Sezione tecnica del Patch Clamp per l'analisi di plasticità indotta su apprendimento
11 novembre 2017
La tecnica del patch clamp fetta è un metodo efficace per analizzare i cambiamenti indotti dall'apprendimento nella proprietà intrinseche e plasticità delle sinapsi eccitatorie o inibitorie.
Ciao, mi chiamo Dai Mitsushima. Qui vi mostreremo come preparare sezioni cerebrali in animali addestrati confrontando i dati di patch clamp ottenuti in animali non addestrati. Possiamo analizzare la plasticità sinaptica indotta dall'apprendimento.
Ciao, mi chiamo Hiroyuki Kida. In questo esperimento, abbiamo studiato il neuromeccanismo della corsa motoria utilizzando il test del rotorod. Il test del rotorod è ampiamente utilizzato per valutare la cognizione motoria nei roditori.
Il vantaggio di questo metodo è che possiamo modificare il livello di scoperta durante il test aumentando la velocità del rotatore. Test del bastone rotante. Prima dell'esecuzione del compito motorio, l'apparato del bastone rotante deve essere impostato in modalità accelerata da 4 a 40 giri al minuto nell'arco di 300 secondi.
Ai ratti è stato richiesto di effettuare dieci tentativi per ogni test. L'intervallo di tempo tra i tentativi era di 30 secondi. Durante la prima sessione di addestramento, i ratti di solito cadono dalla sbarra, anche a basse velocità, e a volte camminano nella direzione opposta.
Tuttavia, dopo aver ripetuto l'addestramento, il ratto può camminare a una velocità maggiore. Misurando la latenza sulla sbarra, possiamo stimare le prestazioni di apprendimento del ratto nell'acquisizione dell'abilità. Qui possiamo osservare i risultati del test della sbarra rotante.
Come mostrato in questa figura, due giorni di allenamento sono sufficienti per acquisire l'abilità motoria. Rispetto alla latenza del primo tentativo, l'analisi post hoc ha mostrato un miglioramento significativo nell'ultimo tentativo dei giorni di allenamento. Misurando la latenza sul cilindro, possiamo stimare le prestazioni di apprendimento dell'abilità da parte del ratto.
Successivamente, vi mostreremo un test di evitamento inibitorio. Questo test è utile per analizzare le prestazioni nell'apprendimento contestuale. L'apparato per l'evitamento inibitorio è composto da un lato chiaro e un lato scuro, separati da una botola.
Durante la sessione di addestramento, i ratti vengono posizionati nell'area illuminata e lasciati per un breve periodo di tempo per abituarsi all'ambiente. Una volta aperta la porta, i ratti possono entrare liberamente nell'area oscurata. All'ingresso nell'area oscurata, la porta viene chiusa e ai ratti viene somministrato un lieve shock elettrico della durata di due secondi.
Dopo essere stati restituiti alle loro gabbie per 30 minuti al termine della prova, i ratti vengono nuovamente posizionati nell'area illuminata dell'apparato. Trenta minuti dopo lo shock, i ratti addestrati hanno mostrato in modo costante una latenza maggiore prima di entrare nell'area scura. Qui possiamo vedere i risultati del test di evitamento inibitorio.
Dopo lo shock elettrico, i ratti impararono a evitare l'area scura e a rimanere sul lato illuminato, che normalmente non preferirebbero. Questa tendenza a evitare il lato scuro indica l'acquisizione di memorie contestuali. Fettine di cervello post-allenamento.
Prima dell'incisione, raffreddiamo tutti i paia di forbici, pinze emostatiche e becker con ghiaccio tritato. Qui potete vedere il nostro allestimento per la dissezione. La dissezione cerebrale deve essere eseguita il più rapidamente possibile.
Dopo aver anestetizzato profondamente il ratto, questo viene posizionato in un vassoio poco profondo contenente ghiaccio tritato ed viene effettuata un'incisione per aprire la cavità addominale. Dopo l'incisione del diaframma, viene praticata un'ulteriore incisione laterale. Per aprire la cavità toracica, la cartilagine costale deve essere chiusa a pinza utilizzando un emostatico.
