Sezione tecnica del Patch Clamp per l'analisi di plasticità indotta su apprendimento
11 novembre 2017
La tecnica del patch clamp fetta è un metodo efficace per analizzare i cambiamenti indotti dall'apprendimento nella proprietà intrinseche e plasticità delle sinapsi eccitatorie o inibitorie.
Ciao, mi chiamo Dai Mitsushima. Qui ti mostreremo come realizzare fette di cervello in animali addestrati confrontando i dati del patch clamp in animali non addestrati. Possiamo analizzare la plasticità sinaptica indotta dall'apprendimento.
Ciao, mi chiamo Hiroyuki Kida. In questo esperimento, abbiamo studiato il neuromeccanismo del funzionamento del motore utilizzando il test dell'asta del rotore. Il test dell'asta del rotore è ampiamente utilizzato per valutare la cognizione motoria dei roditori.
Il vantaggio di questo metodo è che possiamo modificare il livello di scoperta durante il test aumentando la velocità del rotatore. Prova dell'asta del rotore. Prima dell'attività del motore, l'apparato dell'asta del rotore deve essere impostato in modalità di accelerazione da 4 a 40 giri/min in 300 secondi.
I ratti sono stati costretti a eseguire dieci tentativi per ogni test. L'intervallo di tempo tra i tentativi era di 30 secondi. Durante la prima sessione di allenamento, i ratti di solito cadono dall'asta, anche a basse velocità e talvolta camminano nella direzione sbagliata.
Dopo aver ripetuto l'allenamento, tuttavia, il ratto può camminare a una velocità maggiore. Misurando la latenza sull'asta, possiamo stimare le prestazioni di apprendimento dell'abilità da parte del ratto. Qui possiamo vedere i risultati del test dell'asta del rotore.
Come mostrato in questa figura, due giorni di allenamento sono sufficienti per acquisire la capacità motoria. Rispetto alla latenza della prima prova, l'analisi post hoc ha mostrato un miglioramento significativo nella prova finale dei giorni di formazione. Misurando la latenza sull'asta, possiamo stimare le prestazioni di apprendimento dell'abilità da parte del ratto.
Successivamente, ti mostreremo un test di evitamento inibitorio. Questo test è utile per analizzare le prestazioni dell'apprendimento contestuale. L'apparato di evitamento inibitorio è costituito da lati chiari e scuri separati da una botola.
Durante la sessione di addestramento, i ratti vengono posizionati nell'area illuminata e viene dato loro un breve periodo di tempo per acclimatarsi all'ambiente. Una volta che la porta si apre, i ratti sono liberi di entrare nell'area buia a piacimento. Entrando nell'area buia, la porta viene chiusa e ai ratti viene somministrata una leggera scossa elettrica per due secondi.
Dopo essere stati riportati nelle loro gabbie per 30 minuti al termine della prova, i ratti vengono posti nuovamente nell'area illuminata dell'apparato. Trenta minuti dopo lo shock, i ratti addestrati hanno costantemente mostrato una latenza più lunga prima di entrare nell'area oscura. Qui possiamo vedere i risultati del test di evitamento inibitorio.
Dopo la scossa elettrica, i ratti hanno imparato a evitare l'area buia e a rimanere sul lato illuminato, cosa che normalmente non preferirebbero. Questa tendenza ad evitare il lato oscuro indica l'acquisizione di memorie contestuali. Fette di cervello post-allenamento.
Prima dell'incisione, raffreddiamo tutte le forbici, gli emostatici e i bicchieri con ghiaccio tritato. Qui puoi vedere la nostra preparazione per la dissezione. La dissezione cerebrale deve essere eseguita il più rapidamente possibile.
Dopo questo anestetizzato profondamente, il ratto viene posto in un vassoio poco profondo con ghiaccio tritato e viene praticata un'incisione per aprire la cavità addominale. Dopo l'incisione del diaframma, viene praticata un'ulteriore incisione laterale. Per aprire la cavità toracica, la cartilagine costale deve essere chiusa a grumi utilizzando un emostato.
Dopo aver esposto il cuore, un ago in acciaio inossidabile calibro 18 viene inserito nella parte posteriore del ventricolo sinistro. La punta dell'ago dovrebbe essere visibile attraverso la parete dell'aorta. Dopo aver tagliato il padiglione auricolare destro, inizia la perfusione.
Assicurarsi che sia l'ago che la siringa siano prima riempiti con un tampone di dissezione ghiacciato gassato. Anche eventuali bolle d'aria devono essere rimosse prima della perfusione. Per prima cosa, taglia nella parte posteriore del cranio.
