Name: Combinazione di sincronizzazione cellulare mitotica e microscopia confocale ad alta risoluzione per studiare il ruolo delle proteine del ciclo cellulare multifunzione durante la mitosi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Scopri la sincronizzazione cellulare con timidina doppia e microscopia confocale ad alta risoluzione per studiare le proteine multifunzione del ciclo cellulare in cellule HeLa. Questo metodo permette di analizzare i ruoli mitotici mantenendo il comportamento fisiologico normale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Siamo grati alla dottoressa Kozo Tanaka dell'Università di Tohoku, Giappone per la condivisione di cellule HeLa che esprimono stabilmente mCherry-istone H2B e GFP-α-tubulina. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione NCI in DV (R00CA178188) e dai fondi di Start-up presso la Northwestern University.

1. doppio blocco di timidina e rilascio: preparazioni di reagente
<ol><li>Fare 500 mL che Dulbecco per volta medium medium (DMEM) Eagle supplementato con 10% FBS, penicillina e streptomicina.</li>
	<li>Fare magazzino di 100mm di timidina in acqua sterile e conservare in aliquote a-80 ° C.</li>
</ol>2. il protocollo per l'Imaging cellulare fisso di progressione mitotica (Figura 1A)
<ol><li>Il giorno 1, seme ~ 2 x 105 le cellule HeLa nei pozzetti di una piastra a 6 pozzetti con un vetrino coprioggetto (sterilizzato con etanolo al 70% e l'irradiazione UV) e 2 mL di terreno DMEM. Crescere le cellule in un incubatore per 24 h a 37 ° C e 5% CO2.</li>
	<li>1 blocco di timidinast : il giorno 2, miscelare accuratamente il volume richiesto di timidina nei media DMEM fresco (100 mM stock, 2mm concentrazione finale).</li>
	<li>Aggiungere 2 mL di timidina contenente media per le cellule in ogni pozzetto del pozzo 6-piastra ed incubare per 18 h.</li>
	<li>Il giorno 3, il mezzo di aspirare e lavare le cellule due volte con 2 mL di PBS 1x 1 e una volta con DMEM preriscaldati fresco; crescere le cellule in medium DMEM preriscaldati fresco per 9 h per rilasciare cellule dal blocco.</li>
	<li>2nd timidina blocco: nuovamente aggiungere 2 mL di timidina contenente media (concentrazione finale di 2 mM) per le cellule in ciascun pozzetto della piastra 6 pozzetti.</li>
	<li>Incubare per un altro 18 h.</li>
	<li>Il giorno 4, aspirare il mezzo e lavare le cellule due volte con 2 mL di PBS 1x 1 e una volta con DMEM preriscaldati fresco.</li>
	<li>SiRNAs diluito (controllo e Cdt1) e reagente di transfezione in mezzo libera crescita siero separatamente per 10 min. mescolare insieme e incubare per 20 minuti a TA. La concentrazione finale di siRNA utilizzato in ogni transfezione era di 100 nM. Aggiungere la miscela di reazione per le cellule che sono state lavate fuori della timidina.</li>
	<li>Incubare le cellule a 37 ° C per 9-10 h rilasciare da bloccare e fissare le cellule su vetrini coprioggetto con 4% PFA per 20 minuti a TA. Attenzione: PFA è tossico, indossare una protezione appropriata.</li>
	<li>
Immunostain cellule, dopo permeabilizing con detergente 0.5% (v/v) per 10 min a RT e lavare le cellule due volte con PBS 1X per 5 minuti ciascuno.
	<ol>
<li>Bloccare le cellule con BSA 1% (p/v) in 1X PBS per 1h a RT seguita da trattando le cellule con 50 µ l di anticorpi primari (anticorpo anti-α-tubulina, diluito 1:1, 000, anticorpo di coniglio anti-Zwint1 diluito a 1: 400 e mouse anti-fosfo-ɣ H2AX diluito a 1: 300) in 1% (p/v) BSA in PBS 1X per 1 h a 37 oC.</li>
		<li>Dopo aver lavato le cellule con 1x PBS tre volte, trattare le cellule con 50 µ l di anticorpi secondari per ogni vetro di copertura (Alexa 488 e rodamina rosso alle diluizioni 1: 250 a 1% (p/v) BSA in 1X PBS) per 1 h a TA.</li>
