Nuovi metodi per studiare la codifica gustativa
29 giugno 2017
Presentiamo tre nuovi metodi per studiare la codifica gustativa . Utilizzando un animale semplice, la falena Manduca sexta ( Manduca ) , descriviamo un protocollo di dissezione, l'uso di tetrodes extracellulari per registrare l'attività di molti neuroni gastatoriali e un sistema per la consegna e il monitoraggio di impulsi precisi di tastanti.
L'obiettivo generale di questi metodi è studiare la codifica del gusto in un animale semplice, mandi-casecsta, registrando l'attività di molteplici neuroni recettori in vivo, mentre vengono somministrati e monitorati impulsi di sostanze sapide con tempistiche precise. Questi metodi possono contribuire a rispondere a domande fondamentali sulla gustazione, ad esempio in che modo i sapori vengono codificati da popolazioni di neuroni recettori del gusto. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente registrazioni in vivo di più neuroni gustativi prima, durante e dopo stimoli sapidi somministrati con precisione.
Coloro che si approcciano per la prima volta a questo metodo potrebbero trovarlo impegnativo poiché la procedura di dissezione è complessa. Per questo motivo, speriamo che la dimostrazione visiva del metodo si riveli utile. Queste tecniche sono state sviluppate da Sam Writer quando era studente laureando nel mio laboratorio, insieme ad Alejandra; Kui Sun mostrerà queste procedure.
Tre giorni dopo l'eclosione, scegliere una falena di uno dei due sessi che presenti un aspetto generalmente sano. Le ali devono essere completamente estese e il rostro e le antenne devono essere ben formati e integri. In una cappa aspirante, inserire la falena selezionata in un tubo di contenimento finché la testa non sia esposta.
Quindi, immobilizzare la farfalla inserendo della carta assorbente nell'altra estremità del tubo. Ora, utilizzando aria compressa erogata da una siringa, rimuovere i peli dalla testa esposta. Successivamente, posizionare il tubo su una piattaforma di argilla all'interno di una piastra di Petri.
Orientare la testa con il lato dorsale verso l'alto. Successivamente, proteggere le antenne e il rostro. Per prima cosa, realizzare delle protezioni per ciascuna struttura utilizzando le punte di pipetta da 200 microlitri tagliate in segmenti lunghi mezzo centimetro.
Per manipolare il proboiscide, preparare un uncino da un pezzo di filo metallico. Estendere il proboiscide in una delle coperture fino a quando la parte più prossimale del proboiscide è protetta. Fissare il tubo alla parte dorsale della capsula cefalica utilizzando cera per batik resistente.
Successivamente, posizionare con attenzione le antenne e fissare i tubi con cera per batik. Ora, stabilizzare il cervello recidendo il muscolo compressore del fibbia. Sotto il microscopio per dissezione, utilizzare strumenti per microdissezione per aprire la capsula cefalica effettuando un piccolo taglio appena al di sotto del proboiscide.
Per verificare che il muscolo sia stato reciso, offrire una soluzione di saccarosio ai due terzi distali del proboiscide e assicurarsi che il proboiscide non si estenda per cinque minuti. Successivamente, chiudere la capsula cefalica utilizzando uno strato di cera per batik fusa. Per perfondere il cervello con soluzione salina, costruire una coppa di cera attorno alla faccia ventrale della testa.
Utilizzando un cerettaio elettrico, iniziare a costruire una coppa di cera lungo la parte anteriore della testa, spostandosi verso la parte posteriore. Mantenere i tubi del rostro e delle antenne all'interno della coppa. Continuare ad ampliare la coppa verso l'esterno e verso l'alto fino a raggiungere il livello degli occhi.
Utilizzando pinzette, prendere i palpi labiali e fissarli al bicchiere di cera mediante cera fusa. Successivamente, sigillare eventuali aperture nel bicchiere di cera e nei tubi applicando uno strato sottile di epoxido binario. Mescolare l'epoxido con un bastoncino di legno.
Prima, coprire le superfici esterna e interna della coppetta. In secondo luogo, riempire la parte del tubo di contenimento che circonda il collo in modo che la testa sia mantenuta più saldamente. Dopo 20 minuti, verificare la presenza di perdite nella coppetta.
Per iniziare l'intervento chirurgico sul cervello, rimuovere innanzitutto i palpi labiali. Per aprire la superficie ventrale della capsula cefalica, tagliare il tegumento lungo la parte posteriore e anteriore della testa e intorno agli occhi. Successivamente, tagliare lungo la parte posteriori della testa ed effettuare ulteriori incisioni nella parte anteriore vicino al proboiscide.