Quindi fai un taglio laterale, seguito da un taglio centrale per esporre il cervello. Dopo la dissezione, il cervello deve essere posto in un tampone ghiacciato per cinque minuti. Prima di procedere con la dissezione, la carta da filtro deve essere bagnata con un tampone ghiacciato.
Quindi, il cervello viene posto su un palco ghiacciato in acciaio inossidabile. L'angolo della fase di taglio è fondamentale per garantire un angolo di taglio corretto per la fetta di cervello. Un angolo errato potrebbe potenzialmente tagliare i neuroni piramidali bersaglio.
Dopo il taglio, una goccia di supercolla deve essere posizionata sul palco del vibratone. Per garantire una forte adesione, il tampone di dissezione in eccesso deve essere rimosso utilizzando un pezzo di carta da filtro. Usando il vibratone, è possibile preparare sottili fette di cervello mantenute in un tampone ghiacciato gorgogliante.
La nostra area target è la corteccia motoria primaria. L'area cerebrale bersaglio può essere tagliata via usando le forbici dell'iride. La camera di interfaccia può essere realizzata utilizzando un contenitore per alimenti in plastica.
Il coperchio della camera di interfaccia è necessario per contenere il gas. Le fette vengono osservate utilizzando un microscopio DIC a infrarossi. Qui possiamo vedere un esempio di neuroni di livello 2/3 nella corteccia motoria primaria.
Le pipette per la registrazione dei cerotti vengono riempite con la soluzione intracellulare appropriata. La soluzione per l'analisi della pinza amperometrica è diversa dall'analisi della pinza amperometrica. Risultati rappresentativi.
La tecnica del current clamp è utile per analizzare le proprietà intrinseche delle celle. Dopo l'addestramento con l'asta del rotore, siamo stati in grado di ottenere i dati del morsetto di corrente dai neuroni di livello 2/3 nella corteccia motoria primaria. Il pannello A indica le tracce tipiche indotte dalle iniezioni di corrente.
Il pannello B indica la relazione tra la corrente iniettata e il numero di picchi. I ratti addestrati per un giorno hanno indotto meno picchi, mentre i ratti addestrati per due giorni hanno indotto molti più picchi rispetto ai ratti non addestrati. Come si può vedere nei pannelli inferiori, i ratti addestrati per un giorno hanno mostrato un potenziale di riposo inferiore, una soglia di picco più alta e una post-iperpolarizzazione più profonda.
I ratti addestrati per due giorni hanno mostrato un maggiore potenziale di riposo e resistenza alla membrana. La tecnica del voltage clamp è utile per analizzare la plasticità sinaptica indotta dall'apprendimento. Qui possiamo vedere i dati dei neuroni CA1 dopo l'addestramento contestuale.
Abbiamo ottenuto correnti postsinaptiche in miniatura da neuroni CA1 indotte da singole vescicole di glutammato o GABA. I pannelli A e B mostrano tracce rappresentative di corrente postsinaptica in miniatura. In presenza di tetrodotossina, le EPSC in miniatura a meno 16 millivolt e le IPSC in miniatura a zero millivolt sono state misurate in sequenza negli stessi neuroni.
Il pannello C mostra grafici bidimensionali delle ampiezze EPSC in miniatura e IPSC in miniatura in ratti non addestrati, addestrati, non appaiati e walk-through. Il pannello D mostra i grafici per le frequenze in miniatura. Come si può vedere nei pannelli inferiori, i training contestuali hanno rafforzato significativamente sia le sinapsi eccitatorie che quelle inibitorie, promuovendo la diversità degli input sinaptici ai neuroni.
In sintesi, la tecnica del current-clamp è utile per analizzare i cambiamenti indotti dall'apprendimento nelle proprietà delle celle. Inoltre, la tecnica del voltage-clamp è un potente strumento per analizzare la plasticità indotta dall'apprendimento nelle sinapsi eccitatorie e inibitorie. I risultati dettagliati di queste analisi sono disponibili nelle seguenti pubblicazioni.
Panoramica
Questo articolo dimostra la tecnica del slice patch clamp per analizzare i cambiamenti indotti dall'apprendimento nelle proprietà sinaptiche e nella plasticità. Lo studio si concentra sulla cognizione motoria e sull'apprendimento contestuale nei ratti addestrati.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienza
- Eletrofisiologia
- Analisi comportamentale
Sfondo
- La tecnica del slice patch clamp è cruciale per studiare la funzione sinaptica.
- La cognizione motoria può essere valutata utilizzando il test del rotor rod.
- L'apprendimento contestuale viene valutato attraverso test di evitamento inibitorio.