		<li>Dopo aver lavato le cellule con PBS 1X due volte per 5 minuti ciascuno, trattare le cellule con DAPI (0.1 µ g / mL in PBS 1X) per 5 minuti a TA.</li>
		<li>Dopo aver lavato le cellule con PBS 1X due volte per 5 minuti ciascuno, posizionare il vetrino coprioggetto rivolto verso le cellule per il supporto di montaggio appropriato su un vetrino trasparente al microscopio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Immagine delle celle per le proteine immunostained con 60 X o 100 obiettivo a immersione in olio X 1.4 NA piano-apocromatico DIC montate su un microscopio confocale invertito ad alta risoluzione dotato di una fotocamera appropriato come necessario per la qualità delle immagini necessarie.</li>
	<li>Acquisire immagini a temperatura ambiente come z-pile di spessore di 0,2 µm utilizzando il software appropriato per il microscopio.</li>
</ol>3. protocollo per Live Cell Imaging della progressione mitotica (Figura 3A)
<ol><li>Il giorno 1, circa 0,5-1 x 105 cellule HeLa che esprimono stabilmente mCherry-H2B e GFP-α-tubulina (leggermente variabile in base al tipo di cellula e le proteine che essi esprimono) in piatti di fondo di vetro 35mm con 1,5 mL di terreno DMEM di semi e farli crescere in un umidificata incubatrice per 24 h a 37 oC e 5% CO2.</li>
	<li>1 blocco di timidinast : il giorno 2, aggiungere 1,5 mL di timidina contenente media per le cellule nel piatto (timidina 100mm, concentrazione finale di 2 mM,).</li>
	<li>Incubare per 18 h.</li>
	<li>Il giorno 3, aspirare il supporto contenente timidina e lavare le cellule tre volte, due volte con 2 mL di PBS 1X e una volta con DMEM preriscaldati fresco.</li>
	<li>SiRNAs diluito (controllo e Hec1) e reagente di transfezione con il mezzo di crescita gratis siero separatamente per 10 minuti mescolare insieme e incubare per 20 minuti a TA. La concentrazione finale di siRNA utilizzato in ogni transfezione era di 100 nM. Aggiungere la miscela di reazione per le cellule che sono state lavate fuori della timidina.</li>
	<li>Crescere le cellule in 1,5 mL di terreno DMEM preriscaldato nuovo per 8 h rilasciare cellule dal blocco.</li>
	<li>2nd timidina blocco: aggiungere 1,5 mL di timidina contenente media (concentrazione finale di 2 mM) per le cellule nel piatto.</li>
	<li>Incubare per un altro 18 h.</li>
	<li>Il giorno 4, aspirare il mezzo e lavare le cellule tre volte, due volte con 2 mL di PBS 1X e una volta con DMEM preriscaldati fresco. Poi crescere le cellule in Leibovitz preriscaldati fresco di media (L-15) completati con 10% FBS e 20 mM HEPES a pH 7.0 per 8 h rilasciare cellule dal blocco.</li>
	<li>Mettere il piatto nella camera di controllo di temperatura impostata nel microscopio confocale ad alta risoluzione che ha già acceso per almeno 30 minuti prima di iniziare l'imaging per stabilizzare le temperature sul palco e sperimentale.</li>
	<li>Fuoco nel campo luminoso con obiettivo 60x fino a quando le cellule sono visibili, quindi manualmente setacciare sul palco nella regione di scelta.</li>
	<li>Impostare la luce e laser potenza/esposizione, parametri di acquisizione immagine e la durata dell'esperimento utilizzando il software di acquisizione di immagine microscopio di scelta. Utilizzare filtri per GFP (eccitazione 488; 385 nm emissione) e mCherry (561 nm eccitazione e 385 nm emissione) per acquisire immagini.</li>
	<li>Eseguire l'esperimento di time-lapse acquistando separatamente pulsata luce trasmessa e fluorescenza immagini ogni 10 min per un periodo fino a 16 ore.</li>
	<li>Acquisire immagini come dodici 1.0 µm-separati z-aerei a 9 h dopo il rilascio dal blocco della timidina doppia utilizzando il software appropriato al microscopio.</li>
	<li>Analizzare le immagini monitoraggio delle singole celle per progressione mitotica e infine montare il film corrispondente con il software di fonte Fiji/ImageJ.</li>
</ol>

