Determinare la frequenza inibitorio ottimale per le cellule cancerose del tumore Uso Trattare Fields (TTFields)

L'obiettivo generale del sistema di applicazione in vitro TTFields è quello di studiare il loro effetto sulle cellule tumorali di diversi tipi di tumore, per guidare la somministrazione clinica di TTFields e ottimizzare l'esito del trattamento. Questo metodo può aiutare a definire l'effetto di diversi parametri TTField sulle cellule tumorali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'identificazione preclinica della frequenza TTField più efficace che inibisce la crescita di una specifica linea cellulare tumorale, che potrebbe essere applicata nell'uomo.

Con una leggera modifica di questa tecnica, è possibile testare l'efficacia del trattamento combinato di TTField e altre modalità di trattamento, come gli agenti chemioterapici e la radioterapia. A dimostrare la procedura sarà Yaara Porat, una ricercatrice del nostro team. Per iniziare, installa le piastre TTFields con coperchio su una piastra di base e prepara altre otto piastre che verranno utilizzate per la crescita delle celle di controllo.

Posizionare un vetrino coprioggetti sterile da due millimetri sul fondo di ogni piatto. Quindi, sospendere cinque volte 10 alla quarta cellula U-87 MG in un millilitro di terreno DMEM. Il numero appropriato di cellule piastrate in ciascuna piastra dipende dalle proprietà della linea cellulare in uso.

È fondamentale calibrarlo prima dell'esperimento per evitare una crescita eccessiva delle cellule. Pipetare 200 microlitri della sospensione cellulare su ciascun vetrino coprioggetti in modo tale che si formi una goccia sulla sua superficie e coprire i piatti con i loro coperchi. Incubare tutte le piastre a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica durante la notte per consentire alle cellule di aderire.

Una volta fissate le cellule, aspirare il terreno dai vetrini coprioggetti utilizzando una pipetta da 200 microlitri, quindi pipettare con cura due millilitri di terreno di coltura completo su ciascun piatto. Picchiettare delicatamente con la punta di una pipetta sterile sui bordi del vetrino coprioggetti per rilasciare eventuali bolle d'aria intrappolate sotto il vetrino. Successivamente, incubare le cellule a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica fino all'inizio del trattamento con TTFields.

Per iniziare il trattamento TTFields, rimuovere la piastra di base dall'incubatore a 37 gradi Celsius e posizionarla in un incubatore ad anidride carbonica refrigerato. La temperatura dell'incubatore refrigerato determinerà l'intensità del campo elettrico. È importante utilizzare l'intensità appropriata, che dipende dalla sensibilità cellulare ai TTFields.

Quindi collegare un connettore femmina del cavo piatto alla piastra di base e accendere il generatore TTFields. Apri il software dedicato al sistema di applicazione in vitro TTFields. Dopo aver definito un nuovo studio inserendo i nomi dell'esperimento e dello sperimentatore, regolare la frequenza e la temperatura target per ogni piatto.

Fare clic sul pulsante di avvio per avviare il trattamento TTFields nel software e verificare se tutte le piastre appaiono azzurre sul monitor, il che conferma la loro corretta connessione. Per ristabilire la connessione, premere delicatamente la parabola verso il basso e ruotarla lentamente avanti e indietro finché la parabola non appare azzurra sullo schermo. Dopo 24 ore dal trattamento, interrompere l'esperimento nel software facendo clic su pausa.

Scollegare il connettore del cavo piatto dalla piastra di base, quindi posizionare la piastra di base nell'armadio a flusso laminare, quindi rimuovere la piastra di base con le piastre e le celle di controllo coltivate in condizioni standard dai loro incubatori. Sostituire il terreno in tutte le piastre con un terreno di coltura completo fresco, quindi posizionare le celle di controllo in un incubatore a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica e rimettere la piastra di base nell'incubatore refrigerato. Ricollegare la piastra di base al generatore.

Continua il trattamento facendo clic sul pulsante continua. Una volta completato il trattamento, termina l'esperimento facendo clic sul pulsante Termina esperimento nel software, quindi salva i dati caricati dal sistema. Dopo aver spento il generatore TTFields, scollegare il cavo piatto dalla piastra di base e rimuovere il sistema dall'incubatrice.

Premere e ruotare il piatto in ceramica in senso antiorario per staccarlo dalla piastra di base. Successivamente, trasferire in modo asettico i vetrini coprioggetti trattati e di controllo TTFields in piastre di Petri sterili contenenti terreno fresco per un'ulteriore valutazione. Per valutare l'effetto del trattamento TTFields, rimuovere il terreno da ogni capsula contenente il vetrino, quindi aggiungere 0,5 millilitri di tripsina/EDTA allo 0,25% e incubare le piastre a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica fino a quando le cellule non si staccano dalla superficie del vetrino.

Neutralizzare la tripsina con 0,5 millilitri di terreno di coltura completo e risospendere le cellule pipettando delicatamente la sospensione su e giù. Infine, contare le cellule mediante citometria a flusso. Di seguito sono presentati i risultati della scansione di frequenza effettuata in cellule A2780, che rivelano l'influenza dipendente dalla frequenza dei TTFields sulla crescita e sulla capacità clonogenica delle cellule studiate.

L'efficacia del trattamento più importante è stata osservata quando è stata applicata la frequenza di 200 kilohertz. L'efficacia del trattamento con TTFields effettuato a due diverse intensità è stata studiata in cellule OVCAR-3. Lo studio mostra una chiara relazione tra l'intensità applicata e l'esito del trattamento, con la maggiore attività inibitoria della crescita della maggiore intensità di campo.

Indipendentemente dall'intensità di campo applicata, l'effetto più forte del trattamento TTFields è stato osservato alla frequenza di 200 kilohertz. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di 30 minuti al giorno. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di evitare fuoriuscite di fluidi e di mantenere le piastre bilanciate durante il trasferimento dall'incubatrice alla cappa e viceversa.

Dopo l'applicazione di TTField, possono essere eseguite altre metodiche, come la citometria a flusso, l'analisi delle proteine alanina o la microscopia immunofluorescente al fine di indagare ulteriormente l'esito del trattamento e il meccanismo alla base dell'attività osservata. Questa tecnica viene utilizzata per determinare le frequenze ottimali dei TTFields da applicare in ambito clinico per diversi tipi di cancro. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come pianificare ed eseguire gli esperimenti TTFields in vitro.

Non dimenticare che lavorare con linee cellulari umane può essere pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni, come guanti e indumenti protettivi.