Dopo aver esposto il cuore, un ago in acciaio inossidabile da 18 gauge viene inserito nella parte posteriore del ventricolo sinistro. La punta dell'ago deve essere visibile attraverso la parete dell'aorta. Dopo aver tagliato l'auricolo destro, si inizia la perfusione.
Assicurarsi che sia l'ago che la siringa siano prima riempiti con tampone di dissezione gassato e freddo di ghiaccio. Eventuali bolle d'aria devono essere rimosse prima della perfusione. In primo luogo, effettuare un taglio nella parte posteriore del cranio.
Eseguire quindi un taglio laterale, seguito da un taglio centrale per esporre il cervello. Dopo la dissezione, il cervello deve essere collocato in un buffer ghiacciato e gorgogliante per cinque minuti. Prima di proseguire con la dissezione, la carta da filtro deve essere inumidita utilizzando buffer ghiacciato.
Successivamente, il cervello viene posizionato su un piano di acciaio inox raffreddato con ghiaccio. L'angolo del piano di taglio è cruciale per garantire un angolo di sezione corretto del cervello. Un angolo errato potrebbe potenzialmente recidere i neuroni piramidali bersaglio.
Dopo il taglio, una goccia di colla istantanea deve essere posta sulla piastra del vibratomo. Per garantire un'adesione stretta, il buffer di dissezione in eccesso deve essere rimosso utilizzando un pezzo di carta da filtro. Utilizzando il vibratomo, si possono ottenere sottili sezioni cerebrali mantenute in un buffer ghiacciato e gassato.
La nostra area bersaglio è la corteccia motoria primaria. L'area cerebrale bersaglio può essere asportata utilizzando forbici ad iris. La camera di interfaccia può essere realizzata utilizzando un contenitore di plastica per alimenti.
Il coperchio della camera di interfaccia è necessario per contenere il gas. Le sezioni sono osservate utilizzando un microscopio a infrarossi con contrasto di interferenza differenziale (infrared-DIC). Qui possiamo vedere un esempio di neuroni del livello 2/3 della corteccia motoria primaria.
Le pipette per la registrazione in modalità patch vengono riempite con la soluzione intracellulare appropriata. La soluzione per l'analisi in modalità clamp di corrente è diversa da quella per l'analisi in modalità clamp di tensione. Risultati rappresentativi.
La tecnica del blocco della corrente è utile per analizzare le proprietà intrinseche della cellula. Dopo l'addestramento al rotarod, siamo stati in grado di ottenere i dati del blocco della corrente da neuroni del livello 2/3 della corteccia motoria primaria. Il pannello A mostra tracce tipiche indotte da iniezioni di corrente.
Il pannello B mostra la relazione tra la corrente iniettata e il numero di potenziali d'azione. I ratti addestrati per un giorno hanno indotto meno potenziali d'azione, mentre i ratti addestrati per due giorni hanno indotto molti più potenziali d'azione rispetto ai ratti non addestrati. Come si può osservare nei pannelli inferiori, i ratti addestrati per un giorno hanno mostrato un potenziale di riposo più basso, una soglia del potenziale d'azione più alta e un'iperpolarizzazione post-sinaptica più profonda.
I ratti addestrati per due giorni hanno mostrato un potenziale di riposo e una resistenza della membrana più elevati. La tecnica del voltage clamp è utile per analizzare la plasticità sinaptica indotta dall'apprendimento. Qui possiamo osservare i dati ottenuti da neuroni CA1 dopo un addestramento contestuale.
Abbiamo ottenuto correnti postsinaptiche miniature da neuroni CA1 indotte da singole vescicole di glutammato o GABA. I pannelli A e B mostrano tracce rappresentative di corrente postsinaptica miniatura. In presenza di tetrodotossina, gli EPSCs miniatura a meno 16 millivolt e gli IPSCs miniatura a zero millivolt sono stati misurati in sequenza negli stessi neuroni.
