Name: Applicazione di morsetto di patch automatico guidato per immagini per lo studio dei neuroni in fettine di cervello (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Impara la tecnica di patch-clamp automatico guidato per immagini per studiare l'attività neuronale in fettine acute di cervello. Questo metodo aumenta l'efficienza sperimentale e facilita screening farmacologici ad alto rendimento.

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Siamo grati per il sostegno finanziario della Fondazione Whitehall. Vorremmo ringraziare Samuel T. Kissinger per i preziosi commenti.

1. Impostazione del sistema <ol><li> Costruire l&#39;unità di controllo della pressione. <ol><li> Montare l&#39;unità di controllo della pressione in base alla mappa del circuito ( Figura 1 ). Saldare le parti necessarie sul circuito stampato (PCB) realizzato secondo gli schemi dei circuiti elettrici ( figura 1b ). Utilizzare resistori standard, LED, transistori campo-effetto (Semiconductor Metal-Oxide Semiconductor), condensatori e connettori (vedi tabella dei materiali ). Le elettrovalvole a saldare sul PCB. Collegare il sensore della pompa dell&#39;aria e della pressione dell&#39;aria al PCB con filo elettrico. NOTA: Dovrebbe impiegare circa 2 ore per costruire l&#39;unità di controllo pressione con tutte le parti necessarie messe a disposizione. </li></ol></li><li> Collegare la scheda di acquisizione dati secondaria (DAQ). <ol><li> Collegare le uscite dei dati dalla scheda a circuito stampato alla scheda DAQ, seguendo la tabella 1 . NOTA: La scheda DAQ wilSto eseguendo in modalità &quot;Single-ended&quot;. La mappa del porto può essere trovata nel manuale dell&#39;utente (vedi tabella dei materiali ). </li><li> Collegare &quot;AIn Pr S&quot; ad uno dei canali di ingresso analogico (AI) e &quot;R-Gr&quot; a uno dei motivi analogici della scheda secondaria DAQ. </li><li> Collegare l&#39;uscita primaria dall&#39;amplificatore a uno dei canali AI e il suolo al terreno analogico della scheda secondaria DAQ. NOTA: È possibile utilizzare un cavo BNC standard per collegare l&#39;uscita primaria dall&#39;amplificatore. </li><li> Strip l&#39;altra estremità e collegare il segnale positivo ( cioè il rame) al canale AI e al suolo ( cioè il filo sottile intorno al nucleo) al suolo analogico. Ripetere questo passaggio per un secondo canale se viene utilizzato più canali patch. NOTA: L&#39;ingresso analogico alla scheda DAQ verrà configurato in passaggi successivi. </li><li> Collegare l&#39;alimentazione alla potenza della scheda DAQ secondaria. Utilizzare un potere separato da 12 V cosìPer la pompa. </li></ol></li><li> Collegare il tubo. <ol><li> Collegare la pompa dell&#39;aria e le due valvole secondo la Tabella 2 . Utilizzare un connettore a 3 vie per collegare il tubo morbido dalla porta superiore valvola 2, dal sensore di pressione e dal porta pipetta nell&#39;ultimo passaggio. </li><li> Aggiungere un altro connettore a 3 vie al tubo collegato al porta pipetta se si usano due pipette. Passare manualmente tra le valvole e le pipette in uso durante la patch. </li></ol></li><li> Installare Autopatcher IG. NOTA: Requisiti di sistema: Autopatcher IG è stato testato solo su un PC con Windows 7. Non è stato convalidato per altri sistemi operativi. La procedura descritta si applica specificamente all&#39;hardware elencato nella tabella dei materiali. <ol><li> Scarica Autopatcher-IG da GitHub (https://github.com/chubykin/AutoPatcher_IG). </li><li> Installare Python (vedere la tabella dei materiali per la versione e l&#39;indirizzo di download). </li><li> Disinstallare PyQt4Digitando &quot;pip disinstalla PyQt4&quot; in un terminale di riga di comando. NOTA: il sistema utilizza una versione precedente della libreria PyQt4 per ottenere la compatibilità con le librerie Qwt e Opencv. </li><li> Installare le librerie Python dai file delle ruote storiche (http://www.lfd.uci.edu/~gohlke/pythonlibs/). Trovare i seguenti file: Numpy (pymc-2.3.6-cp27-cp27m-win32.whl), Opencv (opencv_python-2.4.13.2-cp27-cp27m-win32.whl), Pyqt (PyQt4-4.11.4-cp27-none -win32.whl) e Qwt (PyQwt-5.2.1-cp27-none-win32.whl). <ol><li> Per installare i file ruota, passare alla directory dove vengono salvati i file e digitare &quot;pip install *** wheelfilename ***. Whl.&quot; Sostituisci &quot;*** wheelfilename ***&quot; con il nome effettivo del file. NOTA: &quot;cp27&quot; nel nome del file ruota indica Python 2.7 e &quot;win32&quot; indicano Windows a 32 bit. Se &quot;win32&quot; non funziona, prova &quot;win64&quot;. </li></ol></li><li> Per controllare la telecamera CCD, scaricare e installare il programma di installazionePer 64 bit (https://www.qimaging.com/support/software/). Quindi scaricare MicroManager per 64 bit (https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release) per controllare la fotocamera in Python. </li><li> Per controllare i manipolatori e la fase del microscopio, installare il software di controllo fornito dal produttore. NOTA: In questo modo viene installato anche il driver necessario per controllare i manipolatori. Il pacchetto di installazione è comunemente fornito in un CD-ROM. </li><li> Per controllare la scheda secondaria DAQ, installare la libreria universale dal CD-ROM, purché l&#39;acquisto della scheda DAQ. </li></ol></li><li> Configurare l&#39;hardware per Autopatcher IG. <ol><li> Collegare lo stadio del microscopio e i manipolatori al computer tramite le porte USB. </li><li> Assegnare i numeri di porta COM all&#39;unità 0: stadio microscopio, unità 1: manipolatore sinistro e unità 2: manipolatore destro, in questo ordine, nel file di configurazione &quot;ports.csv&quot; nella cartella &quot;configurazione&quot;. LEva gli altri parametri nel file ports.csv ( cioè &quot;SCI&quot; ​​e &quot;1&quot;) invariati. NOTA: Le informazioni sul numero di porta COM possono essere trovate eseguendo il software di configurazione del manipolatore fornito dal produttore. Vai alla scheda &quot;Impostazioni&quot;, seleziona &quot;Impostazioni&quot; e la pagina &quot;Movimento&quot; e leggi le etichette per ogni scheda in alto. In alternativa, queste informazioni possono essere trovate nel PC Device Manager. </li><li> Assegnare numeri di canale di ingresso analogico sulla scheda DAQ per un sensore di pressione e il canale di patch 1 e 2 (corrispondente all&#39;unità 1 e 2). Immettere il numero del canale nel file &quot;DAQchannels.csv&quot; nella cartella &quot;configurazione&quot;. NOTA: Si consiglia di aprire i file .csv con l&#39;applicazione Notepad anziché un foglio di calcolo, in quanto potrebbe modificare le informazioni quando si salva le modifiche. </li></ol></li><li> Esegui Autopatcher IG. <ol><li> Accendere l&#39;amplificatore, il controllore del microscopio e il regolatore del manipolatore. EnsuChe il software dell&#39;amplificatore è in esecuzione. </li><li> Eseguire l&#39;Autopatcher IG con Python da un terminale di riga di comando come segue: prima, cambiare la directory (comando &quot;cd&quot; per i terminali più comuni) in cui è installato Autopatcher IG, digitare &quot;Python Autopatcher_IG.pyw&quot; nel terminale di riga di comando e premere &quot;Tasto Invio. NOTA: Non eseguire il software di controllo del manipolatore prima di eseguire Autopatcher IG perché occuperà lo stadio e il manipolatore del microscopio, causando che Autopatcher IG non riesce a trovare l&#39;hardware. Il