Quindi, sollevare delicatamente con una pinzetta il lembo di cuticola per esporre il cervello. Ora, eseguire il passaggio più critico: esporre la zona subesofagea (SEZ) e i nervi masseterini. Rimuovere lentamente e con attenzione il tessuto adiposo e la trachea.
Sciacquare frequentemente il cervello con soluzione salina fresca. Prestare molta attenzione, poiché è molto facile schiacciare i nervi mascellari. Quando infine la SEZ e i nervi mascellari diventano visibili, saranno ricoperti da una sottile guaina.
Per rimuovere questa guaina, drenare qualsiasi eccesso di soluzione salina e quindi indebolire la guaina applicando una soluzione di collaghenasi-dispasi al 10%. Dopo un'immersione di cinque minuti, risciacquare più volte la soluzione con soluzione salina. Successivamente, dopo diversi risciacqui con soluzione salina, rimuovere delicatamente la guaina utilizzando pinzette per microdissezione superfini.
Infine, fissare una linea di gocciolamento salino nella coppetta di perfusione. Questa sezione descrive come costruire e utilizzare un sistema di somministrazione di sostanze sapide. Il sistema è costituito da un tubo di prova con diverse aperture.
Le aperture permettono l'ingresso della proboscide dell'animale, del manifold per gli stimoli gustativi, di un sensore di colore e consentono il flusso d'acqua. Per costruire questo sistema, preparare innanzitutto un tubo di prova per la proboscide. Realizzare un foro delle dimensioni della proboscide utilizzando un saldatore.
Quindi, costruire una sezione schermata all'interno del tubo per mantenere il proboscide in posizione. Tagliare di cinque millimetri sopra il foro, posizionare la maglia in quel punto con della cera e ricollegare i tubi utilizzando cera ed epossidico. Utilizzare un sistema di perfusione pressurizzato per somministrare gli agenti gustativi.
Collegare al collettore tanti tubi di stimolo gustativo quanti necessari. Per collegare il tubo di uscita dello stimolo gustativo, praticare un foro a circa un centimetro sopra la rete metallica, quindi fissare saldamente il tubo di uscita al foro con dell'epossidico. In ciascuno stimolo gustativo, aggiungere un colorante artificiale da rilevare mediante un sensore di colore.
Collegare un sensore di colore all'apparato in un foro situato a circa mezzo centimetro sopra la rete, e fissarlo in posizione utilizzando una resina epossidica. Utilizzare una pompa peristaltica per immettere acqua distillata nel sistema attraverso un tubo di silicone. Raccogliere l'acqua di scarico in un contenitore di grandi dimensioni.
Utilizzare una pompa pneumatica per somministrare gli stimoli gustativi mediante getti d'aria. Ora, iniziare a pompare acqua pulita attraverso i tubi e somministrare impulsi di stimolo gustativo per verificare il sensore di colore. Successivamente, inserire i due terzi distali del pungiglione della farfalla nel tubo di prova.
Utilizzando una pinzetta, estendere il rostro e spingerlo delicatamente nel foro. Quindi, sigillare il rostro in posizione con cera dentale morbida e uno strato di resina epossidica. A questo punto, collegare la linea di perfusione della soluzione salina e impostare il flusso di perfusione.
Successivamente, immergere l'elettrodo di terra della tetrodo in filo intrecciato nel bagno salino. Quindi, utilizzando un micromanipolatore, posizionare la tetrodo accanto al nervo mascellare e avanzarla lentamente all'interno del nervo. Dopo aver rilevato segnali di potenziali d'azione, lasciare che il preparato si stabilizzi per almeno 10 minuti prima di iniziare le registrazioni.
Le registrazioni sono state effettuate da neuroni recettori del gusto prima, durante e dopo la somministrazione del tastante utilizzando il protocollo descritto. L'inizio e la fine di un impulso di un secondo per ciascun tastante sono stati monitorati dal sensore di colore. I tastanti hanno provocato potenziali d'azione che sono stati rilevati da ciascuno dei quattro canali.
All'interno dei treni di impulsi, era possibile osservare singoli potenziali d'azione. Un software di classificazione degli impulsi è stato utilizzato per assegnare questi impulsi a neuroni unici. La risposta di tre diversi neuroni recettoriali del gusto a sei sostanze sapide somministrate in sequenza rivela diversi livelli di attività basale e selettività verso le sostanze sapide.
