Un multi-elettrodo patch-clamp Computer System-assistita

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di eseguire registrazioni patch clamp di un massimo di 12 celle in modalità cella intera. Ciò si ottiene contrassegnando prima la posizione di ciascuna cellula di interesse e assegnando una pipetta a ciascuna cellula. Il secondo passaggio consiste nell'individuare la punta di ciascuna pipetta e spostare automaticamente le pipette accanto alle celle assegnate.

Quindi, avvicinatevi a ciascuna cellula con una pipetta alla volta. Per stabilire una tenuta ermetica con la membrana cellulare, il passaggio finale consiste nel rompere la membrana delle cellule ed eseguire registrazioni di intere cellule. In definitiva, la registrazione con patch clamp multi-elettrodo assistita da computer viene utilizzata per mostrare le proprietà di rete di piccoli circuiti neuronali ad alta risoluzione.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come il patch clamp manuale è che il numero di connessioni che possono essere osservate in una rete cresce con il quadrato del numero di neuroni che vengono registrati. La dimostrazione visiva di questa tecnica è importante perché i passaggi del patch clamp possono essere difficili da apprendere a causa della complessità e della velocità con cui devono essere eseguiti. Iniziare questa procedura posizionando una fetta di cervello con la regione di interesse al centro dell'intervallo di spostamento del microscopio.

Quindi, identifica le celle di interesse. Quindi salva la posizione delle celle in base al sistema di coordinate del microscopio. L'interfaccia grafica visualizzerà le cellule selezionate e le micropipette per una panoramica globale e il software aggiungerà un marcatore sulla posizione della cellula che verrà sovrapposto alle immagini.

Inoltre, viene acquisita un'immagine della cella per riferimento futuro. Dopo aver selezionato le cellule di interesse, assegnare le pipette che verranno utilizzate per registrare le singole cellule impostando i controlli di assegnazione nell'interfaccia grafica. Visualizza un'anteprima della configurazione finale selezionando la casella di controllo mostra le posizioni finali.

Ora prepara le pipette con la soluzione intracellulare e posizionale sui loro supporti. Posizionare gli stadi della testa nei loro fissaggi, ma non farli scorrere in avanti. Per evitare di toccare il bagno con la punta della pipetta, abilitare il controllo della pressione positiva e selezionare tutte le pipette.

Per garantire che le punte rimangano pulite, far scorrere delicatamente ogni stadio della testa in posizione. Quindi, posizionare il microscopio in una posizione centrale con la messa a fuoco di due millimetri sopra la fetta premendo il pulsante R due mentre si tiene premuto il pulsante A.Utilizzare la posizione corrispondente per ciascun manipolatore come memorizzato dall'esperimento precedente premendo il pulsante L due mentre si tiene premuto il pulsante A.At questo punto, dovrebbe esserci un'ombra distintiva della pipetta in vista o dovrebbe essere sufficiente un piccolo movimento lungo l'asse delle pipette per osservarlo. La compensazione delle lievi differenze nella forma della pipetta deve essere eseguita manualmente.

Quindi, mettere a fuoco il puntale della pipetta. Quindi posizionare la punta sul punto centrale rosso del display video. Senza spostare il microscopio, informare il software che la pipetta si trova al centro del display premendo il pulsante Z mentre si tiene premuto il pulsante C del controller.

Dopo aver individuato il singolo puntale della pipetta, inviare la pipetta all'indietro in modo che la successiva possa essere individuata premendo il pulsante L uno mentre si tiene premuto il pulsante a. Una volta che tutti i puntali delle pipette sono stati posizionati con precisione e ogni pipetta è stata attribuita a una cellula. Per posizionare automaticamente le pipette vicino alle rispettive cellule, è sufficiente fare clic con il pulsante destro del mouse sul centro del gruppo di cellule nella finestra di rappresentazione grafica e selezionare l'opzione cluster nel menu a comparsa.

Nella finestra delle opzioni del cluster, selezionare tutte le pipette che si desidera posizionare in questo momento e fare clic su Vai con le pipette selezionate. Ripetere questa procedura per ogni gruppo di cellule di interesse. Per eseguire l'approccio finale, specificare la posizione delle pipette rispetto alle cellule a 200 micron di distanza dalla cellula nell'asse della pipetta e 200 micron sopra di essa in direzione verticale, il che è sufficiente per mantenere la punta della pipetta all'esterno del tessuto.

Attendere quindi che il posizionamento delle pipette sia terminato. Quindi spostare il microscopio verso la pipetta premendo il pulsante R uno mentre si tiene premuto il pulsante C.Ricalibrare la posizione di ciascuna pipetta concentrando il microscopio sulla punta in un punto qualsiasi del display video e premendo il pulsante B mentre si tiene premuto il pulsante C.Dovrebbe apparire brevemente una griglia quadrata che indica la posizione identificata della pipetta. Se la posizione non è corretta, posizionare la punta sul punto centrale del display video e premere il pulsante Z tenendo premuto il pulsante C del controller.

