Combinazione di sincronizzazione cellulare mitotica e microscopia confocale ad alta risoluzione per studiare il ruolo delle proteine del ciclo cellulare multifunzione durante la mitosi

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di utilizzare la doppia sincronizzazione timidina e la microscopia confocale ad alta risoluzione per studiare i ruoli mitotici di proteine multifunzionali che possono possedere funzioni interfasiche critiche. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia cellulare, su come delineare le normali funzioni delle proteine coinvolte nel ciclo cellulare e nella mitosi. I principali vantaggi di questa tecnica sono che le cellule possono mantenere il loro normale comportamento fisiologico e che questo metodo è anche molto facile da eseguire.

A dimostrare questa procedura sarà il Dr.Mohammed Amin, un post-doc del mio laboratorio, che è un esperto nell'uso di questo metodo. Per l'imaging cellulare fisso della progressione delle cellule mitotiche, iniziare seminando circa due volte 10 al quinto di cellule HeLa in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti, contenente un vetrino coprioggetto sterilizzato al 70% con etanolo e UV e due millilitri di terreno DMEM. Dopo 24 ore in un incubatore per colture cellulari, bloccare le cellule con due millilitri di timidina appena diluita e terreno fresco per pozzetto, quindi rimettere la piastra nell'incubatore per altre 18 ore.

Il giorno successivo, lavare le cellule due volte con due millilitri di PBS e una volta con un terreno fresco a 37 gradi Celsius. Rimettere le cellule nell'incubatore per nove ore per rilasciare le cellule dal blocco, seguite dall'aggiunta di altri due millilitri di terreno integrato con timidina per pozzetto. Dopo la seconda incubazione di blocco, lavare le cellule due volte con due millilitri di PBS e una volta con due millilitri di terreno fresco a 37 gradi Celsius e aggiungere 100 nanomolari di siRNA appena preparato nei pozzetti appropriati.

Dopo nove-10 ore, aspirare il surnatante e fissare le cellule sui vetrini coprioggetti con il quattro percento di paraformaldeide per 20 minuti a temperatura ambiente. Dopo il lavaggio con PBS, permeabilizzare le celle fisse con detergente allo 0,5% per 10 minuti a temperatura ambiente, seguiti da due lavaggi di cinque minuti in PBS. Bloccare le celle con l'uno per cento di BSA in PBS per un'ora a temperatura ambiente.

Quindi etichettare le cellule con 50 microlitri degli anticorpi primari di interesse per un'ora a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, lavare tre volte le cellule in PBS e marcarle con 50 microlitri degli anticorpi secondari appropriati di interesse. Dopo un'ora a temperatura ambiente, lavare le celle due volte in PBS per cinque minuti ogni lavaggio ed etichettare le celle con DAPI per cinque minuti a temperatura ambiente.

Seguire la colorazione DAPI con due lavaggi di cinque minuti in PBS e utilizzare il mezzo di montaggio appropriato per montare i vetrini coprioggetti sui singoli vetrini da microscopio trasparente. Quindi, utilizzando obiettivi apocromatici ad immersione in olio DIC con piano di apertura numerica 60 o 100 X 1,4 montati su un microscopio confocale invertito ad alta risoluzione dotato di un'apposita fotocamera, acquisire immagini delle proteine immunocolorate in pile Z di 0,2 micrometri di spessore. Per l'imaging di cellule vive della progressione delle cellule mitotiche, seminare circa 0,5-una volta 10 per la quinta cellula HeLa che esprime stabilmente mCherry H2B e GFP alfa-tubulina in piastre con fondo di vetro da 35 millilitri contenenti 1,5 millilitri di terreno DMEM.

Far crescere le cellule in un incubatore per colture cellulari per 24 ore. Quindi, la timidina blocca le cellule due volte come appena dimostrato, questa volta lavando le cellule due volte con due millilitri di PBS e una volta con un millilitro di terreno DMEM preriscaldato alla fine di ogni blocco di timidina e trattando le cellule con siRNA dopo il primo blocco durante il primo washout della timidina. Far crescere le cellule in un terreno di Leibovitz fresco e preriscaldato, integrato con il 10% di FBS e 20 millimolari di HEPES per otto ore per rilasciare le cellule dal secondo blocco.

Quindi posizionare la prima piastra nella camera a temperatura controllata di un microscopio confocale ad alta risoluzione e utilizzare l'obiettivo 60 X e l'imaging in campo chiaro per mettere a fuoco le cellule. Quando le celle sono visibili, regolare manualmente la posizione della lastra in base alla regione scelta e utilizzare il software di acquisizione delle immagini per impostare la potenza e l'esposizione del laser, i parametri di acquisizione delle immagini e il periodo di durata dell'esperimento. Selezionare i filtri GFP e mCherry appropriati e acquisire immagini a luce trasmessa pulsata e a fluorescenza ogni 10 minuti per un massimo di 16 ore, per ottenere immagini time-lapse del processo di mitosi.

Nove ore dopo il rilascio dal doppio blocco di timidina, acquisire le immagini a 12 piani z separati da un micrometro. Quindi analizza le immagini tracciando le singole cellule mitotiche e utilizza il software sorgente appropriato per assemblare un filmato corrispondente. Sebbene la maggior parte delle cellule di controllo e delle cellule Cdt1 siRNA siano allo stadio di metafase a nove ore dopo il rilascio dal doppio blocco di timidina, la fissazione a 10 ore rivela che la maggior parte delle cellule trattate con Cdt1 siRNA sono ancora arrestate nella prometafase tardiva, mentre le cellule di controllo entrano in anafase e segregano i loro cromosomi come previsto.

Il trattamento a freddo nove ore dopo il rilascio dal doppio blocco di timidina facilita la ritenzione dei microtubuli cinetocore stabili, che sono relativamente meno robusti nelle cellule deplete di Cdt1 rispetto a quelle all'interno delle cellule deplete di controllo. La licenza di origine della replicazione del DNA non è perturbata nelle cellule Cdt1 o nelle cellule deplete di controllo durante la fase G2-M, poiché queste cellule non sono state trovate per indurre l'accumulo di gamma H2AX fosforalato, un marcatore per il danno al DNA, durante la successiva fase G2. La trasfezione di siRNA Cdt1 di colture asincrone, tuttavia, induce l'accumulo di focolai positivi al fosfo gamma H2AX, probabilmente a causa del danno al DNA indotto da un'impropria licenza di replicazione del DNA.

Dopo la rottura dell'involucro nucleare, le cellule normali entrano in mitosi e vanno incontro all'inizio dell'anafase per uscire dalla mitosi entro circa 30-60 minuti. Il knockdown mediato dall'RNAi di Hec1, una proteina chiave del cinetocore necessaria per la formazione di un robusto attacco dei microtubuli cinetocore, ritarda tuttavia la normale progressione mitotica verso l'inizio dell'anafase o l'uscita dalla mitosi anche dopo diverse ore di ritardo della mitosi. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in tre o quattro giorni se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di eseguire la procedura, è importante ricordarsi di sciogliere completamente la timidina dopo averla scongelata dal congelatore. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come il western blotting per rispondere a ulteriori domande come: quali sono i modelli di espressione delle proteine di interesse durante la mitosi rispetto all'interfase? Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia cellulare per esplorare la biogenesi del cancro in modelli di coltura cellulare umana e per utilizzare la microscopia confocale ad alta risoluzione per identificare le funzioni correlate al ciclo cellulare delle proteine di interesse.

Non dimenticare che lavorare con reagenti come la paraformaldeide e il DAPI può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare guanti e camice da laboratorio.