software di controllo del manipolatore può essere eseguito dopo che Autopatcher IG è completamente avviato se ci sono ulteriori moduli da controllare ( ad esempio, il riscaldatore in linea). </li></ol></li><li> Calibrare la pipetta primaria. <ol><li> Tirare le pipette patch come descritto in precedenza 9 . Riempire una pipetta di vetro tirata con soluzione interna e caricarla sul piano di testa. NOTA: Le pipette vuote di vetro hanno diversi contrasti sottoIl microscopio e può portare a una calibrazione imprecisa. </li><li> Spostare la punta della pipetta nel campo visivo del microscopio e metterlo in messa a fuoco. Se il quadrante è utilizzato per spostare i manipolatori e / o lo stadio microscopico, aggiornare le coordinate premendo &quot;z&quot; sulla tastiera. NOTA: Questa azione non è necessaria se la tastiera (stadio microscopico: asse A / D - x, asse W / S - y, asse R / F - z, manipolatori: H / K - asse x, U / J - asse Y, O / L - asse z, 1/2 - numero di unità) viene utilizzato per controllare il movimento perché le coordinate saranno aggiornate in tempo reale. </li><li> Fare clic sul pulsante &quot;Avvia calibrazione&quot; sull&#39;interfaccia grafica utente grafica (GUI) per l&#39;unità corrispondente su cui è caricata la pipetta ( Figura 2 ). NOTA: una finestra popup apparirà quando la calibrazione è terminata. NOTA: La calibrazione verrà eseguita automaticamente, che richiede circa 3,5 min. Cliccando sullo stesso pulsante (ora commutato per &quot;annullare la calibrazione&quot; afTer avviare la calibrazione) interromperà il tentativo di calibrazione. </li><li> Salvare la calibrazione facendo clic su &quot;salva la calibrazione&quot; nella parte inferiore della GUI principale (salva la calibrazione corrente per entrambi i manipolatori e può essere caricata in futuro). NOTA: Il campo visivo in basso (4 o 10 volte) e alto (40x) deve essere allineato per la calibrazione secondaria per funzionare correttamente. Fare riferimento al manuale d&#39;uso del sistema ottico in uso per le procedure di allineamento. </li></ol></li></ol> 2. Procedura di morsetto automatico di patch <ol><li> Preparare le fette acute del cervello, come descritto in precedenza 10 . </li><li> Preparare pipette di vetro per il morsetto patch. </li><li> Posizionare una fetta del cervello al centro della camera di registrazione. Stabilizzare la fetta con una fetta tenere premuta, o &quot;arpa&quot;. </li><li> Rileva la cella fluorescente. <ol><li> Trova l&#39;area di interesse sotto la lente 4X. Spostare la fase del microscopio accendendo il tasto cliCk-to-move (&quot;CTM&quot;) e fare clic sul centro dell&#39;area di interesse. In alternativa, utilizzare la tastiera per spostare la fase del microscopio (asse A / D - x, asse W / S - y, asse R / F - z). </li><li> Passare all&#39;obiettivo ad alto ingrandimento e regolare la messa a fuoco spostando il microscopio nell&#39;asse z, usando R / F sulla tastiera. NOTA: Si consiglia di regolare il livello del bagno d&#39;acqua in modo che il piano focale sotto le lenti a basso e alto ingrandimento siano uguali o simili nell&#39;asse z. </li><li> Fai clic sul pulsante &quot;Rileva cella&quot; nella colonna GUI principale, &quot;Unità 0.