<ol><li>Lajtha, L. G., Oliver, R., Berry, R., Noyes, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+radiation+effect+on+the+process+of+synthesis+of+deoxyribonucleic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of radiation effect on the process of synthesis of deoxyribonucleic acid.</a> Nature. 182 (4652), 1788-1790 (1958).</li>
<li>Puck, T. T., Steffen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+Cycle+Analysis+of+Mammalian+Cells.+I.+A+Method+for+Localizing+Metabolic+Events+within+the+Life+Cycle%2C+and+Its+Application+to+the+Action+of+Colcemide+and+Sublethal+Doses+of+X-Irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Life Cycle Analysis of Mammalian Cells. I. A Method for Localizing Metabolic Events within the Life Cycle, and Its Application to the Action of Colcemide and Sublethal Doses of X-Irradiation.</a> Biophys. J. 3, 379-392 (1963).</li>
<li>Santaguida, S., Musacchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+life+and+miracles+of+kinetochores%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The life and miracles of kinetochores.</a> EMBO J. 28 (17), 2511-2531 (2009).</li>
<li>Musacchio, A., Desai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Molecular+View+of+Kinetochore+Assembly+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">A Molecular View of Kinetochore Assembly and Function.</a> Biology (Basel). 6 (1), E5(2017).</li>
<li>Chaudhry, M. A., Chodosh, L. A., McKenna, W. G., Muschel, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+HeLa+cells+in+G1+or+G2+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of HeLa cells in G1 or G2 phases.</a> Oncogene. 21 (12), 1934-1942 (2002).</li>
<li>Zhou, J. Y., Ma, W. L., Liang, S., Zeng, Y., Shi, R., Yu, H. L., Xiao, W. W., Zheng, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+microRNA+expression+profiles+during+the+cell+cycle+in+synchronized+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Rep%22%5BJournal%5D)">Analysis of microRNA expression profiles during the cell cycle in synchronized HeLa cells.</a> BMB Rep. 42 (9), 593-598 (2009).</li>
<li>Stumpf, C. R., Moreno, M. V., Olshen, A. B., Taylor, B. S., Ruggero, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+translational+landscape+of+the+mammalian+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The translational landscape of the mammalian cell cycle.</a> Mol. Cell. 52 (4), 574-582 (2013).</li>
<li>Chen, X., Simon, E. S., Xiang, Y., Kachman, M., Andrews, P. C., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+analysis+of+cell+cycle-regulated+Golgi+disassembly+and+reassembly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics analysis of cell cycle-regulated Golgi disassembly and reassembly.</a> J. Biol. Chem. 285 (10), 7197-7207 (2010).</li>
<li>Rosner, M., Schipany, K., Hengstschläger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merging+high-quality+biochemical+fractionation+with+a+refined+flow+cytometry+approach+to+monitor+nucleocytoplasmic+protein+expression+throughout+the+unperturbed+mammalian+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle.</a> Nature Protocols. 8 (3), 602-626 (2013).</li>
<li>Coquelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+non-synchronized+cells+in+the+G1%2C+S+and+G2+phases+of+the+cell+cycle+for+the+study+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Enrichment of non-synchronized cells in the G1, S and G2 phases of the cell cycle for the study of apoptosis.</a> Biochem. Pharmacol. 72 (11), 1396-1404 (2006).</li>
<li>Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Synchronization procedures.</a> Methods Enzymol. 351, 457-467 (2002).</li>
<li>Cooper, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rethinking+synchronization+of+mammalian+cells+for+cell+cycle+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Rethinking synchronization of mammalian cells for cell cycle analysis.</a> Cell Mol. Life Sci. 60 (6), 1099-1106 (2003).</li>
<li>Whitfield, M. L., Sherlock, G., Saldanha, A. J., Murray, J. I., Ball, C. A., Alexander, K. E., Matese, J. C., Perou, C. M., Hurt, M. M., Brown, P. O., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+periodically+expressed+in+the+human+cell+cycle+and+their+expression+in+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors.</a> Mol. Biol. Cell. 13 (6), 1977-2000 (2002).</li>
<li>Vassilev, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+small-molecule+inhibitor+reveals+critical+mitotic+functions+of+human+CDK1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Selective small-molecule inhibitor reveals critical mitotic functions of human CDK1.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (28), 10660-10665 (2006).</li>
<li>Varma, D., Chandrasekaran, S., Sundin, L. J., Reidy, K. T., Wan, X., Chasse, D. A., Nevis, K. R., DeLuca, J. G., Salmon, E. D., Cook, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+the+human+Cdt1+replication+licensing+protein+by+the+loop+domain+of+Hec1+is+required+for+stable+kinetochore-microtubule+attachment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Recruitment of the human Cdt1 replication licensing protein by the loop domain of Hec1 is required for stable kinetochore-microtubule attachment.</a> Nat. Cell Biol. 14 (6), 593-603 (2012).</li>
<li>Garcia, M., Westley, B., Rochefort, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Bromodeoxyuridine+specifically+inhibits+the+synthesis+of+estrogen-induced+proteins+in+MCF7+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">5-Bromodeoxyuridine specifically inhibits the synthesis of estrogen-induced proteins in MCF7 cells.</a> Eur. J. Biochem. 116 (2), 297-301 (1981).</li>
<li>Bostock, C. J., Prescott, D. M., Kirkpatrick, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+the+double+thymidine+block+for+synchronizing+mammalian+cells+at+the+G1-S+border%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">An evaluation of the double thymidine block for synchronizing mammalian cells at the G1-S border.</a> Exp. Cell Res. 68 (1), 163-168 (1971).</li>
<li>Martin-Lluesma, S., Stucke, V. M., Nigg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Hec1+in+spindle+checkpoint+signaling+and+kinetochore+recruitment+of+Mad1%2FMad2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of Hec1 in spindle checkpoint signaling and kinetochore recruitment of Mad1/Mad2.</a> Science. 297, 2267-2270 (2002).</li>
<li>Brouwers, N., Mallol Martinez, N., Vernos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Kif15+and+its+novel+mitotic+partner+KBP+in+K-fiber+dynamics+and+chromosome+alignment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Role of Kif15 and its novel mitotic partner KBP in K-fiber dynamics and chromosome alignment.</a> PLoS One. 12 (4), e0174819(2017).</li>
<li>Dou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+localization+of+Mps1+kinase+to+kinetochores+is+essential+for+accurate+spindle+microtubule+attachment%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Dynamic localization of Mps1 kinase to kinetochores is essential for accurate spindle microtubule attachment.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), E4546-E4555 (2015).</li>
<li>Chan, Y. W., Jeyaprakash, A. A., Nigg, E. A., Santamaria, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aurora+B+controls+kinetochore-microtubule+attachments+by+inhibiting+Ska+complex-KMN+network+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Aurora B controls kinetochore-microtubule attachments by inhibiting Ska complex-KMN network interaction.</a> J Cell Biol. 196 (5), 563-571 (2012).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano che non hanno alcun interesse finanziario concorrenti.