Il pannello C mostra grafici bidimensionali delle ampiezze dei potenziali sinaptici eccitatori in miniatura e dei potenziali sinaptici inibitori in miniatura nei ratti non addestrati, addestrati, non accoppiati e sottoposti a walk-through. Il pannello D mostra i grafici delle frequenze in miniatura. Come si può osservare nei pannelli inferiori, gli addestramenti contestuali hanno notevolmente potenziato sia le sinapsi eccitatorie che quelle inibitorie, promuovendo la diversità degli input sinaptici ai neuroni.
In sintesi, la tecnica del "current-clamp" è utile per analizzare i cambiamenti indotti dall'apprendimento nelle proprietà cellulari. Inoltre, la tecnica del "voltage-clamp" è uno strumento potente per analizzare la plasticità indotta dall'apprendimento a livello di sinapsi eccitatorie e inibitorie. I risultati dettagliati di queste analisi sono disponibili nelle seguenti pubblicazioni.
Panoramica
In questo articolo viene illustrata la tecnica del patch clamp su sezioni per analizzare i cambiamenti indotti dall'apprendimento nelle proprietà sinaptiche e nella plasticità. Lo studio si concentra sulla cognizione motoria e sull'apprendimento contestuale in ratti addestrati.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Elettrofisiologia
- Analisi del comportamento
Sfondo
- La tecnica del patch clamp su sezioni è fondamentale per lo studio della funzione sinaptica.
- La cognizione motoria può essere valutata mediante il test del rotorod.
- L'apprendimento contestuale viene valutato attraverso test di evitamento inibitorio.
- Comprendere la plasticità sinaptica è essenziale per ottenere informazioni sui meccanismi dell'apprendimento.
Scopo dello studio
- Analizzare la plasticità sinaptica indotta dall'apprendimento nei ratti.
- Confrontare le proprietà sinaptiche tra animali addestrati e non addestrati.
- Indagare il neuromeccanismo della corsa motoria.
Metodi Utilizzati
- Test del bastone rotante per la valutazione dell'apprendimento delle abilità motorie.
- Test di evitamento inibitorio per l'analisi della memoria contestuale.
- Preparazione di fette cerebrali e registrazioni con tecnica del patch clamp.
- Tecniche di clampaggio della corrente e del voltaggio per analizzare l'attività sinaptica.
Risultati principali
- Due giorni di allenamento hanno migliorato in modo significativo le prestazioni delle abilità motorie.
- I ratti addestrati hanno mostrato proprietà sinaptiche potenziate rispetto ai ratti non addestrati.
- I dati della registrazione in modalità corrente hanno mostrato un aumento dell'attività di spiking nei ratti addestrati.
- I risultati della registrazione in modalità tensione hanno indicato modifiche nelle correnti postsinaptiche miniature.
Conclusioni
- Lo studio conferma l'efficacia della tecnica del patch clamp su sezioni.
- L'allenamento migliora sia le abilità motorie che la plasticità sinaptica.
- Questi risultati contribuiscono alla comprensione della base neurale dell'apprendimento.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La tecnica del patch clamp su sezione consente la misurazione diretta dei cambiamenti indotti dall'apprendimento nell'eccitabilità neuronale e nella forza sinaptica, fornendo informazioni meccanicistiche sull'adattamento dei circuiti neurali. Questo approccio supporta la validazione degli bersagli nella scoperta di farmaci in neuroscienze, collegando fenotipi comportamentali a fenotipi cellulari e sinaptici. Migliora la fiducia predittiva nelle fasi iniziali della scoperta, riducendo i rischi associati alle ipotesi sugli effetti dei composti sui percorsi correlati alla plasticità.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche misurando le variazioni del potenziale di membrana a riposo, della soglia di attivazione del potenziale d'azione e della resistenza di membrana in neuroni allenati rispetto a neuroni non allenati.
- Valore scientifico: Chiarisce il coinvolgimento delle vie neurali dimostrando aumenti dell'attività di scarica nei neuroni piramidali dello strato II/III della corteccia motoria indotti dall'apprendimento.