&quot; Se il LED o la sorgente luminosa laser dell&#39;impostazione non può essere controllata dal segnale TTL, accendere manualmente il LED / laser; Apparirà una finestra pop-up quando il rilevamento delle celle è terminato. <ol><li> Spegnere il LED / laser se necessario; Un elenco delle coordinate delle celle apparirà nella GUI &quot;Posizioni di memoria&quot;. Rimuovi le cellule indesiderate dall&#39;elenco facendo clic sul pulsante &quot;X&quot; accanto alle coordinate. </li><li>In alternativa, se le celle di destinazione non sono etichettate in fluorescenza, fare clic su &quot;Modalità mouse&quot; nella GUI principale. Clicca sulla cella di interesse; Sulla cella apparirà un punto giallo con un numero e le coordinate della cella appariranno nella GUI &quot;Posizioni di memoria&quot;. </li></ol></li></ol></li><li> Calibrare la pipetta secondaria. <ol><li> Riempire 1/3 di una pipetta di vetro con soluzione interna. Caricare la pipetta sul supporto della pipetta attaccato allo stadio della testa. </li><li> Utilizzare l&#39;obiettivo a basso ingrandimento. Portare la pipetta nel campo visivo e regolare la messa a fuoco usando la tastiera (H / K - asse x, asse U / J - y, asse O / L - z). Usare &quot;1&quot; e &quot;2&quot; per passare dall&#39;unità 1 all&#39;unità 2. </li><li> Caricare la calibrazione primaria facendo clic su &quot;Carica calibrazione&quot;. Fare clic sul pulsante &quot;Calibrazione secondaria&quot; nella GUI principale sotto l&#39;unità in uso. Ad esempio, se l&#39;unità 2 è in uso, fare clic sul pulsante &quot;Calibrazione secondaria&quot; nell&#39;unità &quot;Unit 2&quot;lumn. Seguire le istruzioni della finestra popup per passare all&#39;obiettivo ad alta magnificazione. </li></ol></li><li> Patch una cella di destinazione. <ol><li> Assicurarsi che il software &quot;MultiClamp&quot; (ad es. Amplificatore) sia in esecuzione. Fare clic sul pulsante &quot;Controllo patch&quot; per aprire la GUI &quot;Patch control&quot;; Potrebbe richiedere fino a pochi minuti per aprire questa GUI. </li><li> Utilizzare l&#39;obiettivo di ingrandimento 40X controllando &quot;40X&quot; nella colonna principale dell&#39;unità &quot;Unit 0&quot;. Fare clic sul pulsante &quot;vai a&quot; accanto alla cella di interesse nell&#39;elenco di coordinate nella GUI &quot;Posizione memoria&quot;; Il microscopio si sposterà verso la cella. </li><li> Fare clic sul pulsante CTM dell&#39;unità in uso nella GUI principale per abilitare il movimento dopo un clic del mouse. Clicca sulla cella di interesse; La punta della pipetta si sposterà nella cella. </li><li> Fare clic sul pulsante &quot;Patch&quot; sulla GUI &quot;Patch control&quot;. NOTA: L&#39;avvio automatico avrà inizio e la pressione e la resistenza possono essere monitoratiLa GUI &quot;Patch control&quot;. <ol><li> Usare il pulsante &quot;Unit 1 selected&quot; per commutare il segnale di ingresso tra le due unità. NOTA: Il sistema si avvicinerà alla cella di destinazione, applica una pressione negativa, corrisponde al potenziale della membrana cellulare e rileva la formazione gigaseale basata su una serie di soglie di pressione e di resistenza e di logica. </li><li> Manipolare il processo automatico in qualsiasi momento facendo clic sui rispettivi pulsanti sulla GUI &quot;Controllo patch&quot;. Ad esempio, fare nuovamente clic sul pulsante &quot;Patch&quot; per annullare la prova di patch e fare clic su &quot;Prossima tappa&quot; per avanzare il processo di patching al passaggio successivo, indipendentemente dalla soglia. NOTA: Una finestra pop-up notificherà all&#39;utente quando si è formata una gigaseal e verrà presentata l&#39;opzione di applicare zap e una grande pressione negativa. </li></ol></li><li> Selezionare &quot;Sì&quot; per interromperla con zap e aspirazione combinata. In alternativa, selezionare &quot;No&quot; per rompersi solo con aspirazione. <br/&gt; NOTA: quando una riuscita patch di celle intero è completata, una finestra a comparsa ricorda all&#39;utente di salvare il log di patch di esperimenti. </li><li> Salva il registro patch di esperimenti. NOTA: se una prova di patch non è riuscita, una finestra popup informerà l&#39;utente e il