Determinazione della frequenza di campo ottimale per il trattamento dei tumori inibitori per le cellule tumorali: un metodo in vitro non invasivo per valutare l'effetto dei TTFields sulla vitalità delle cellule tumorali

I campi per il trattamento dei tumori, o TTFields, utilizzano campi elettrici alternati per interrompere la proliferazione delle cellule tumorali. Per studiare l'effetto dei TTFields sulle cellule cancerose in vitro, iniziare assemblando piastre compatibili con TTFields su una piastra di base. Una coppia di elettrodi posizionati sulle pareti della parabola aiuta a erogare i campi elettrici internamente.

Posizionare un vetrino coprioggetti di vetro all'interno del piatto assemblato. Semina una goccia di sospensione di cellule tumorali sul vetrino coprioggetti. Incubare per consentire alle cellule di depositarsi e aderire alla superficie del vetrino. Eliminare i supporti esauriti. Integralo con un nuovo terreno di coltura per supportare la crescita e l'espansione delle cellule tumorali.

Trasferire il gruppo in un ambiente refrigerato per compensare il riscaldamento della parabola durante l'applicazione del campo elettrico. Quindi, collegare il gruppo a un alimentatore. Sottoporre le celle a un campo elettrico appropriato per la durata desiderata.

All'interno delle cellule in rapida divisione, il campo applicato fa sì che molecole cariche come i dimeri di tubulina e le septine si allineino forzatamente nella sua direzione. Questo meccanismo interferisce con eventi mitotici chiave come la polimerizzazione dei microtubuli e la localizzazione delle fibre di septina. L'arresto mitotico che ne deriva innesca l'apoptosi che porta alla morte delle cellule tumorali.

Per iniziare, installa le piastre TTFields con coperchi su una piastra di base e prepara altre 8 piastre che verranno utilizzate per la crescita delle celle di controllo. Posizionare un vetrino coprioggetti sterile da 2 millimetri sul fondo di ogni piatto. Quindi, sospendere 5 volte 10 alle quarte cellule di U-87 MG in un millilitro di terreno DMEM.

Il numero appropriato di cellule piastrate in ciascuna piastra dipende dalle proprietà della linea cellulare in uso. È fondamentale calibrarlo prima dell'esperimento per evitare una crescita eccessiva delle cellule.

Pipetare 200 microlitri di sospensione cellulare su ciascun vetrino coprioggetti in modo che si formi una goccia sulla sua superficie e coprire le piastre con i loro coperchi. Incubare tutte le piastre a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica durante la notte per consentire alle cellule di aderire.

Una volta fissate le cellule, aspirare il terreno dai vetrini coprioggetti utilizzando una pipetta da 200 microlitri. Quindi, versare con cura 2 millilitri di terreno di coltura completo su ogni piatto. Picchiettare delicatamente con una punta di pipetta sterile sui bordi del vetrino coprioggetti per rilasciare eventuali bolle d'aria intrappolate sotto il vetrino.

Successivamente, incubare le cellule a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica fino all'inizio del trattamento con TTFields. Per iniziare il trattamento TTFields, rimuovere la piastra di base dall'incubatore a 37 gradi Celsius e posizionarla in un incubatore ad anidride carbonica refrigerato.

La temperatura dell'incubatore refrigerato determinerà l'intensità del campo elettrico. È importante utilizzare l'intensità appropriata, che dipende dalla sensibilità cellulare ai TTFields.

Quindi, inserire un connettore femmina del cavo piatto nella piastra di base e accendere il generatore TTFields. Aprire il software dedicato al sistema di applicazione in vitro TTFields. Dopo aver definito un nuovo studio inserendo i nomi dell'esperimento e dello sperimentatore, regolare la frequenza e la temperatura target per ogni piatto.

Fare clic sul pulsante START per avviare il trattamento del TTField nel software e verificare se tutte le piastre appaiono azzurre sul monitor, confermando la loro corretta connessione. Per ristabilire la connessione, premere delicatamente la parabola verso il basso e ruotarla lentamente avanti e indietro finché la parabola non appare azzurra sullo schermo.

Dopo 24 ore dal trattamento, interrompere l'esperimento nel software facendo clic su PAUSA. Scollegare il connettore del cavo piatto dalla piastra di base, quindi posizionare la piastra di base nell'armadio a flusso laminare.

Quindi, rimuovere la piastra di base con le piastre e le cellule di controllo coltivate in condizioni standard dalle loro incubatrici. Sostituire il terreno in tutti i piatti con un terreno di coltura fresco completo. Quindi, posizionare le celle di controllo in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica e rimettere la piastra di base nell'incubatore refrigerato.

Ricollegare la piastra di base al generatore. Continuare il trattamento cliccando sul pulsante CONTINUA. Una volta completato il trattamento, termina l'esperimento facendo clic sul pulsante TERMINA ESPERIMENTO nel software. Quindi, salva i dati caricati dal sistema.

Dopo aver spento il generatore TTFields, scollegare il cavo piatto dalla piastra di base e rimuovere il sistema dall'incubatrice. Premere e ruotare il piatto in ceramica in senso antiorario per staccarlo dalla piastra di base.

Successivamente, trasferire in modo asettico i vetrini coprioggetti trattati e di controllo TTFields in piastre di Petri sterili contenenti terreno fresco per un'ulteriore valutazione.