Studiare l'espressione del gene regolamentata mediante ciclo cellulare da due protocolli complementari di sincronizzazione delle cellule

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di fornire un contesto per l'analisi dell'espressione genica in un modo specifico per il ciclo cellulare. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del cancro relative agli eventi trascrizionali dipendenti dal ciclo cellulare che sono alla base della trasformazione maligna e del trattamento antitumorale. Il vantaggio principale di questo protocollo è che stabilisce con precisione modelli di espressione genica specifici per la fase del ciclo cellulare sia nelle condizioni numero due che dopo l'esposizione alla chemioterapia.

Per questo esperimento vengono utilizzate cellule U2OS che dovrebbero essere seminate in piastre da 100 millimetri la sera intorno alle sette di sera, in modo che i passaggi successivi possano essere eseguiti durante l'orario di lavoro. Lasciare che le cellule si attacchino incubando le piastre a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata con il 5% di CO2 per 24 ore.

Il giorno seguente esamina le celle per confermare che sono al 50% di confluenza. Per il blocco di timidina, aggiungere 100 microlitri di un brodo di timidina da 200 millimolari appena preparato a ciascuna piastra di coltura da 100 millimetri. Incubare le cellule con timidina a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata con il 5% di CO2 per 20 ore.

Il giorno seguente, verso le tre del pomeriggio, rilasciare le cellule dal blocco di timidina rimuovendo il terreno di crescita contenente timidina. Lavare le celle due volte con 1X PBS preriscaldato.

E poi aggiungi 10 millilitri di terreno completo a ogni piatto da 100 millimetri. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per cinque ore. Per l'arresto delle cellule mitotiche aggiungere nocodazolo a una concentrazione finale di 50 nanogrammi per millilitro.

Incubare le cellule con nocodazolo per non più di 10-11 ore. La mattina seguente, tra le sei e le sette del mattino, controlla le cellule al microscopio per confermare che sono effettivamente bloccate in G2-M, indicato dal loro aspetto arrotondato.

Staccare le cellule mitotiche agitando ciascuna piastra e pipettando delicatamente il nocodazolo contenente terreno di crescita con le cellule staccate da ciascuna piastra da 100 millimetri. Combinare le cellule mitotiche di tutte le piastre in una provetta sterile da 50 millilitri. Centrifugare 300 volte g per cinque minuti a quattro gradi centigradi.

Lavare le celle due volte aggiungendo 1X PBS freddo, seguito dalla centrifugazione. Dopo aver rimosso il PBS dal secondo lavaggio, risospendere le cellule mitotiche in un terreno di coltura completo. Risparmia due millilitri per l'estrazione dell'RNA e due millilitri per l'analisi FACS per il punto temporale dell'ora zero.

Ri-piastrare le celle mitotiche rimanenti per i punti temporali successivi in piastre a sei pozzetti. Per iniziare questa procedura, seminare 0,25 volte 10 nella sesta cella U2OS per pozzetto in piastre a sei pozzetti. Sul coperchio di ogni piastra a sei pozzetti scrivere la condizione sperimentale per ogni pozzetto.

Ad esempio, non trattato o trattato con diverse concentrazioni di farmaco e punti temporali. Lasciare che le cellule si attacchino incubando le piastre a sei pozzetti durante la notte. La mattina seguente esamina le cellule per confermare che sono al 50% di confluenza.

Rimuovere l'intero terreno dai pozzetti e aggiungere due millilitri di terreno DMEM-glutammina preriscaldato e privo di FBS per pozzetto. Incubare le cellule per altre 24 ore. Per arrestare le cellule con idrossiurea, rimuovere il terreno dai pozzetti e sostituirlo con un'idrossiurea a quattro micromolari appena preparata contenente un terreno completo.

Incubare le cellule in terreno contenente idrossiurea per 24 ore. Prima di rilasciare le cellule dall'arresto mediato dall'idrossiurea, controllare le cellule per confermare che siano state arrestate. Rimuovere il terreno contenente idrossiurea dai pozzetti e risciacquare i pozzetti due volte con 1X PBS preriscaldato.

Dopo aver rimosso il PBS dal secondo lavaggio, aggiungere due millilitri di terreno completo per pozzetto. Conservare le piastre nell'incubatore fino alla raccolta del campione. I campioni di entrambi i protocolli di sincronizzazione vengono raccolti allo stesso modo per l'analisi FACS e per l'estrazione dell'RNA.

Per l'analisi FACS, sciacquare ciascun pozzetto con due millilitri di PBS 1X preriscaldato, quindi aggiungere 0,3 millilitri di soluzione di tripsina-EDTA preriscaldata per staccare le cellule. Dopo cinque minuti, inattivare la tripsina-EDTA aggiungendo un millilitro di terreno completo. Raccogliere ogni campione in una provetta separata da 15 millilitri.