processo di patch verrà ripristinato. </li><li> Tornate al punto 2.4 e ripetete i passaggi con una cella diversa. </li></ol></li><li> Raffinare le soglie di patch (opzionale). NOTA: Soglie per la resistenza iniziale della pipetta, pressione positiva e negativa, resistenza gigaseale, ecc . Può essere modificato da un file di configurazione. <ol><li> Aprire il file &quot;PatchControlConfiguration.csv&quot; nella cartella &quot;Configurazione&quot; nella destinazione in cui è installato il sistema. Modificare i numeri corrispondenti a ciascun valore di soglia. Non modificare i nomi dei valori; Ciò comporterà voci non riconoscibili nel sistema. </li><li> Attenersi immediatamente ai nuovi valori di soglia premendo &quot;CtRl + L &quot;senza riavviare il programma; il riavvio del programma implementerà il nuovo valore di soglia dal file. </li></ol></li></ol> 3. Effettuare le registrazioni NOTA: la modalità nell&#39;amplificatore microelettrodo controllato dal computer verrà impostata automaticamente su &quot;Current Clamp&quot; (&quot;IC&quot;) dal software di autopatcher una volta ottenuta una patch di successo. Le registrazioni a morsetto delle patch intere cellule possono essere eseguite usando il software di registrazione di scelta (questo sistema non include una funzione di registrazione). Se sono state identificate più celle di destinazione, dopo aver terminato una registrazione, tornare al passaggio 2.4 e provare un&#39;altra cella. <ol><li> Eseguire esperimenti automatici di applicazione di farmaci locali utilizzando un picospritzer (opzionale). NOTA: Qui viene utilizzato un esperimento di applicazioni locali di droga come esempio per descrivere come utilizzare la funzione &quot;Sequenza di comando&quot; aggiuntiva per controllare l&#39;hardware esterno tramite i segnali TTL. <ol><li> Collegare la porta A chaNnel 0 e il terreno sulla scheda DAQ secondaria all&#39;ingresso di trigger trigger sul digitizzatore utilizzando un cavo BNC spogliato (come descritto nel punto 1.2.3). Collegare un canale di uscita digitale sul digitizzatore al trigger esterno sul picospritzer. </li><li> Preparare il picospritzer secondo il manuale dell&#39;utente. Collegare l&#39;uscita dell&#39;aria picospritzer al supporto della pipetta di droga collegato ad un micromanipolatore. </li><li> Caricare una pipetta piena di un farmaco scelto. Fissarlo al porta pipetta. Calibrare la pipetta, come descritto nel punto 1.7. </li><li> Dopo aver patchato una cella come descritto al passaggio 2.6, selezionare la posizione desiderata per la somministrazione di droga cliccando con il mouse nella GUI della visualizzazione della fotocamera in &quot;modalità mouse&quot; (commutata dalla GUI principale). In alternativa, utilizzare la GUI &quot;Griglia&quot; per progettare una griglia, con ogni pixel della griglia come una delle destinazioni di destinazione. NOTA: la griglia può essere manipolata nella GUI della visualizzazione della telecamera trascinandola con il mouse. </li><li> Nella sezione &quot;Command SequClicca su &quot;carica punti mouse&quot; o &quot;punti di griglia di carico&quot; per importare tutte le coordinate per la consegna della droga. <ol><li> Fare clic su ogni voce di coordinate per modificare il segnale specifico TTL di comando nella colonna di destra. Nella prima voce di comando, fare clic sulla cifra più a destra per spostarla da &quot;0&quot; a &quot;1&quot;, inviando un segnale TTL + 5 V. Impostare il tempo (T) alla durata del segnale TTL desiderato, in ms. </li><li> Nella seconda voce di comando, impostare tutte le cifre su &quot;0&quot; e impostare T sulla durata della lunghezza di registrazione della prova. Modifica comandi per tutte le voci