Nuovi metodi per studiare la codifica gustativa

L'obiettivo generale di questi metodi è quello di studiare la codifica gustativa in un semplice mandi-casecsta animale registrando l'attività di più neuroni recettori in vivo, mentre si erogano e si monitorano impulsi di astanti temporizzati con precisione. Questi metodi possono aiutare a rispondere a domande chiave sulla gustazione, come ad esempio il modo in cui gli assaggiatori sono codificati dalle popolazioni di neuroni del recettore gustativo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente registrazioni in vivo per più neuroni gustativi prima, durante e dopo stimoli tatanti.

Le persone che non conoscono questo metodo potrebbero trovarlo difficile perché la procedura di dissezione è complessa. Per questo motivo, speriamo che la dimostrazione visiva del metodo sia utile. Queste tecniche sono state sviluppate da Sam Writer quando era uno studente laureato nel mio laboratorio, insieme ad Alejandra, Kui Sun dimostrerà queste procedure.

Tre giorni dopo l'eclosione, scegli una falena di entrambi i sessi che abbia un aspetto generalmente sano. Le ali devono essere completamente estese e la proboscide e le antenne devono essere ben formate e intatte. In una cappa aspirante, inserire la falena selezionata in un tubo di contenimento fino a quando la testa non è esposta.

Quindi, immobilizzare la falena inserendo della carta velina nell'altra estremità del tubo. Ora, utilizzando l'aria pressurizzata erogata da una siringa, rimuovere i capelli dalla testa esposta. Quindi, posizionare il tubo su una piattaforma di argilla in una capsula di Petri.

Orientare la testa con il lato dorsale rivolto verso l'alto. Successivamente, proteggi le antenne e la proboscide. Per prima cosa, crea coperchi per ogni struttura con puntali per pipette da 200 microlitri tagliati in lunghezze di mezzo centimetro.

Per manipolare la proboscide, preparare un gancio da un pezzo di filo. Estendere la proboscide in una delle coperture fino a proteggere la parte più prossimale della proboscide. Fissare il tubo alla parte dorsale della capsula della testa utilizzando cera batik solida.

Quindi, copri accuratamente le antenne e fissa i tubi con cera batik. Ora, stabilizza il cervello tagliando il muscolo compressore della fibbia. Sotto il microscopio di dissezione, utilizzare strumenti di microdissezione per aprire la capsula della testa praticando un piccolo taglio appena sotto la proboscide.

Per confermare che il muscolo è tagliato, offrire una soluzione di saccarosio ai due terzi distali della proboscide e per cinque minuti assicurarsi che la proboscide non si estenda. Quindi, chiudere la capsula della testa utilizzando uno strato di cera batik fusa. Per perfondere il cervello con soluzione fisiologica, costruisci una coppa di cera attorno al lato ventrale della testa.

Usando una ceretta elettrica, inizia a costruire una coppa di cera lungo la parte anteriore della testa spostandoti verso la parte posteriore. Conservare i tubi della proboscide e delle antenne all'interno della coppetta. Continua a costruire la coppetta verso l'esterno e verso l'alto fino a raggiungere il livello degli occhi.

Usando una pinza, prendi i palpi labiali e attaccali alla coppa della cera usando cera fusa. Quindi, sigilla eventuali aperture nella tazza della cera e nei tubi usando uno strato di cosa su resina epossidica binaria. Mescolare la resina epossidica usando uno stuzzicadenti.

Per prima cosa, copri le superfici esterna e interna della coppetta. In secondo luogo, riempire la parte del tubo di contenimento che circonda il collo in modo che la testa sia tenuta più saldamente. Dopo 20 minuti, controllare che la tazza non presenti perdite.

Per iniziare l'intervento chirurgico al cervello, prima tagliare i palpi labiali. Per aprire il lato ventrale della capsula cranica, tagliare la cuticola lungo la parte posteriore e anteriore della testa e intorno agli occhi. Quindi, taglia lungo la parte posteriore della testa e fai altri tagli lungo la parte anteriore della testa vicino alla proboscide.

Quindi, sollevare delicatamente il lembo della cuticola con una pinza per esporre il cervello. Ora, esegui il passaggio più critico, esponendo la ZES e i nervi mascellari. Rimuovere lentamente e con attenzione il tessuto adiposo e la trachea.

Sciacquare frequentemente il cervello con soluzione salina fresca. Fai molta attenzione, perché è molto facile schiacciare i nervi mascellari. Quando la ZES e i nervi mascellari saranno finalmente visibili, saranno coperti da una sottile guaina.

