Protocollo ottimizzato per l'estrazione delle proteine ​​dalla valvola mitrale umana

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di estrarre in modo efficiente le proteine dalla valvola mitrale cardiaca umana, adatte per l'analisi proteomica. Questo metodo può potenzialmente aiutare a scoprire meccanismi patogenetici nel campo della malattia valvolare cardiaca, consentendo l'identificazione di nuovi marcatori diagnostici e prognostici di malattia e, auspicabilmente, di bersagli terapeutici. Il vantaggio principale di questo protocollo è che fornisce un flusso di lavoro di estrazione efficiente compatibile con molte applicazioni analitiche.

I risultati sono una caratterizzazione più esaustiva del proteo della valvola mitrale cardiaca. Inoltre, questo protocollo può essere applicato anche ad altri sistemi, come la valvola mitrale suina, che ha una stretta somiglianza con la valvola umana e viene utilizzata in modelli sperimentali per la valutazione della funzione valvolare. A dimostrare la procedura sperimentale sarà Stefania Ghilardi, un tecnico del mio laboratorio.

Per preparare la valvola mitrale umana, iniziare con un cuore espiantato che è stato sottoposto a ischemia fredda da quattro a 12 ore. In una camera bianca, rimuovere il cuore dalla borsa di trasporto e metterlo in un secchio sterilizzato. Quindi, trasferisci il cuore in una cabina di biosicurezza.

Lì, usando un bisturi usa e getta, taglia perpendicolarmente all'asse maggiore a livello dei ventricoli sinistro e destro, a circa quattro centimetri dall'apice. Quindi posizionare il cuore su un telo sterile. Quindi, spostare di lato l'aorta ascendente e l'arteria polmonare per accedere al tetto atriale sinistro.

Sul tetto atriale sinistro, usa pinze e picconi per tagliare intorno al padiglione auricolare sinistro per esporre la valvola mitrale. La valvola mitrale è completamente contenuta nel ventricolo sinistro. Quindi, esporre il foglietto mitralico grande e il foglietto mitralico piccolo.

Le commessure anterolaterale e posteromediale definiscono il confine della zona anteriore e posteriore. Ora, con forbici e pinze non traumatiche, seziona l'atrio sinistro e lo spessore della parete ventricolare che circonda la valvola mitrale. Durante questa dissezione, identificare la continuità della valvola aortica mitralica.

Quindi, separare il lembo della valvola mitrale anteriore dal lembo posteriore della valvola mitrale tagliando lungo le commessure che delimitano il lembo posteriore. Al termine della procedura, igienizzare il tavolo dell'armadio con una soluzione di alcol isopropilico al 70% e una soluzione di perossido di idrogeno al 6%. Ora, lavare il lembo posteriore della valvola mitrale in soluzione fisiologica.

Quindi, tagliare la valvola in piccoli pezzi, ciascuno di meno di un centimetro quadrato. Avvolgere i pezzi singolarmente in un foglio di alluminio e congelarli con azoto liquido. Per iniziare l'estrazione delle proteine, utilizzare una pinza per rimuovere un campione dall'azoto liquido e posizionarlo immediatamente su ghiaccio secco.

Non lasciare che il campione si scongeli. Quindi, in un pallone di dewar riempito di azoto liquido, posizionare il mortaio, i pestelli associati e il campione. È fondamentale che l'azoto liquido venga utilizzato per congelare il campione e raffreddare il sistema di triturazione.

Questo passaggio impedisce la degradazione biologica e consente un'efficace polverizzazione, ma richiede una formazione tecnica per una manipolazione sicura. Una volta congelati, metti il mortaio e i pestelli in una scatola di polistirolo contenente ghiaccio secco. Inoltre, metti una spatola sul ghiaccio secco.

Quindi, rimuovere il campione dalla pellicola e caricarlo nel mortaio. E posiziona il pestello più grande sopra di esso. Usando un cacciavite per ruotare il pestello, macinare il campione da 15 a 20 volte.

Durante la macinazione, mescolare il campione con la punta di una spatola fredda. Dopo aver utilizzato il pestello grande, ripetere il processo di macinazione con un pestello più piccolo. Ottenere una polvere fine è fondamentale per un'estrazione efficiente delle proteine.

Ora, versare il campione in polvere in una provetta da centrifuga da 15 millilitri di massa nota. Quindi spennellare il materiale rimanente nella malta con una spatola fredda. Tenere la provetta con il campione su ghiaccio secco e determinare rapidamente la massa del campione.

Quindi, versare il campione in una provetta omogeneizzatrice di vetro. Quindi, aggiungere 200 microlitri di tampone urea per ogni 10 milligrammi di campione. Nel fare ciò, recuperare i residui rimasti nel tubo risciacquandoli con l'aliquota del tampone urea.

Ora omogeneizzare il campione utilizzando un pestello PFTE motorizzato che funziona a 1.500 giri/min. Premere lentamente il pestello sul campione con un movimento rotatorio 10 volte. Quindi, trasferire il surnatante giallo viscoso in una provetta da centrifuga pulita da 1,7 millilitri utilizzando una pipetta di vetro.

Ripetere ora l'omogeneizzazione sul campione rimanente utilizzando metà dell'urea. Recupera il surnatante e combinalo con la collezione precedente. Quindi, posizionare la provetta su un rotatore per provette per 30 minuti.

Dopo 30 minuti, caricare la provetta in una centrifuga fredda e centrifugare il campione a 13.000 G per mezz'ora. Quindi, recupera il surnatante. E misurare la concentrazione proteica utilizzando il test delle proteine di Bradford.

Dopo aver eseguito il protocollo prescritto, l'estratto proteico è stato studiato utilizzando una varietà di metodi dopo alcuni trattamenti aggiuntivi. Un totale di 422 proteine sono state identificate nel tessuto della valvola mitrale mediante elettroforesi bidimensionale, focalizzazione isoelettrica in fase liquida, cromatografia liquida-spettrometria di massa e cromatografia liquida-spettrometria di massa 2D. Le 422 proteine sono state classificate utilizzando l'analisi dell'ontologia genica.

Le regioni extracellulari contenevano diverse proteine attese e altre proteine intracellulari e di superficie cellulare. Molti dei quali sono stati identificati per la prima volta nelle valvole mitrali. La presenza di quattro di queste proteine non precedentemente identificate nelle valvole mitraliche è stata confermata con anticorpi in tre campioni unici.

Le proteine sono Septin-11, quattro domini LIM e mezzo, proteina uno, dermatoponina e alfa cristallina B.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come estrarre le proteine dalla valvola mitrale cardiaca per la loro identificazione e quantificazione. Una volta padroneggiato, questo protocollo può essere eseguito in quasi due ore se eseguito correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, per ottenere la massima resa di proteine con un'elevata integrità proteica, è fondamentale che i campioni non si scongelino durante il trasferimento.