di coordinate. Aggiungere le voci di comando facendo clic su &quot;+&quot; se sono necessari più segnali TTL. NOTA: I bit a 8 cifre rappresentano i canali A di porta 0-7 sul DAQ secondario (le porte 1 - 3 sono occupate dalla pompa e da due valvole), se necessario, può essere commutato. </li></ol></li><li> Creare così un protocollo di registrazione nel modulo di acquisizione datiChe l&#39;avvio di una spazzata viene attivato dal trigger di avvio esterno. Modificare il protocollo per consegnare il farmaco all&#39;ora desiderata. </li><li> Nella GUI &quot;Comando Sequenza&quot;, fai clic su &quot;Esegui&quot; a sinistra per eseguire tutte le coordinate. In alternativa, fai clic su &quot;Esegui&quot; a destra per eseguire solo la sequenza selezionata. NOTA: la pipetta si sposterà ad ogni coordinata ed esegue il segnale TTL come definito per avviare la registrazione. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Una domanda di brevetto non provvisorio &quot;SISTEMI E METODI PER L&#39;ELETTROFISIOLOGIA DI PATCH CLIP ELETROFISIOLOGICO AUTOMATICO GUIDATA IN VITRO&quot;, US N ° di serie: 15 / 353,719, è stata depositata il 16 novembre 2016, rif. N. PRF 67270-02.

Qui descriviamo un metodo per le registrazioni automatiche delle morsetti di patch guidate dall&#39;immagine in vitro . I passi chiave di questo processo sono riepilogati come segue. Innanzitutto, la visione informatica viene utilizzata per riconoscere automaticamente la punta della pipetta usando una serie di immagini acquisite tramite un microscopio. Queste informazioni vengono poi utilizzate per calcolare la funzione di trasformazione delle coordinate tra il microscopio ei sistemi di coordinate del manipolat...

La tecnica della pinzetta patch è stata sviluppata da Neher e Sakmann negli anni &#39;70 per studiare i canali ionici delle membrane eccitabili 1 . Da allora, il bloccaggio della patch è stato applicato allo studio di molti soggetti diversi a livello cellulare, sinaptico e a livello di circuito sia in vitro che in vivo, in diversi tipi di cellule, inclusi neuroni, cardiomiociti, oociti Xenopus e liposomi artificiali 2 . Questo processo prevede la corretta identificazione e il targeting di una cella di interesse, il controllo di micromanipulatore intricato per spostare la pipetta patch in prossimità della cella, l&#39;applicazione di una pressione positiva e negativa alla pipetta nel momento giusto per stabilire una patch gigasea stretta, E un break-in per stabilire una configurazione di patch di cellule intere. Il bloccaggio delle patch viene tipicamente eseguito manualmente e richiede un&#39;estesa formazione per il master. Anche per un ricercatore esperto con la patchMorsetto, il tasso di successo è relativamente basso. Più recentemente, sono stati fatti diversi tentativi per automatizzare gli esperimenti di patch-clamp. Due strategie principali si sono evolute per realizzare l&#39;automazione: aumentando le apparecchiature standard di bloccaggio delle patch per fornire il controllo automatico del processo di patching e la progettazione di nuove attrezzature e tecniche dal punto di vista fondamentale. L&#39;ex strategia è adattabile all&#39;hardware esistente e può essere utilizzata in una varietà di applicazioni di morsetti di patch, tra cui in vivo patch morsetto patch 3 , 4 , 5 in vitro di patch patch di cervelli acuti, colture organotipiche di fetta e neuroni dissocati coltivati 6 . Permette l&#39;interrogazione di circuiti locali complessi utilizzando simultaneamente più micromanipulatori 7 . Il metodo di patch pianistico è un esempio della nuova strategia di sviluppo, che può raggiungere l&#39;elevato throughput simultaneo pMorsetto di cellule in sospensione