Per rimuovere questa guaina, drenare l'eccesso di soluzione salina e quindi indebolire la guaina applicando una soluzione di collagenasi dispasi al 10%. Dopo l'ammollo per cinque minuti, sciacquare più volte la soluzione con soluzione fisiologica. Quindi, dopo diversi risciacqui con soluzione fisiologica, rimuovere delicatamente la guaina utilizzando una pinza per microdissezione superfine.

Infine, fissare un'ala gocciolante salina nella tazza di perfusione. Questa sezione descrive come costruire e utilizzare un sistema di somministrazione di tastants. Il sistema è costituito da una provetta con diverse aperture.

Le aperture forniscono l'ingresso per la proboscide dell'animale, il collettore dei tastanti, un sensore di colore e consentono il passaggio dell'acqua. Per costruire questo sistema, preparare prima una provetta per la proboscide. Fai un foro delle dimensioni di una proboscide usando un saldatore.

Quindi, costruire una sezione schermata all'interno del tubo per tenere la proboscide in posizione. Taglia cinque millimetri sopra il foro, posiziona la rete lì con la cera e ricollega i tubi usando cera e resina epossidica. Utilizzare un sistema di perfusione pressurizzato per erogare i sapori.

Unire tutti i tubi tastant necessari a un collettore. Per collegare il tubo di uscita tastant, praticare un foro a circa un centimetro sopra la rete, quindi fissare il tubo di uscita ad esso con resina epossidica. In ogni tastant, includere un colorante artificiale che deve essere rilevato da un sensore di colore.

Collegare un sensore di colore all'apparecchio in un foro di mezzo centimetro intorno alla rete e fissarlo lì utilizzando resina epossidica. Utilizzare una pompa peristaltica per erogare acqua distillata nel sistema tramite tubi in silicone. Raccogliere le acque reflue con un grande contenitore.

Utilizzare una pompa pneumatica per erogare i sapori con sbuffi d'aria. Ora, inizia a pompare acqua pulita attraverso il tubo ed eroga impulsi di tastant per testare il sensore di colore. Ora, carica il distillato di due terzi della proboscide della falena nella provetta.

Usando una pinza, estendi la proboscide e spingila delicatamente nel foro. Quindi, sigillare la proboscide in posizione con cera dentale morbida e uno strato di resina epossidica. A questo punto, collegare la linea di perfusione salina e impostare il flusso di perfusione.

Quindi, immergere l'elettrodo di terra del tetrodo a filo intrecciato nel bagno salino. Quindi, utilizzando un micromanipolatore, posizionare il tetrodo accanto al nervo mascellare e farlo avanzare lentamente nel nervo. Dopo aver rilevato i segnali di picco, lasciare che la preparazione si stabilizzi per almeno 10 minuti prima di effettuare le registrazioni.

Le registrazioni sono state effettuate dai neuroni del recettore gustativo prima, durante e dopo la somministrazione tastant utilizzando il protocollo descritto. L'inizio e l'offset di un impulso di un secondo di ciascun tastant sono stati monitorati dal sensore di colore. I sapori hanno suscitato picchi che sono stati rilevati da ciascuno dei quattro canali.

All'interno dei treni spike, si potevano osservare potenziali d'azione individuali. Il software di smistamento delle punte è stato utilizzato per assegnare queste punte a neuroni unici. La risposta di tre diversi neuroni del recettore gustativo a sei astanti somministrati in sequenza rivela diversi livelli di attività basale e selettività per i tastanti.

Inoltre, le risposte hanno avuto tempi diversi. Alcuni sono bloccati alla durata dello stimolo, mentre altri durano più a lungo dello stimolo. Le registrazioni intracellulari potrebbero anche essere effettuate dagli assoni del recettore gustativo utilizzando elettrodi di vetro affilati convenzionali.

Le registrazioni intracellulari erano molto simili alle risposte osservate utilizzando la tecnica del tetrodo descritta, ma le registrazioni del tetrodo erano più facili da effettuare, più durature e più robuste. Dopo aver visto questo video, dovresti essere in grado di esporre i nervi mascellari e la zona sotto-esofagea nella mandi-casecsta ed essere in grado di costruire un sistema di rilascio tastant con un controllo temporale preciso. Durante l'esecuzione di questo protocollo, indossare guanti di sicurezza da laboratorio e una maschera facciale perché il pelo in scaglie polverose fine di mandi-casecsta può essere allergenico.

Una volta padroneggiata, questa procedura può essere completata in tre ore e mezza. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire registrazioni simultanee da più aree cerebrali per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio come le risposte dei neuroni del recettore gustativo ai denti vengono trasformate quando vengono trasmesse ai neuroni bersaglio postsinaptici.