Protocollo ottimizzato per l'estrazione delle proteine ​​dalla valvola mitrale umana

L'obiettivo generale di questa procedura è estrarre in modo efficiente le proteine dalla valvola mitrale cardiaca umana, rendendole adatte per l'analisi proteomica. Questo metodo potrebbe contribuire a svelare i meccanismi patogenetici nel campo delle malattie valvolari cardiache, consentendo l'identificazione di nuovi marcatori diagnostici e prognostici per le malattie e, si spera, di potenziali bersagli terapeutici. Il vantaggio principale di questo protocollo è che fornisce un flusso di lavoro di estrazione efficiente, compatibile con numerose applicazioni analitiche.

I risultati rappresentano una caratterizzazione più esaustiva del proteoma della valvola mitrale cardiaca. Inoltre, questo protocollo può essere applicato anche ad altri sistemi, come la valvola mitrale del suino, che presenta una forte somiglianza con la valvola umana ed è utilizzata come modello sperimentale per la valutazione della funzione valvolare. A dimostrare la procedura sperimentale sarà Stefania Ghilardi, una tecnica del mio laboratorio.

per preparare la valvola mitrale umana, iniziare con un cuore espiantato che sia stato sottoposto a ischemia fredda per quattro-dodici ore. In un ambiente controllato, rimuovere il cuore dal sacchetto di trasporto e collocarlo in un secchio sterilizzato. Successivamente, trasferire il cuore in una cappa biologica.

Lì, utilizzando un bisturi monouso, effettuare un taglio perpendicolare all'asse maggiore a livello dei ventricoli sinistro e destro, a circa quattro centimetri dall'apice. Successivamente, posizionare il cuore su un campo sterile. Poi, spostare lateralmente l'aorta ascendente e l'arteria polmonare per accedere alla parete superiore dell'atrio sinistro.

Sul tetto dell'atrio sinistro, utilizzare pinze e strumenti appositi per tagliare intorno all'auricola sinistra ed esporre la valvola mitrale. La valvola mitrale è completamente contenuta nel ventricolo sinistro. Pertanto, esporre la valvola mitrale anteriore (grande lembo) e la valvola mitrale posteriore (piccolo lembo).

I commessi anterolaterale e posteromediale delimitano la zona anteriore e posteriore. Ora, con forbici e pinze non traumatiche, dissezionare la parete dell'atrio sinistro e del ventricolo che circonda la valvola mitrale. Durante questa dissezione, identificare la continuità tra la valvola mitrale e quella aortica.

Successivamente, separare la valvola mitralica anteriore da quella posteriore tagliando lungo le commessure che delimitano la valvola posteriore. Al termine della procedura, sanificare il tavolo dell'armadio con una soluzione di alcol isopropilico al 70% e una soluzione di perossido di idrogeno al 6%. A questo punto, lavare la valvola mitralica posteriore con soluzione fisiologica.

Quindi, tagliare la valvola in piccoli pezzi, ciascuno di dimensioni inferiori a un centimetro quadrato. Avvolgere i pezzi singolarmente in fogli di alluminio e congelarli rapidamente con azoto liquido. Per iniziare l'estrazione delle proteine, utilizzare una pinza per prelevare un campione dall'azoto liquido e posizionarlo immediatamente sul ghiaccio secco.

Non far scongelare il campione. Successivamente, inserire nel matraccio criogenico riempito con azoto liquido il mortaio, le pestelli associati e il campione. È fondamentale utilizzare l'azoto liquido per congelare il campione e raffreddare il sistema di macinazione.

Questo passaggio impedisce il degrado biologico e consente una polverizzazione efficiente, ma richiede un addestramento tecnico per la manipolazione in sicurezza. Dopo il congelamento rapido, riporre il mortaio e il pestello in una scatola di polistirolo contenente ghiaccio secco. Posizionare anche una spatola sul ghiaccio secco.

Successivamente, rimuovere il campione dalla stagnola e caricarlo nel mortaio. Posizionare il pestello più grande al di sopra. Utilizzando un cacciavite per ruotare il pestello, macinare il campione da 15 a 20 volte.

Durante la macinazione, mescolare il campione con la punta di una spatola refrigerata. Dopo aver utilizzato il pestello grande, ripetere il processo di macinazione con un pestello più piccolo. Ottenere una polvere fine è fondamentale per un'estrazione efficiente delle proteine.

Ora, versare il campione in polvere in un tubo da centrifuga da 15 millilitri di massa nota. Quindi, spazzolare con una spatola fredda qualsiasi materiale rimanente nel mortaio. Mantenere il tubo con il campione sul ghiaccio secco e determinare rapidamente la massa del campione.

Successivamente, versare il campione in un tubo di omogeneizzazione in vetro. Poi, aggiungere 200 microlitri di tampone urea per ogni 10 milligrammi di campione. In questo modo, recuperare i residui rimasti nel tubo risciacquandoli con l'aliquota di tampone urea.

Ora omogeneizzare il campione utilizzando un pestello motorizzato in PFTE che funziona a 1.500 giri al minuto. Premere lentamente il pestello sul campione con un movimento rotatorio per 10 volte. Successivamente, trasferire il sopranatante giallo viscoso in una provetta da centrifuga pulita da 1,7 millilitri utilizzando una pipetta di vetro.

Ora ripetere l'omogeneizzazione sul campione rimanente utilizzando la metà della quantità di urea. Recuperare il soprannatante e combinarlo con la raccolta precedente. Successivamente, posizionare il tubo su un rotatore per tubi per 30 minuti.

Dopo 30 minuti, caricare il tubo in una centrifuga fredda e centrifugare il campione a 13.000 G per mezz'ora. Quindi, recuperare il soprannatante e misurare la concentrazione proteica utilizzando il saggio proteico di Bradford.

Dopo aver eseguito il protocollo prescritto, l'estratto proteico è stato studiato mediante una serie di metodi a seguito di alcuni trattamenti aggiuntivi. Un totale di 422 proteine è stato identificato nel tessuto della valvola mitrale mediante elettroforesi bidimensionale, focalizzazione isoelettrica in fase liquida, cromatografia liquida-spettrometria di massa e cromatografia liquida bidimensionale-spettrometria di massa. Le 422 proteine sono state classificate utilizzando l'analisi della Gene Ontology.

Le regioni extracellulari contenevano diverse proteine previste e altre proteine intracellulari e di superficie cellulare. Molte di queste sono state identificate per la prima volta nelle valvole mitrali. La presenza di quattro di tali proteine, precedentemente non identificate nelle valvole mitrali, è stata confermata mediante anticorpi in tre campioni unici.

Le proteine sono la Septina-11, la proteina con quattro e mezzo domini LIM uno, la Dermatoponina e la cristallina alfa B. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come estrarre le proteine dalla valvola mitrale cardiaca per la loro identificazione e quantificazione. Una volta padroneggiato, questo protocollo può essere completato in poco meno di due ore se eseguito correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, per ottenere il massimo rendimento di proteine con elevata integrità proteica, è fondamentale che i campioni non si scongelino durante nessuno dei trasferimenti.