Centrifugare le celle a 300 volte G a temperatura ambiente per cinque minuti. Scartare il surnatante, lavare con 1X PBS e centrifugare di nuovo. Rimuovere il PBS e conservare il pellet cellulare.

Per fissare le cellule, risospendere ogni pellet cellulare in un millilitro di etanolo refrigerato al 70% agitandolo delicatamente. Porre le cellule sul ghiaccio per circa 15 minuti prima della colorazione con ioduro di propidio e dell'analisi FACS. Per l'estrazione dell'RNA, rimuovere il terreno e sciacquare ogni pozzetto con due millilitri di PBS 1X preriscaldato.

Portare la piastra in un armadio di sicurezza e aggiungere un millilitro di reagente di isolamento dell'RNA adatto per pozzetto. Pipette su e giù per pipettare e lisare le cellule, quindi trasferire ciascun lisato cellulare in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Incubare a temperatura ambiente per cinque minuti.

Avviare la procedura di estrazione dell'RNA recuperando dal congelatore le provette per microcentrifuga con campioni in reagente di isolamento dell'RNA e scongelandole a temperatura ambiente all'interno di una cabina di sicurezza per sostanze chimiche. Aggiungere 400 microlitri di cloroformio a ciascun campione e agitare energicamente senza vorticare fino a completa miscelazione. Incubare i campioni a temperatura ambiente per cinque minuti.

Centrifugare le provette per 15 minuti in una microcentrifuga da banco. Trasferire la fase acquosa di ciascun campione in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri. Aggiungere lentamente un volume di etanolo al 100%, goccia dopo goccia, alla fase acquosa durante la miscelazione.

Non centrifugare. Trasferire fino a 700 microlitri di ciascun campione, compreso l'eventuale precipitato che potrebbe essersi formato in una colonna di rotazione, in una provetta di raccolta da due millilitri fornita da un kit di mini-preparazione dell'RNA commerciale, e chiudere il coperchio. Centrifugare per 15 secondi.

Scartare il flusso. Se si parte da più di 700 microlitri per campione, trasferire il campione rimanente nella colonna di centrifugazione e centrifugare nuovamente. Dopo aver lavato l'RNA secondo le istruzioni del produttore, eluire ogni campione pipettando da 30 a 40 microlitri di acqua priva di nucleasi nella colonna di centrifugazione e centrifugando a temperatura ambiente per un minuto.

Determinare la concentrazione e la purezza dell'RNA dei campioni mediante misure di assorbanza. Conservare i campioni di RNA a meno 80 gradi Celsius fino all'uso per l'analisi dell'espressione genica. Il trattamento con il protocollo timidina-nocodazolo arresta le cellule U2OS in ingresso nella fase m e fornisce una popolazione cellulare che progredisce in modo sincrono attraverso la fase G1 e nella fase S, come dimostrato dall'analisi della citometria a flusso.

Il trattamento con il protocollo Hydroxyurea arresta le cellule al confine G1/S. Al momento del rilascio, le cellule passano in modo sincrono attraverso le fasi S e G2. Il protocollo Timidina-Nocodazolo è il più adatto per analizzare i profili di mRNA di geni con picco di espressione durante la fase G1.

Come illustrato per l'espressione E2F1. Al contrario, il protocollo Hydroxyurea funziona meglio per l'analisi di geni con espressione preferenziale in S o G2, come illustrato per l'espressione di E2F7. Il ciclo cellulare è tipicamente perturbato da farmaci antitumorali, come dimostrato è un arresto permanente della fase G2 imposto dalla mitomicina C nelle cellule sincronizzate con idrossiurea.

La sincronizzazione cellulare aiuta a discriminare i geni che rispondono all'agente antitumorale da quelli che sono esclusivamente influenzati dalle perturbazioni del ciclo cellulare imposte dall'agente, ad esempio, una riduzione dei livelli di mRNA E2F1 dopo il trattamento con mitomicina C è probabilmente un effetto indiretto del farmaco sulla dinamica del ciclo cellulare. Al contrario, il picco di espressione dell'mRNA di p21-Cip1 dopo il trattamento con mitomicina C è direttamente il risultato di un programma trascrizionale innescato da questo farmaco. Seguendo questa procedura è possibile eseguire analisi trascrittomiche e proteomiche dell'intero genoma, al fine di svelare i cambiamenti globali dell'espressione genica che interessano specifiche fasi del ciclo cellulare.

O nelle condizioni numero due o in trattamento antitumorale. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione delle procedure necessarie per eseguire l'analisi dell'espressione genica in colture cellulari sincronizzate. Non dimenticare che lavorare con i reagenti di isolamento dello ioduro di propidio o dell'RNA può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come guanti e armadietto di sicurezza per le sostanze chimiche.