Inoltre, le risposte presentavano tempistiche diverse. Alcune erano sincronizzate con la durata dello stimolo, mentre altre persistevano oltre lo stimolo. Registrazioni intracellulari potevano inoltre essere effettuate dagli assoni dei recettori del gusto utilizzando elettrodi convenzionali in vetro appuntiti.
Le registrazioni intracellulari erano molto simili alle risposte osservate utilizzando la tecnica con tetrodo descritta, ma le registrazioni con tetrodo erano più facili da effettuare, più durature e più robuste. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe essere in grado di esporre i nervi mascellari e la zona subesofagea nel mandi-casecsta, e di costruire un sistema di somministrazione di sostanze gustative con un controllo temporale preciso. Durante l'esecuzione di questo protocollo, indossare guanti di sicurezza per laboratorio e una mascherina facciale poiché la polvere fine derivante dalle squame disperse dal mandi-casecsta può essere allergenica.
Una volta padroneggiata, questa procedura può essere completata in tre ore e mezza. Seguendo questa procedura, è inoltre possibile effettuare registrazioni simultanee da più aree cerebrali per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio, in che modo le risposte dei neuroni recettori del gusto ai tastanti vengono trasformate quando vengono trasmesse ai neuroni postsinaptici bersaglio.
Panoramica
In questo articolo vengono presentati tre nuovi metodi per lo studio della codifica del gusto nella falena Manduca sexta. Le tecniche comprendono un protocollo di dissezione, registrazioni extracellulari con tetrodi dei neuroni recettoriali del gusto e un sistema per la somministrazione e il monitoraggio di stimoli gustativi.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia del Comportamento
- Elettrofisiologia
Sfondo
- Comprendere il codice gustativo è fondamentale per ottenere informazioni sui processi sensoriali.
- La falena Manduca sexta rappresenta un organismo modello semplice per questi studi.
- La registrazione da più neuroni recettoriali del gusto può chiarire come le informazioni gustative vengano codificate.
- Una somministrazione precisa dei sostanze sapide è essenziale per ottenere risultati sperimentali accurati.
Scopo dello studio
- Sviluppare metodi per la registrazione in vivo di neuroni gustativi.
- Indagare come gli stimoli di sapore vengano codificati da popolazioni di neuroni recettoriali gustativi.
- Fornire una dimostrazione visiva delle tecniche di dissezione e registrazione.
Metodi Utilizzati
- Protocollo di dissezione per preparare la farfalla notturna per le registrazioni neurali.
- Utilizzo di tetrodi extracellulari per registrare l'attività neuronale.
- Sistema per erogare e monitorare impulsi temporizzati di sostanze gustative.
- Strumenti visivi per assistere nuovi ricercatori nel complesso processo di dissezione.
Risultati principali
- Registrazioni in vivo riuscite da più neuroni recettori del gusto.
- Dimostrata l'efficacia del sistema di somministrazione degli stimoli gustativi.
- Forniti spunti sul codificare dell'informazione gustativa.
- Evidenziati le difficoltà e le soluzioni nel processo di dissezione.
Conclusioni
- I metodi sviluppati sono preziosi per lo studio della codifica del gusto.
- Le registrazioni in vivo possono migliorare la comprensione dell'elaborazione del gusto.
- La ricerca futura può basarsi su queste tecniche per esplorare ulteriormente la gustazione.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Comprendere i meccanismi di codifica gustativa fornisce informazioni fondamentali per la validazione degli obiettivi nella scoperta di farmaci nel campo delle neuroscienze, in particolare per composti che modulano il comportamento alimentare o le vie metaboliche. La capacità di registrare risposte neuronali a livello di popolazione in vivo supporta la riduzione del rischio meccanicistico, collegando interventi molecolari a uscite neurali funzionali. Questi metodi permettono di ottenere una previsione affidabile nelle fasi iniziali della scoperta, quantificando come i sapori vengano codificati attraverso popolazioni di neuroni recettoriali gustativi prima dell'elaborazione del segnale a valle.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche collegando l'identità e la concentrazione di un sapido a specifici modelli di attività elettrica nelle popolazioni di neuroni recettori del gusto.
- Valore operativo: Favorisce la riduzione del rischio biologico mediante la misurazione diretta in vivo delle risposte neuronali prima, durante e dopo la somministrazione dello stimolo, chiarificando l'interazione con il bersaglio nei percorsi sensoriali.