per scopi di screening dei farmaci 8 . Tuttavia, il metodo di patch planare non è applicabile a tutti i tipi di cellule, in particolare i neuroni con lunghi processi o circuiti intatti che contengono collegamenti estesi. Questo limita la sua applicazione alla mappatura dei circuiti intricati del sistema nervoso, che è un vantaggio fondamentale della tecnologia tradizionale patch clamp. Abbiamo sviluppato un sistema che automatizza il processo di morsetto di patch in vitro incrementando l&#39;hardware standard di patch clamp. Il nostro sistema, Autopatcher IG, fornisce la calibrazione automatica delle pipette, l&#39;identificazione del bersaglio a fluorescenza, il controllo automatico del movimento delle pipette, la patch automatica delle cellule intere e la registrazione dei dati. Il sistema può acquisire automaticamente più immagini di fette del cervello a diverse profondità; Analizzarli usando la visione del computer; E estrarre informazioni, incluse le coordinate delle cellule etichettate con fluorescenza. Queste informazioni possono essere alloraUtilizzati per mirare e bloccare automaticamente le celle di interesse. Il software è scritto in Python - un linguaggio di programmazione gratuito e aperto - utilizzando diverse librerie a sorgenti aperte. Ciò assicura la sua accessibilità ad altri ricercatori e migliora la riproducibilità e il rigore degli esperimenti di elettrofisiologia. Il sistema ha un design modulare, in modo tale che gli hardware aggiuntivi possano essere facilmente interfacciati con l&#39;attuale sistema dimostrato qui.

<table><tbody><tr><td>Telecamera</td><td>CCD QImaging</td><td>Rolera Bolt</td><td></td></tr><tr><td>Impianto di elettrofisiologia</td><td>Scientifica</td><td>SliceScope Pro 2000</td><td>Include microscopio e manipolatori. Il software di controllo del manipolatore fornito dal produttore dimostrato in questo manoscritto è " Linlab2".</td></tr><tr><td>Amplificatore</td><td>Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td><td>Amplificatore per microelettrodi controllato da computer</td></tr><tr><td>Digitalizzatore</td><td>Molecular Devices</td><td>Sorgente luminosa LED Axon Digidata 1550</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Cool LED</td><td>pE-100</td><td>lunghezza d'onda di 488 nm</td></tr><tr><td>Scheda di acquisizione dati</td><td>Calcolo di misura</td><td>USB1208-FS</td><td>DAQ. Vedere il manuale all'indirizzo: http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf</td></tr><tr><td>Elettrovalvole</td><td>The Lee Co.</td><td></td><td></td>LHDA0531115H</tr><tr><td>Pompa dell'aria</td><td>Industria virtuale</td><td>VMP1625MX-12-90-CH</td><td></td></tr><tr><td>Sensore di pressione dell'aria</td><td>Semiconduttore Freescale</td><td>MPXV7025G</td><td></td></tr><tr><td>Slice hold-down Warner</td><td>instruments</td><td>64-1415 (SHD-40/2)</td><td>Kit di ancoraggio Slice, piatto per camera RC-40, 2,0 mm, 19,7 mm</td></tr><tr><td>Python</td><td>Anaconda</td><td>versione 2.7 (32 bit per Windows)</td><td></td></tr><tr><td>Morsetti a vite</td> https://www.continuum.io/downloads <td>Sparkfun</td><td>PRT - 08084</td><td>Terminali a vite passo 3,5 mm (2 pin)</td></tr> <tr><td>(2 pin)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>MOSFET a canale N 60 V 30 A</td><td>Sparkfun</td><td>COM - 10213</td><td></td></tr><tr><td>Prese DIP Coda a saldare - 8 pin</td><td>Sparkfun</td><td>PRT-07937</td><td></td></tr><tr><td>LED - Base Rosso 5 mm</td><td>Sparkfun</td><td>COM-09590</td><td></td></tr><tr><td>LED - Verde di base 5mm</td><td>Sparkfun</td><td>COM-09592</td><td></td></tr> Jack <tr><td>/ connettore di alimentazione cilindrico CC (SMD)</td><td>Sparkfun</td><td>PRT-12748</td><td></td></tr><tr><td>Alimentatore adattatore da parete - 12 V CC 600 mA</td><td>Sparkfun</td><td>TOL-09442</td><td></td></tr><tr><td>Cavo di collegamento - Assortimento (nucleo solido, 22 AWG)</td><td>Sparkfun</td><td>PRT-11367</td><td></td></tr><tr><td>Rubinetto di bloccaggio maschio x femmina x femmina</td><td>ARK-PLAS</td><td>RCX10-GP0</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Tubi flessibili</td><td>Fisher scientific</td><td>14-171-129</td><td>Diametro esterno: 1/8 Diametro interno: 1/16 in.