Manipolazione e analisi dei processi dipendenti dal ciclo cellulare nel lievito in gemmazione

Studiamo come le cellule in divisione trasmettono fedelmente i loro cromosomi durante la mitosi, concentrandoci sulle macchine molecolari e sui meccanismi che garantiscono una corretta segregazione dei cromosomi. Sincronizziamo le cellule per studiare i processi molecolari che cambiano con il ciclo cellulare. Senza questi metodi, i cambiamenti chiave sarebbero nascosti in una popolazione cellulare non sincronizzata.

Rispetto ad altri metodi di sincronizzazione, l'arresto alfa-fattore nei mutanti BAR1 fornisce un arresto G1 più pulito e reversibile, permettendoci di monitorare l'intera coltura di lievito che procede sincronamente durante il ciclo. Il nostro lavoro rivela cambiamenti dinamici nella localizzazione e attività delle proteine durante tutto il ciclo cellulare, facendo luce su processi mitotici chiave, come la segregazione cromosomica e il mantenimento del fuso. Per cominciare, inoculare il lievito in 25 millilitri di materiale YPAD e incubare durante la notte per raggiungere una densità ottica a 600 nanometri compresa tra 0,5 e 2,0.

Diluire le cellule del lievito a una densità ottica di 600 nanometri pari a 0,5. Aggiungi fattore alfa alla coltura per raggiungere una concentrazione finale di un microgrammo per millilitro. Tra 2,5 e 3,5 ore dall'aggiunta del fattore alfa, si conterà la percentuale di cellule shmooed non germogliate al microscopio per valutare l'arresto cellulare.

Poi, centrifuga la coltura in centrifuga a 3.000g per tre o cinque minuti a 23 gradi Celsius. Versa con cura il sovrantato per rimuovere il fattore alfa. Risospendere il pellet cellulare in 25 millilitri di YPAD contenente 1% dimetil solfosdo per lavare le cellule.

Trasferire il pellet cellulare in un tubo nuovo e ripetere i lavaggi altre due volte per un totale di tre lavaggi per rimuovere qualsiasi fattore alfa residuo. Successivamente, aggiungere YPAD alle celle lavate per portare il volume finale a 25 millilitri e trasferire la sospensione in una nuova fiaschetta per ulteriori incubazioni o utilizzi. Raccogli il campione a zero minuti di tempo immediatamente dopo il rilascio e fissa il campione.

A 60 minuti dal rilascio, si valuta la sincronia della popolazione cellulare al microscopio ottico. Se desiderato, aggiungere nuovamente il fattore alfa a 60 minuti dopo il rilascio a una concentrazione finale di un microgrammo per millilitro per bloccare la progressione verso il ciclo cellulare successivo. Continua a raccogliere campioni di punti temporali ogni 15 minuti fino a 180 minuti o per tutto il tempo necessario.

Per fissare le cellule del lievito, centrifuga un millilitro di coltura per un minuto alla massima velocità. Aspira completamente il soprantantante. Poi, risospendere il pellet in 500 microlitri di soluzione fissativa e incubare a 23 gradi Celsius per due a 15 minuti.

Dopo aver centrifugato le cellule fissate, aspirare il sovrandante e risospendere il pellet in 500 microlitri di tampone fosfato di potassio 0,1 molari al pH 6,4. Prima dell'immaginione, centrifugare le celle fisse a 23 gradi Celsius per un minuto alla massima velocità. Una volta aspirato il soprantantante, si sospede il pellet in 10-100 microlitri di soluzione di Triton, DAPI e sorbitolo.

Pipettare circa 0,8 microlitri della sospensione a cellule colorate direttamente al centro di una copertura pulita. Usa una punta di pipetta per distribuire delicatamente la goccia in un'area circolare di circa un centimetro quadrato. Posiziona il foglio di copertura su un vetrino microscopico.

Usando un Kimwipe, premi delicatamente intorno ai bordi della copertura per distribuire uniformemente il campione. Poi, sigilla i bordi della copertura con dello smalto per unghie per fissare il campione. Porta il vetrino preparato a un microscopio dotato di un ingrandimento 60 volte, un obiettivo a immersione a olio con apertura numerica 1,42 e un set laser e filtro rosso, verde, blu e rosso lontano.

Focali il microscopio sulle cellule di lievito aderite al coperto. Una volta messa a fuoco, regolate le impostazioni di esposizione per ogni canale di fluorescenza per ottenere un rapporto segnale-rumore di almeno tre a uno. Regolare le impostazioni di acquisizione per raccogliere da 14 a 20 immagini z-stack con ogni slice distanziata a 0,2 micrometri, coprendo una profondità z totale di due a quattro micrometri.

Sui microscopi dotati di moduli di post-elaborazione, seleziona le opzioni Deconvolution e Quick Projection per ogni immagine z-stack. Acquisire z-stack del campione, catturando abbastanza immagini da registrare circa 100-200 cellule di lievito per ogni condizione sperimentale o punto temporale. Per l'analisi, apri le immagini proiettate nel software ImageJ.

Regola la luminosità e il contrasto di ogni canale di fluorescenza per migliorare la visibilità. Per analizzare la progressione del ciclo cellulare, contare 100 cellule per ogni punto temporale e classificarle come contenenti uno o due nuclei. Per calcolare la percentuale di celle che mostrano punti Stu2-GFP, standardizza le impostazioni di luminosità del canale verde su tutte le immagini.

Cellule di conteggio che mostrano punti Stu2-GFP che co-localizzano con Spc110-mCherry puncta come positivi per la localizzazione dei cinetocore. Successivamente, per quantificare l'intensità dei punti proteici, si utilizza lo strumento di selezione a mano libera per delineare la regione di interesse attorno al segnale. Aggiungi la selezione al Region of Interest Manager premendo T o scegliendo l'opzione dal menu ROI Manager.

Nel ROI Manager, clicca su Misura per calcolare l'intensità del punto. Per visualizzare i cambiamenti nel tempo, traccia l'intensità media con intervalli di confidenza al 95% per ogni punto temporale. Contare circa 100 cellule per condizione.

Nelle cellule arrestate da G1, Stu2-GFP si è localizzato in un singolo punto prossimale del polo fuso con ulteriore segnale disperso lungo i microtubuli citoplasmatici. A 60 minuti dal rilascio, Stu2-GFP si è localizzato come due punti adiacenti a poli duplicati del fuso segnati da Spc110-mCherry. Dopo 90 minuti, durante l'anafase, Stu2-GFP appariva sia vicino ai poli del fuso sia lungo i microtubuli che attraversavano il singolo asse.

Dopo l'uscita mitotica, a 120 minuti, Stu2-GFP è riapparsa sui microtubuli astrali nel citoplasma. La quantificazione ha rivelato che l'intensità di Stu2-GFP vicino ai poli del fuso è aumentata durante la mitosi precoce, raggiungendo il picco prima dell'anafase e diminuindo successivamente. La percentuale di cellule binucleate ha raggiunto il picco di circa 90 minuti, indicando un ingresso sincronizzato nell'anafase.