400 micrometri alla massima frequenza di vibrazione e velocità di avanzamento relativamente bassa utilizzando una pipetta per pasta invertita con bulbo di aspirazione, raccogliere e trasferire le fette contenenti il VTA in piastre di Petri da 35 x 10 millimetri riempite con soluzione sterile di gaze refrigerato per sezioni corticali. Ripeti i passaggi precedenti per affettare, ma applica un taglio verticale tra la corteccia e il cervelletto e monta i quattro cervelli con il polo frontale rivolto verso l'alto.

Raccogliere circa tre fette coronali di 350 micrometri di spessore partendo dal livello dello striato. Ora, utilizzando un micro coltello fatto di lame di rasoio rotte, sezionare sezioni coronali larghe circa due millimetri di corteccia frontale e aree del mesencefalo contenenti il VTA sotto uno stereomicroscopio. Raccogliere la sezione di tessuto separatamente in piccoli piatti riempiti con una soluzione fredda per lo sguardo.

Per iniziare a montare il tessuto nella prima posizione della camera MEA, il MEA a temperatura ambiente sotto uno stereomicroscopio con l'array di elettrodi a fuoco. Quindi centrare una goccia di plasma da 25 microlitri sulla matrice di array di elettrodi pulita, priva di polvere e sterile. Usando una piccola spatola, far scorrere con cautela una sezione di corteccia e VTA nella gocciolina di plasma.

Ora posiziona il MEA su una piastra di raffreddamento e rifocalizza la vista. Lasciar raffreddare per circa 15 secondi prima di aggiungere 25 microlitri di trombina nella gocciolina di plasma. Quindi, utilizzando la punta della pipetta di trombina, distribuire con cura la miscela di trombina plasmatica con piccoli movimenti circolari attraverso il MEA.

Fare attenzione a non toccare direttamente l'array di elettrodi fragili. Quindi, posiziona delicatamente la corteccia sull'array con il bordo dorsale lungo la seconda fila di elettrodi dell'array. In questo modo, gli strati superficiali in via di sviluppo finiranno per coprire il resto dell'array.

Quindi posizionare il VTA adiacente al bordo ventrale della sezione della corteccia. Ora tappate e chiudete liberamente la camera MEA per trattenere l'umidità elevata. Lasciare riposare il gruppo di coltura MEA per circa sei minuti all'interno della cappa a temperatura ambiente per consentire la trombina plasmatica, la coagulazione, l'euforia.

Nel frattempo, ripeti la procedura per preparare altre tre colture. Successivamente, in piccole goccioline, aggiungere con cura 600 microlitri di terreno di coltura alle camere di coltura, utilizzando una siringa da un cc con un ago da 25 per cinque calibro da ottavo. Quindi chiudere ermeticamente la camera MEA e posizionare il gruppo di coltura MEA sul vassoio oscillante all'interno dell'incubatore.

Dopo due giorni, in vitro, aggiungere 10 microlitri di inibitore della mitosi. Quindi rinfrescare i terreni di coltura del 60% per quattro giorni in vitro e successivamente ogni quattro giorni. Durante la crescita normale, la coltura si appiattirà sostanzialmente e si espanderà leggermente dorsalmente.

A causa dello sviluppo di strati corticali superficiali, una coltura sana è identificata dal suo tessuto grigiastro opaco in campo chiaro. Al contrario, le vescicole riflettenti luminose, una caratteristica delle cellule degenerative morte circa 10-12 giorni dopo la preparazione delle colture, sono pronte per la registrazione e la stimolazione. Per iniziare una sessione di registrazione, il MEA viene trasferito dal vassoio di stoccaggio allo stadio della testina di registrazione.

Per registrare il potenziale di campo locale o LFP, utilizzare un filtro passa-banda da uno a 200 hertz. L'attività multiunità può anche essere studiata utilizzando un filtro passa banda da 300 a 3000 hertz. L'attività spontanea sana tende a verificarsi in raffiche di diverse dimensioni e durata.

Per studiare la relazione tra LFP e attività unitaria, possiamo calcolare le medie di LFP innescate da spike. Per queste colture di corteccia, le deflessioni negative della LFP sono correlate con lo spiking neuronale per registrare l'attività evocata dallo stimolo. In primo luogo, la forma d'onda temporale e l'ampiezza degli stimoli vengono specificate con un software che controlla un generatore di stimoli.

Un utile paradigma di stimolazione è il singolo shock neutro a carica controllata in corrente con forma d'onda quadra bipolare. Successivamente, viene selezionato un elettrodo, che verrà utilizzato per erogare gli stimoli. Le tipiche risposte LFP evocate dallo stimolo sembrano simili a esplosioni di attività spontanea.

Il circuito di blanking scollega gli amplificatori durante la stimolazione per ridurre gli artefatti dello stimolo e prevenire la saturazione dell'amplificatore. L'elettrodo di stimolazione richiede diversi secondi per riprendersi dalla stimolazione e quindi non può essere utilizzato per registrare l'attività di risposta. Sul MEA tende ad emergere in cluster spaziotemporali con attività in un elettrodo, spesso accompagnata da attività in altri siti.

Allo stesso tempo, le forme d'onda tipiche dell'LFP durante tali periodi di attività sono mostrate qui sovratracciando tre cluster che si verificano a diversi secondi di distanza per ogni cluster. Le deflessioni negative di LFP possono essere osservate su diversi elettrodi in una finestra di un secondo quando si estraggono picchi NLFP che superano una soglia di sd negativo multiplo, l'attività sotto forma di tempi di picco NLFP è convenientemente visualizzata in un Rasta in cui colonne di punti rappresentano NPS quasi coincidenti a vari elettrodi. L'organizzazione spazio-temporale di questa attività è piuttosto complessa.

Le colonne che appaiono più o meno omogenee a bassa risoluzione temporale sono composte da cluster separati a risoluzione temporale più alta e così via. L'emergere di cluster spaziali, geotemporali e LFP è altamente organizzato in reti corticali. Più specificamente, l'organizzazione è in scala variabile per le valanghe neuronali.

Ciò è dimostrato calcolando la probabilità delle dimensioni dei cluster a una data risoluzione temporale. Qui i cluster sono composti da NL FPS che si verificano nello stesso intervallo di tempo o in intervalli di tempo successivi, quando la dimensione di tale cluster è espressa in numero totale di NFPS per cluster o in ampiezze NLFP integrate per cluster, le distribuzioni delle dimensioni del cluster rivelano una legge di potenza con un esponente vicino a meno 1,5. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sezionare attentamente il tessuto cerebrale e far crescere colture su array di più elettrodi per studiare l'auto-organizzazione dell'attività neuronale.

Questi metodi sono stati utilizzati anche per studiare la relazione tra attività spontanea e attività evocata dallo stimolo nelle reti corticali.