Ora verificare che la cella di interesse per la pipetta corrente sia contrassegnata correttamente, contrassegnata attivamente. In caso contrario, spostare il microscopio in modo che corrisponda alla cella di interesse con il punto rosso centrale, contrassegnare la cella premendo il pulsante Y mentre si tiene premuto il pulsante C.Quindi premere il pulsante L due tenendo premuto il pulsante C.To posizionare la pipetta a 200 micron di distanza dalla cella assegnata, il microscopio si sposterà automaticamente nella posizione corrispondente. Regolare la posizione della pipetta in modo che corrisponda al punto rosso.

Quindi regolare l'offset della pipetta premendo il pulsante R uno. Tenendo premuto il pulsante x. Attivare l'impulso di prova premendo il pulsante L uno mentre si tiene premuto il pulsante x.

Successivamente, spostare lentamente la pipetta nella cella attribuita. Dopo aver osservato la formazione di una fossetta sulla superficie della membrana cellulare, applicare un breve impulso di pressione negativa premendo il pulsante Y mentre si tiene premuto il pulsante Z per consentire alla pressione applicata di raggiungere la cellula. A questo punto dovrebbe essere stabilito un potenziale di mantenimento di circa 65 millivolt negativi premendo il pulsante L due mentre si tiene premuto il pulsante x.

Una volta formato un giga seal per ogni cellula, iniziare a rompere le membrane applicando una pressione negativa. Successivamente, utilizzare il sistema di acquisizione della stimolazione per eseguire la registrazione. Applica impulsi o treni di impulsi su singole cellule una alla volta e osserva le risposte delle cellule rimanenti per mappare la connettività tra queste cellule registrate.

Una volta terminate le registrazioni, staccare lentamente le pipette dal tessuto facendo clic con il pulsante destro del mouse sul pulsante di opzione del tavolo. Selezionare le pipette di recede da 500 micron per fare in modo che le pipette si allontanino di una breve distanza lungo i loro assi. Quindi osservare la deriva del potenziale delle cellule di ritirare le pipette fino in fondo.

Imposta la velocità di posizionamento su veloce e ripeti la stessa operazione, ma scegli l'opzione tutto. Rimuovere le pipette usate facendo scorrere delicatamente verso l'esterno gli stadi della testa e svitando le pipette dai supporti. Ecco un esempio di reti di connessioni sinaptiche dirette mappate in singoli esperimenti.

Questi tre diagrammi di connettività sono insiemi di 12 celle parametalliche registrate nello strato cinque con rispettive distanze intersomatiche. Ed ecco il diagramma di connettività sovrapposto alla colorazione morfologica di cellule parametalliche registrate. Questa figura mostra l'effetto del vicino comune.

Le colonne blu indicano le coppie di neuroni che sono contemporaneamente connesse ad almeno un altro neurone nella rete campionata. Esibizione Una probabilità significativamente maggiore di essere interconnessi. Qui mostra che le coppie di neuroni che condividono più vicini comuni si verificano più spesso del previsto per caso nelle reti campionate, la probabilità di connessione all'interno di coppie di neuroni aumenta in funzione del numero di vicini comuni condivisi dal pagatore.

Queste proprietà, a loro volta, danno origine a reti clustered di piccoli mondi. Questa figura mostra la quantificazione del reclutamento delle cellule Martin nty. Questa è una rappresentazione grafica di una cellula parametallica in rosso che forma sinapsi su una cellula Martin nty in blu, che a sua volta forma sinapsi su una seconda cellula parametallica.

Nel nero la stimolazione sopra soglia della cellula parametallica porta al reclutamento della cellula Martin. Attraverso l'integrazione dei potenziali eccitatori post-sinaptici facilitanti, la cellula Martin nty reclutata inibisce quindi la seconda cellula parametallica. Questo diagramma rappresenta la stimolazione di un numero crescente di cellule parametalliche bloccate con patch e gli effetti su un'altra cellula parametallica.

Ecco i potenziali postsinaptici inibitori medi registrati da una cellula parametallica in funzione del numero di altre cellule parametalliche vicine che vengono stimolate. L'ampiezza dell'inibizione sinaptica del DYS in un circuito locale tende a saturarsi quando vengono stimolate nove o più cellule parametalliche e la frazione di cellule che ricevono l'inibizione sinaptica del DYS sale rapidamente a uno man mano che viene stimolato un numero crescente di cellule parametalliche. Durante il tentativo di questa procedura, è importante mantenere pulite le punte delle pipette e ridurre al minimo la distorsione dei tessuti evitando i vasi sanguigni e altre cellule durante la fase di avvicinamento.

Seguendo questa procedura, possono essere impiegati metodi aggiuntivi come la fotostimolazione per affrontare ulteriori questioni come l'innovazione delle celle clamp patchate da parte di un altro tipo di cellula. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come accelerare ed eseguire la procedura di patch clamping per più neuroni.