Il vantaggio più critico di sincronizzazione della timidina doppia è che fornisce una dimensione di campione maggiore di cellule mitotiche in una finestra di tempo breve con molte di queste cellule in mitosi sta entrando all'unisono, permettendo così anche analisi di allineamento del cromosoma, bipolare formazione e segregazione del cromosoma del mandrino con efficienza molto più alta.
Molti complessi proteina regolatrice e vie di segnalazione sono dedicate a garantire la normale progressione ...

Nel ciclo cellulare, le cellule subiscono una serie di eventi altamente regolamentati e controllati temporaneamente per la duplicazione esatta del loro genoma e la proliferazione. Nei mammiferi, il ciclo cellulare è costituito da interfase e fase M. In interfase, che consiste di tre fasi - G1, S, e G2, la cellula Duplica il suo genoma e subisce una crescita che è necessaria per ciclo cellulare normale progressione1,2. Nella fase M, che consiste di mitosi (profase, prometafase, metafase, anafase e telofase) e citochinesi, un cellulare parentale produce due cellule figlie geneticamente identiche. Nella mitosi, sorella cromatidi del genoma duplicato sono condensati (Profase) e vengono catturati a loro cinetocori dai microtubuli del fuso mitotico assemblato (prometafase), che spinge il loro allineamento alla piastra di metafase (metafase) seguita da loro uguale segregazione quando sorella cromatidi sono diviso verso e trasportati al mandrino opposto poli (anafase). Le due cellule della figlia sono fisicamente separate dall'attività di un anello contrattile di actina-basato (telofase e citochinesi). Il cinetocore è una struttura specializzata proteinaceo che assembla alla regione centromerica di cromatidi e fungono da siti di attacco per i microtubuli dell'alberino. La sua funzione principale è di guidare la cattura del cromosoma, allineamento e aiuto nella correzione allegato microtubule mandrino improprio, mentre mediando il checkpoint di montaggio del mandrino per mantenere la fedeltà del cromosoma segregazione3,4.
La tecnica di sincronizzazione del cellulare serve come uno strumento ideale per comprendere gli eventi molecolari e strutturali coinvolti nella progressione del ciclo cellulare. Questo approccio è stato utilizzato per arricchire le popolazioni delle cellule alle fasi specifiche di vari tipi di analisi, tra cui analisi di espressione genica, analisi di processi biochimici cellulari e la rilevazione della localizzazione subcellulare delle proteine. Cellule di mammifero sincronizzate possono essere utilizzate non solo per lo studio dei prodotti genici individuali, ma anche per gli approcci di analisi di genomi interi tra cui analisi di microarray di gene espressione5, miRNA espressione modelli6, regolazione traduzionale7e l'analisi proteomica di proteina modifiche8. Sincronizzazione può anche essere utilizzato per studiare gli effetti di espressione genica o proteina knock-down o knock-out, o di sostanze chimiche sulla progressione del ciclo cellulare.
Le cellule possono essere sincronizzate nelle diverse fasi del ciclo cellulare. Metodi fisici e chimici sono ampiamente utilizzati per la sincronizzazione delle cellule. I criteri più importanti per la sincronizzazione delle cellule sono che la sincronizzazione dovrebbe essere noncytotoxic e reversibile. A causa delle potenziali conseguenze negative cellulare di sincronizzazione di cellule da agenti farmacologici, metodi chimico-dipendente possono essere vantaggiosi per studiare gli eventi chiave del ciclo cellulare. Ad esempio, hydroxyurea, amphidicolin, mimosina e lovastatina, può essere utilizzati per la sincronizzazione delle cellule in fase G1/S ma, a causa del loro effetto sulle vie biochimiche che inibiscono, attivare meccanismi di checkpoint del ciclo cellulare e uccidere un importante frazione delle cellule9,10. D'altra parte, feedback inibizione della replicazione del DNA con l'aggiunta di timidina ai media crescita, noti come "blocco" di timidina, può arrestare il ciclo cellulare a determinati punti11,12,13. È inoltre possibile sincronizzare le cellule in fase G2/M trattando con nocodazole e RO-33069,14. Nocodazole, che impedisce di microtubuli, ha una relativamente alta citotossicità. Inoltre, le cellule nocodazole-arrestato possono tornare in interfase precocemente di slittamento mitotico. Doppia timidina blocco arresto cellule alla fase G1/S e dopo il rilascio dal blocco, le cellule si trovano a procedere in modo sincrono attraverso G2 e nella mitosi. La normale progressione del ciclo cellulare per cellule rilasciato dal blocco di timidina può essere osservata in microscopia confocale ad alta risoluzione da fissazione delle cellule o formazione immagine dal vivo. L'effetto di perturbazione delle proteine mitotic possa essere studiato specificamente quando le cellule entrare e procedere attraverso mitosi dopo il rilascio dal blocco doppio della timidina. Cdt1, una proteina multifunzionale, è coinvolto nel DNA replica origine licensing in fase G1 e inoltre è richiesto per gli allegati cinetocore dei microtubuli durante la mitosi15. Per studiare la funzione di Cdt1 durante la mitosi, uno ha bisogno di adottare un metodo che evita l'effetto del suo svuotamento su replica delle licenze durante la fase G1, mentre allo stesso tempo effettuando il suo svuotamento in particolare durante la fase G2/M solo. Qui, presentiamo dettagliati protocolli basati sul blocco di timidina doppia per studiare il ruolo mitotico delle proteine eseguire diverse funzioni nelle varie fasi del ciclo cellulare da formazione immagine fissa e cellule vive.