- Valore scientifico: Supporta la riduzione del rischio biologico quantificando la plasticità sinaptica sia a livello delle sinapsi eccitatorie che inibitorie nei neuroni dell'area CA1 dell'ippocampo dopo un apprendimento contestuale.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati (fette cerebrali acute) per la valutazione successiva degli effetti dei composti sulle proprietà neuronali intrinseche e sinaptiche.
- Valore scientifico: Permette la standardizzazione del saggio mediante la registrazione sequenziale di mEPSCs e mIPSCs dallo stesso neurone, riducendo la variabilità nelle misurazioni della forza sinaptica.
- Valore scientifico: Fornisce output quantitativi (ampiezza, frequenza delle correnti postsinaptiche) che supportano una valutazione affidabile dei composti in campagne di screening fenotipico.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Dimostra l'utilità del sistema in modelli di rilevanza patologica riproducendo la plasticità indotta dall'apprendimento nella corteccia motoria e nell'ippocampo, aree rilevanti per i disturbi cognitivi e motori.
- Valore scientifico: Garantisce una continuità traslazionale dall'addestramento comportamentale (rotarod, evitamento inibitorio) ai riscontri cellulari, favorendo la validazione dei bersagli basata sui meccanismi d'azione.
- Valore scientifico: Facilita decisioni di avanzamento ponderate sui rischi, identificando composti in grado di normalizzare l'iperattività o lo squilibrio sinaptico indotti dall'apprendimento.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
La tecnica si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla verifica delle ipotesi all'identificazione dei composti attivi, in particolare per bersagli che modulano l'eccitabilità neuronale o la trasmissione sinaptica.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi confrontando le proprietà neuronali tra animali addestrati dal punto di vista comportamentale e animali naïve per validare l'interazione con il bersaglio.
- Screening: Garantisce la prontezza del saggio mediante registrazioni stabili e riproducibili con tecnica del patch-clamp in cellula intera su sezioni acute, consentendo l'analisi dose-risposta di composti in esame.
- Analisi: Produce parametri chiave come numero di potenziali d'azione, potenziale di riposo, resistenza della membrana e ampiezza/frequenza di mEPSC/mIPSC per quantificare le risposte neuronali e sinaptiche.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica associando i cambiamenti sinaptici indotti dall'apprendimento a potenziali biomarcatori di disfunzione dei circuiti nei modelli di malattie neuropsichiatriche.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come piattaforma di elettrofisiologia riutilizzabile applicabile a diverse aree cerebrali (ad esempio, corteccia sensoriale, amigdala) e paradigmi di apprendimento, massimizzando l'utilizzo delle risorse.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo l'ambiguità meccanicistica su come l'apprendimento alteri la funzione neuronale e sinaptica.
- Valore operativo: Favorisce la standardizzazione attraverso protocolli definiti di preparazione delle sezioni, perfusione e registrazione, che migliorano la riproducibilità tra laboratori.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di tipo go/no-go fornendo evidenze elettrofisiologiche dirette di effetti mediati dal bersaglio sui percorsi di plasticità.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata al rischio di composti in grado di invertire la plasticità patologica senza alterare la funzione di base.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in elettrofisiologia, sezionamento cerebrale e neuroscienze del comportamento per garantire qualità e interpretazione dei dati.
- Dipende da strumentazione specifica, tra cui vibratomi, amplificatori per patch clamp, sistemi di perfusione e microscopia infrarossa-DIC, necessaria per una corretta preparazione e registrazione dai tessuti sezionati.
- Necessita di standardizzazione tra gruppi diversi, comportamentale, istologico ed elettrofisiologico, per allineare i paradigmi di addestramento con i tempi di preparazione dei tessuti e il targeting delle regioni cerebrali.
- Richiede adattamenti quando la tecnica viene applicata a diverse regioni cerebrali o tipi di neuroni, come la modifica dell'orientamento del taglio o della composizione della soluzione intracellulare.
- È limitata dalla natura acuta dei preparati di tessuto cerebrale, che impedisce studi longitudinali ma consente di preservare la connettività nativa per analisi meccanicistiche ex vivo.