- Comprendere la plasticità sinaptica è essenziale per acquisire informazioni sui meccanismi dell'apprendimento.
Obiettivo dello studio
- Analizzare la plasticità sinaptica indotta dall'apprendimento nei ratti.
- Confrontare le proprietà sinaptiche tra animali addestrati e non addestrati.
- Indagare il neuromeccanismo della corsa motoria.
Metodi utilizzati
- Test del rotor rod per valutare l'acquisizione di abilità motorie.
- Test di evitamento inibitorio per l'analisi della memoria contestuale.
- Preparazione di fette cerebrali e registrazioni patch clamp.
- Tecniche di clamp di corrente e tensione per analizzare l'attività sinaptica.
Risultati principali
- Due giorni di addestramento hanno migliorato significativamente le prestazioni delle abilità motorie.
- I ratti addestrati hanno mostrato proprietà sinaptiche migliorate rispetto ai ratti non addestrati.
- I dati del clamp di corrente hanno mostrato un'attività di picco aumentata nei ratti addestrati.
- I risultati del clamp di tensione hanno indicato cambiamenti nelle correnti postsinaptiche miniature.
Concludenze
- Lo studio conferma l'efficacia della tecnica del slice patch clamp.
- L'addestramento migliora sia le abilità motorie che la plasticità sinaptica.
- Queste scoperte contribuiscono alla comprensione della base neurale dell'apprendimento.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
The slice patch clamp technique enables direct measurement of learning-induced changes in neuronal excitability and synaptic strength, providing mechanistic insights into neural circuit adaptation. This approach supports target validation in neuroscience drug discovery by linking behavioral phenotypes to cellular and synaptic phenotypes. It enhances predictive confidence in early discovery by de-risking hypotheses about compound effects on plasticity-related pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring changes in resting membrane potential, spike threshold, and membrane resistance in trained versus untrained neurons.
- Scientific Value: Clarifies pathway involvement by demonstrating learning-induced increases in spiking activity in layer II/III pyramidal neurons of motor cortex.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by quantifying synaptic plasticity at both excitatory and inhibitory synapses in hippocampal CA1 neurons following contextual learning.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems (acute brain slices) for downstream assessment of compound effects on intrinsic and synaptic neuronal properties.
- Scientific Value: Enables assay standardization through sequential recording of mEPSCs and mIPSCs from the same neuron, reducing variability in synaptic strength measurements.
- Scientific Value: Provides quantitative outputs (amplitude, frequency of postsynaptic currents) that support reliable compound evaluation in phenotypic screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates disease-relevant system utility by modeling learning-induced plasticity in motor cortex and hippocampus, regions relevant to cognitive and motor disorders.
- Scientific Value: Ensures translational continuity from behavioral training (rotor rod, inhibitory avoidance) to cellular readouts, supporting mechanism-based target validation.
- Scientific Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by identifying compounds that normalize learning-induced hyperactivity or synaptic imbalance.
Pipeline & Workflow Integration
The technique integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification, particularly for targets modulating neuronal excitability or synaptic transmission.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by comparing neuronal properties between behaviorally trained and naive animals to validate target engagement.
- Screening: Delivers assay readiness via stable, reproducible whole-cell patch clamp recordings in acute slices, enabling dose-response analysis of test compounds.
- Analytics: Generates key readouts including spike count, resting potential, membrane resistance, and mEPSC/mIPSC amplitude/frequency to quantify neuronal and synaptic responses.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by linking learning-induced synaptic changes to potential biomarkers of circuit dysfunction in neuropsychiatric disease models.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable electrophysiology platform applicable across brain regions (e.g., sensory cortex, amygdala) and learning paradigms, maximizing asset utilization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in how learning alters neuronal and synaptic function.
- Operational Value: Promotes standardization through defined slice preparation, perfusion, and recording protocols that enhance reproducibility across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing direct electrophysiological evidence of target-mediated effects on plasticity pathways.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds that reverse pathological plasticity without disrupting baseline function.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, brain slicing, and behavioral neuroscience to ensure data quality and interpretation.
- Dependent on instrumentation including vibratomes, patch clamp amplifiers, perfusion systems, and infrared-DIC microscopy for successful slice preparation and recording.
- Necessitates cross-team standardization between behavior, histology, and electrophysiology groups to align training paradigms with slice timing and region targeting.
- Involves adaptation considerations when applying the technique to different brain regions or neuron types, such as adjusting slice orientation or intracellular solution composition.
- Limited by the acute nature of brain slices, which restricts longitudinal studies but preserves native circuitry for ex vivo mechanistic analysis.