<table><tbody><tr><td>DMEM (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td>Negozio a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>DPBS (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td>Negozio a 4 gradi C</td></tr><tr><td>Leibovitz' s (1x) L-15 medium</td><td>Life Technologies</td><td>21083-027</td><td>Negozio a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Siero a mezzo ridotto (Opti-MEM)</td><td>Life Technologies</td><td>319-85-070</td><td>Conservare a 4 gradi C</td></tr><tr><td>Penicillina e streptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063 (Pen Strep)</td><td>1:1.000 diluizione</td></tr><tr><td>Dharmafect2</td><td>GE Dharmacon</td><td>T-2002-02</td><td>Conservare a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Thymidine</td><td>MP Biomedicals LLC</td><td>103056</td><td>Disciolta in acqua sterile distilata</td></tr><tr><td>Cdt1 siRNA</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Ref 10</td></tr><tr><td>Hec1 siRNA</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Ref 13</td></tr><tr><td>cellule HeLa che esprimono GFP-H2B</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellule HeLa che esprimono GFP-&alfa;-tubulina e mCherry H2B</td><td>Generoso dono del Dr. Kozo Tanaka di Tohoku università, Giappone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di formaldeide</td><td>Sigma-Aldrich Corporation</td><td>F8775</td><td>Tossico, necessita di cautela</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich Corporation</td><td>D9542</td><td>Tossico, necessita di cautela</td></tr><tr><td>Topo anti-&alfa;-tubulina</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Sc32293</td><td>Diluizione 1:1.000</td></tr><tr><td>Formica di coniglio-Zwint1</td><td>Dietilico</td><td>A300-781A</td><td>diluizione 1:400</td></tr><tr><td>Topo anti-fosfo-&gamma; H2AX (Ser139)</td><td>Upstate Biotechnology</td><td>05-626, clone JBW301</td><td>diluizione 1:300</td></tr><tr><td>Alexa 488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td></td><td>diluizione 1:250</td></tr><tr><td>Rodamine Red-X</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td></td><td>diluizione 1:250</td></tr><tr><td>BioLite 6 pozzetti multipiatto</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130184</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Piatto fondo in vetro</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35GCOL-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TiE microscopio invertito</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disco rotante per confocale</td><td>Yokagawa</td><td>CSU-X1</td><td></td></tr><tr><td>Ultra 888 EM-CCD Fotocamera</td><td>Andor</td><td>iXon Ultra EMCCD</td><td></td></tr><tr><td>Laser a 4 lunghezze d'onda</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema di incubazione per microscopi</td><td>Tokai Hit</td><td>TIZB</td><td></td></tr><tr><td>Software NIS-elements</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

combinazione di sincronizzazione cellulare mitotica e microscopia confocale ad alta risoluzione per studiare il ruolo delle proteine del ciclo cellulare multifunzione durante la mitosi

Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis

Studio dei vari eventi regolatori del ciclo cellulare in un modo dipendente dalla fase fornisce una chiara comprensione sulla crescita delle cellule e la divisione. La sincronizzazione delle popolazioni delle cellule in specifiche fasi del ciclo cellulare è stata trovata per essere molto utile in tali sforzi sperimentali. Sincronizzazione delle cellule dal trattamento con sostanze chimiche che sono relativamente meno tossico può essere vantaggioso rispetto all'uso di farmaci inibitori farmacologici per lo studio del ciclo cellulare conseguente eventi e ottenere arricchimento specifico delle fasi mitotiche selezionati. Qui, descriviamo il protocollo che sincronizzazione cellule umane nelle diverse fasi della cella ciclo, compresi sia in fase S e M con un blocco di doppia timidina e rilasciare procedura per studiare la funzionalità delle proteine mitotic in allineamento del cromosoma e la segregazione. Questo protocollo è stato estremamente utile per studiare i ruoli mitotici delle proteine multifunzionali che possiedono funzioni di interfase stabilito. Nel nostro caso, il ruolo mitotic di Cdt1, una proteina fondamentale per la replica di origine licenza nella fase G1, possa essere studiato in modo efficace solo quando Cdt1 G2/M-specifici possono essere esaurite. Descriviamo il protocollo dettagliato per lo svuotamento di G2/M specifiche Cdt1 utilizza la sincronizzazione della timidina doppia. Abbiamo anche spiegare il protocollo di fissazione delle cellule e live imaging cellulare mediante microscopia confocale ad alta risoluzione dopo il rilascio della timidina. Il metodo è anche utile per analizzare la funzione delle proteine mitotic in condizioni sia fisiologiche che sconcerta come per Hec1, un componente della Ndc80 complesso, poiché consente di ottenere campioni di grandi dimensioni di cellule mitotiche per cella fissa e dal vivo analisi come indichiamo qui.

Studio della progressione mitotica e la stabilità dei microtubuli in cellule risolti dopo rilascio da doppio blocco di timidina Cdt1 è coinvolto nella concessione di licenze di origini di replicazione del DNA nella fase G1. È degradata durante la fase S, ma ri-si accumula in fase G2/M. Per studiare il suo ruolo nella mitosi, il Cdt1 endogeno ha bisogno di essere impoverito specificamente alla fase G/M usando la tecnica di sincronizzazione cellulare più adatta, la timid...

Vi presentiamo un protocollo per la sincronizzazione della timidina doppia delle cellule HeLa seguita da analisi mediante microscopia confocale ad alta risoluzione. Questo metodo è la chiave per ottenere il numero elevato di celle che procedono in modo sincrono dalla fase S alla mitosi, permettendo studi sui ruoli mitotici delle proteine multifunzionali che possiedono anche funzioni di interfase.

Combinazione di sincronizzazione cellulare mitotica e microscopia confocale ad alta risoluzione per studiare il ruolo delle proteine del ciclo cellulare multifunzione durante la mitosi