- Valore scientifico: Facilita la caratterizzazione del percorso rivelando come i singoli neuroni contribuiscano alla codifica a livello di popolazione, supportando la selezione di bersagli per la modulazione di comportamenti legati all'alimentazione.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per la standardizzazione dei saggi, consentendo la registrazione extracellulare consistente di più neuroni recettoriali del gusto mediante l'uso di array a tetrodo.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità del saggio attraverso un controllo temporale preciso della somministrazione dei tastanti e un monitoraggio in tempo reale tramite retroazione del sensore cromatico, riducendo la variabilità nella presentazione dello stimolo.
- Valore scientifico: Consente la predisposizione per lo screening generando uscite quantificabili di sequenze di impulsi che possono essere classificate per identificare le risposte di singoli neuroni, supportando una valutazione affidabile dei composti negli studi sulla modulazione del gusto.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Supporta la continuità traslazionale collegando l'attività dei neuroni recettori del gusto in vivo all'elaborazione cerebrale successiva, consentendo di valutare come i segnali sensoriali vengano trasformati nei bersagli postsinaptici.
- Valore operativo: Affronta decisioni di avanzamento corrette per il rischio fornendo profili di risposta neuronale di base che possono essere utilizzati per rilevare alterazioni indotte da composti nella fedeltà di codifica.
- Valore scientifico: Si concentra sulla riduzione predittiva del rischio distinguendo tra risposte neuronali sincronizzate allo stimolo e risposte sostenute, aiutando a differenziare gli effetti sensoriali diretti dalle adattamenti secondari della rete.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dal test delle ipotesi nella fase iniziale della scoperta all'identificazione del composto attivo e alla validazione preclinica, in particolare per bersagli coinvolti nella segnalazione chemiosensoriale e nella regolazione del comportamento alimentare.
- Biologia della Scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi consentendo ai ricercatori di determinare come specifici tastanti vengano codificati da popolazioni definite di neuroni recettori del gusto, chiarificando gli intervalli recettivi molecolari.
- Screening: Descrive la prontezza del saggio attraverso registrazioni stabili con tetrodi che garantiscono un rilevamento costante degli impulsi elettrici su tutti i canali, permettendo il confronto delle risposte neuronali in diverse condizioni.
- Analisi: Evidenzia la classificazione degli impulsi come output analitico fondamentale, che assegna i potenziali d'azione a neuroni unici, consentendo di risolvere il contributo individuale alla codifica della popolazione.
- Ricerca Translazionale: Collega il metodo alla continuità preclinica dimostrando come le risposte dei neuroni recettori del gusto si propaghino ai neuroni seguenti nel cervello, fornendo informazioni per la validazione dei bersagli postsinaptici.
- Riutilizzo Aziendale: Presenta il sistema di registrazione basato su tetrodi come una piattaforma riutilizzabile per studi longitudinali, poiché le registrazioni sono più durature e robuste rispetto ai metodi con microelettrodi intracellulari.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo l'ambiguità meccanicistica nella rappresentazione dell'identità e della concentrazione dei sapori nei modelli di attività neuronale.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione e la scalabilità grazie a una preparazione perfondibile che consente registrazioni ripetute e il monitoraggio simultaneo di più aree.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di tipo go/no-go fornendo letture neurali oggettive e quantificabili che correlano la somministrazione dei sapori con esiti elettrofisiologici, riducendo la dipendenza esclusiva da indicatori comportamentali.
- Impatto sul portafoglio: Informa la priorizzazione corretta rispetto al rischio identificando composti che alterano la fedeltà della codifica gustativa, consentendo un rilevamento precoce di effetti sensoriali fuori bersaglio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in dissezione di insetti, microchirurgia ed elettrofisiologia per esporre con successo i nervi masseterini e la zona subesofagea senza danneggiare strutture delicate.
- È dipendente da strumentazione specializzata, inclusi micromanipolatori, tetrodi, sistemi di perfusione e sensori di colore per la somministrazione e il monitoraggio dei tastanti.
- Necessita di una standardizzazione tra i gruppi di lavoro dei protocolli di dissezione e di sigillatura con cera, al fine di garantire una qualità costante dei preparati tra diversi utilizzatori e laboratori.
- Comporta considerazioni di adattamento quando si estende l'approccio ad altri sistemi modello, poiché la disponibilità del nervo masseterino e le tecniche di rimozione della guaina sono specifiche per specie.
- Comprende limitazioni pratiche, come il processo di dissezione complesso e il rischio allergenico derivante dalla farfalla, che richiedono precauzioni di sicurezza e possono limitare la produttività.