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di utilizzare la doppia sincronizzazione timidina e la microscopia confocale ad alta risoluzione per studiare i ruoli mitotici di proteine multifunzionali che possono possedere funzioni interfasiche critiche. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia cellulare, su come delineare le normali funzioni delle proteine coinvolte nel ciclo cellulare e nella mitosi. I principali vantaggi di questa tecnica sono che le cellule possono mantenere il loro normale comportamento fisiologico e che questo metodo è anche molto facile da eseguire.A dimostrare questa procedura sarà il Dr.Mohammed Amin, un post-doc del mio laboratorio, che è un esperto nell'uso di questo metodo. Per l'imaging cellulare fisso della progressione delle cellule mitotiche, iniziare seminando circa due volte 10 al quinto di cellule HeLa in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti, contenente un vetrino coprioggetto sterilizzato al 70% con etanolo e UV e due millilitri di terreno DMEM. Dopo 24 ore in un incubatore per colture cellulari, bloccare le cellule con due millilitri di timidina appena diluita e terreno fresco per pozzetto, quindi rimettere la piastra nell'incubatore per altre 18 ore.Il giorno successivo, lavare le cellule due volte con due millilitri di PBS e una volta con un terreno fresco a 37 gradi Celsius. Rimettere le cellule nell'incubatore per nove ore per rilasciare le cellule dal blocco, seguite dall'aggiunta di altri due millilitri di terreno integrato con timidina per pozzetto. Dopo la seconda incubazione di blocco, lavare le cellule due volte con due millilitri di PBS e una volta con due millilitri di terreno fresco a 37 gradi Celsius e aggiungere 100 nanomolari di siRNA appena preparato nei pozzetti appropriati.Dopo nove-10 ore, aspirare il surnatante e fissare le cellule sui vetrini coprioggetti con il quattro percento di paraformaldeide per 20 minuti a temperatura ambiente. Dopo il lavaggio con PBS, permeabilizzare le celle fisse con detergente allo 0,5% per 10 minuti a temperatura ambiente, seguiti da due lavaggi di cinque minuti in PBS. Bloccare le celle con l'uno per cento di BSA in PBS per un'ora a temperatura ambiente.Quindi etichettare le cellule con 50 microlitri degli anticorpi primari di interesse per un'ora a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, lavare tre volte le cellule in PBS e marcarle con 50 microlitri degli anticorpi secondari appropriati di interesse. Dopo un'ora a temperatura ambiente, lavare le celle due volte in PBS per cinque minuti ogni lavaggio ed etichettare le celle con DAPI per cinque minuti a temperatura ambiente.Seguire la colorazione DAPI con due lavaggi di cinque minuti in PBS e utilizzare il mezzo di montaggio appropriato per montare i vetrini coprioggetti sui singoli vetrini da microscopio trasparente. Quindi, utilizzando obiettivi apocromatici ad immersione in olio DIC con piano di apertura numerica 60 o 100 X 1,4 montati su un microscopio confocale invertito ad alta risoluzione dotato di un'apposita fotocamera, acquisire immagini delle proteine immunocolorate in pile Z di 0,2 micrometri di spessore. Per l'imaging di cellule vive della progressione delle cellule mitotiche, seminare circa 0,5-una volta 10 per la quinta cellula HeLa che esprime stabilmente mCherry H2B e GFP alfa-tubulina in piastre con fondo di vetro da 35 millilitri contenenti 1,5 millilitri di terreno DMEM.Far crescere le cellule in un incubatore per colture cellulari per 24 ore. Quindi, la timidina blocca le cellule due volte come appena dimostrato, questa volta lavando le cellule due volte con due millilitri di PBS e una volta con un millilitro di terreno DMEM preriscaldato alla fine di ogni blocco di timidina e trattando le cellule con siRNA dopo il primo blocco durante il primo washout della timidina. Far crescere le cellule in un terreno di Leibovitz fresco e preriscaldato, integrato con il 10% di FBS e 20 millimolari di HEPES per otto ore per rilasciare le cellule dal secondo blocco.Quindi posizionare la prima piastra nella camera a temperatura controllata di un microscopio confocale ad alta risoluzione e utilizzare l'obiettivo 60 X e l'imaging in campo chiaro per mettere a fuoco le cellule. Quando le celle sono visibili, regolare manualmente la posizione della lastra in base alla regione scelta e utilizzare il software di acquisizione delle immagini per impostare la potenza e l'esposizione del laser, i parametri di acquisizione delle immagini e il periodo di durata dell'esperimento. Selezionare i filtri GFP e mCherry appropriati e acquisire immagini a luce trasmessa pulsata e a fluorescenza ogni 10 minuti per un massimo di 16 ore, per ottenere immagini time-lapse del processo di mitosi.Nove ore dopo il rilascio dal doppio blocco di timidina, acquisire le immagini a 12 piani z separati da un micrometro. Quindi analizza le immagini tracciando le singole cellule mitotiche e utilizza il software sorgente appropriato per assemblare un filmato corrispondente. Sebbene la maggior parte delle cellule di controllo e delle cellule Cdt1 siRNA siano allo stadio di metafase a nove ore dopo il rilascio dal doppio blocco di timidina, la fissazione a 10 ore rivela che la maggior parte delle cellule trattate con Cdt1 siRNA sono ancora arrestate nella prometafase tardiva, mentre le cellule di controllo entrano in anafase e segregano i loro cromosomi come previsto.Il trattamento a freddo nove ore dopo il rilascio dal doppio blocco di timidina facilita la ritenzione dei microtubuli cinetocore stabili, che sono relativamente meno robusti nelle cellule deplete di Cdt1 rispetto a quelle all'interno delle cellule deplete di controllo. La licenza di origine della replicazione del DNA non è perturbata nelle cellule Cdt1 o nelle cellule deplete di controllo durante la fase G2-M, poiché queste cellule non sono state trovate per indurre l'accumulo di gamma H2AX fosforalato, un marcatore per il danno al DNA, durante la successiva fase G2. La trasfezione di siRNA Cdt1 di colture asincrone, tuttavia, induce l'accumulo di focolai positivi al fosfo gamma H2AX, probabilmente a causa del danno al DNA indotto da un'impropria licenza di replicazione del DNA.Dopo la rottura dell'involucro nucleare, le cellule normali entrano in mitosi e vanno incontro all'inizio dell'anafase per uscire dalla mitosi entro circa 30-60 minuti. Il knockdown mediato dall'RNAi di Hec1, una proteina chiave del cinetocore necessaria per la formazione di un robusto attacco dei microtubuli cinetocore, ritarda tuttavia la normale progressione mitotica verso l'inizio dell'anafase o l'uscita dalla mitosi anche dopo diverse ore di ritardo della mitosi. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in tre o quattro giorni se eseguita correttamente.Durante il tentativo di eseguire la procedura, è importante ricordarsi di sciogliere completamente la timidina dopo averla scongelata dal congelatore. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come il western blotting per rispondere a ulteriori domande come: quali sono i modelli di espressione delle proteine di interesse durante la mitosi rispetto all'interfase? Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia cellulare per esplorare la biogenesi del cancro in modelli di coltura cellulare umana e per utilizzare la microscopia confocale ad alta risoluzione per identificare le funzioni correlate al ciclo cellulare delle proteine di interesse.Non dimenticare che lavorare con reagenti come la paraformaldeide e il DAPI può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare guanti e camice da laboratorio.

combining-mitotic-cell-synchronization-high-resolution-confocal

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Qui si descrive un protocollo di base per l'immagine e quantificare i tempi mitotico delle cellule dei tessuti dei mammiferi vivono cultura dopo trasfezione di siRNA.

Time-lapse imaging di mitosi dopo la trasfezione di siRNA

Il cinetocore è dove il SAC inizia il suo segnale di controllo della segregazione mitotica dei cromatidi fratelli. Un metodo è descritto per visualizzare il reclutamento e il fatturato di una delle proteine ​​cinetocoro e il suo coordinamento con il movimento dei cromosomi...

Studiare Checkpoint mitotica illustrando un comportamento dinamico delle proteine ​​cinetocoro e Motion cromosoma in Living<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni sinciziale

Metafase di anafase transizione viene attivato attraverso la promozione anafase-complesso (APC / C)-dipendente ubiquitinazione e la successiva distruzione della ciclina B. Qui, abbiamo creato un sistema che, a seguito di pulse-chase etichettatura, permette di monitorare ciclina proteolisi B in popolazioni di cellule intere e facilita la rilevazione di interferenza del checkpoint mitotico.

Studiare proteolisi della ciclina B a livello di singola cellula in popolazioni di cellule intere

Progenitrici neurali mitosi è un parametro critico della neurogenesi. Gran parte della nostra comprensione delle progenitrici neurali mitosi si basa sull'analisi del tessuto fisso. Vivo imaging in fettine cerebrali embrionali è una tecnica versatile per valutare mitosi con alta risoluzione temporale e spaziale in un ambiente controllato.

Immagini dal vivo della mitosi in via di sviluppo embrionali di topo Cortex

Riportiamo due protocolli di sincronizzazione delle celle che forniscono un contesto per studiare eventi legati a fasi specifiche del ciclo cellulare. Mostriamo che questo approccio è utile per analizzare la regolazione di geni specifici in un ciclo cellulare non selettivo o su esposizione ad agenti che interessano il ciclo cellulare.

Studiare l&#39;espressione del gene regolamentata mediante ciclo cellulare da due protocolli complementari di sincronizzazione delle cellule

Questo protocollo descrive un metodo facile e conveniente per etichettare e visualizzare live cromosomi nelle cellule mitotiche utilizzando etichetta Histone2B-GFP BacMam 2.0 e un sistema di microscopia confocal di filatura disco.

Live Cell Imaging della segregazione cromosomica durante la mitosi

Qui, presentiamo l'imaging a cellule vive che è un metodo di microscopia non tossico che consente ai ricercatori di studiare il comportamento delle proteine e la dinamica nucleare nelle cellule di lievito di fissione viventi durante la mitosi e la meiosi.

Esame della dinamica nucleare del lievito di fissione mitotico e meiotico da fluorescenza microscopia a celle vive

Qui presentiamo un protocollo per valutare la dinamica della formazione del mandrino e della progressione mitotica. La nostra applicazione di imaging time-lapse consente all'utente di identificare le cellule in varie fasi della mitosi, monitorare e identificare i difetti mitotici e analizzare la dinamica del mandrino e il destino delle cellule mitotiche dopo l'esposizione a farmaci anti-mitotici.

Live Cell Imaging per valutare la dinamica della temporizzazione metafase e del destino delle cellule a seguito di perturbazioni mitotiche del mandrino

La microscopia time-lapse è uno strumento prezioso per studiare la meiosi nel lievito in erba. Questo protocollo descrive un metodo che combina la sincronizzazione del ciclo cellulare, la microscopia time-lapse e l'esaurimento condizionale di una proteina bersaglio per dimostrare come studiare la funzione di una proteina specifica durante la segregazione cromosomica meiotica.

Uso della microscopia time-lapse e della deplezione nucleare stadio-specifica delle proteine per studiare la meiosi in S. cerevisiae

Questo protocollo descrive in dettaglio due metodi di arresto del ciclo cellulare di lievito e rilascio opzionale, ed elabora l'uso della microscopia a fluorescenza per studiare i processi dipendenti dal ciclo cellulare in S. cerevisiae.

Manipolazione e analisi dei processi dipendenti dal ciclo cellulare nel lievito in gemmazione

Scopri la sincronizzazione cellulare con timidina doppia e microscopia confocale ad alta risoluzione per studiare le proteine multifunzione del ciclo cellulare in cellule HeLa. Questo metodo permette di analizzare i ruoli mitotici mantenendo il comportamento fisiologico normale.

Combinazione di sincronizzazione cellulare mitotica e microscopia confocale ad alta risoluzione per studiare il ruolo delle proteine del ciclo cellulare multifunzione durante la mitosi (Video) | JoVE Journal

Combinazione di sincronizzazione cellulare mitotica e microscopia confocale ad alta risoluzione per studiare il ruolo delle proteine del ciclo cellulare multifunzione durante la mitosi

Esplora altri video