</td></tr><tr><td>Cavo coassiale BNC maschio a BNC maschio</td><td>Belkin Components</td><td>F3K101-06-E</td><td></td></tr><tr><td>Resistenza da 560 Ohm (tolleranza del 5%)</td> <td>Radioshack</td><td>2711116</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer Valvola</td><td>generale</td><td>Picospritzer II</td><td></td></tr></tbody></table>

applicazione di morsetto di patch automatico guidato per immagini per lo studio dei neuroni in fettine di cervello

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Il morsetto di patch a cellule intere è il metodo standard gold per misurare le proprietà elettriche delle singole cellule. Tuttavia, il morsetto di patch in vitro rimane una tecnica impegnativa e di bassa produttività grazie alla sua complessità e all&#39;alta dipendenza dal funzionamento e dal controllo da parte degli utenti. Questo manoscritto dimostra un sistema di bloccaggio automatico delle patch per le esperienze di morsetti di patch a cellule in vitro in fette acute del cervello. Il nostro sistema implementa un algoritmo basato su visione informatica per rilevare le celle con etichette fluorescenti e per indirizzarle per la patch completamente automatica usando un micromanipulator e un controllo interno della pressione della pipetta. L&#39;intero processo è altamente automatizzato, con requisiti minimi per l&#39;intervento umano. Le informazioni sperimentali in tempo reale, tra cui la resistenza elettrica e la pressione interna della pipetta, sono documentate elettronicamente per analisi futura e per ottimizzazione a diversi tipi di cellule. Anche se il nostro sistema è descritto nel contesto di brai acutiN può essere applicato anche alla messa a punto automatizzata di patch di neuroni dissociati, culture di fetta organotipica e altri tipi di cellule non neuronali.

<html> Il nostro sistema è stato testato sulla sua capacità di patch delle cellule in fette cerebrali acute, cellule staminali pluripotenti indotte da mouse (iPSCs) differenziate in neuroni e cellule HEK 293 artificialmente esprimendo canali di interesse. La Figura 3 mostra un esperimento che usa i topi transgenici Thy1-ChR2-YFP (B6.Cg-Tg (Thy1-COP4 / EYFP) 18Gfng / J) targeting neuroni piramidali strati 5 fluorescenti etichettati nella corteccia visiva. La c...

Questo protocollo descrive come effettuare esperimenti automatici con patch-cluster guidati dall&#39;immagine utilizzando un sistema recentemente sviluppato per apparecchiature elettrofisiologiche standard in vitro .

Applicazione di morsetto di patch automatico guidato per immagini per lo studio dei neuroni in fettine di cervello

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

L'obiettivo generale di questa tecnologia è utilizzare la visione artificiale per rilevare automaticamente le cellule fluorescenti ed eseguire il patch clamp automatizzato di queste cellule in sezioni cerebrali acute. Questo metodo può contribuire a superare alcune difficoltà fondamentali nel campo dell'elettrofisiologia con patch clamp, come l'identificazione, il targeting e l'esecuzione del patch clamp su cellule marcate con fluorescenza. Il principale vantaggio di questa tecnica è la capacità di rilevare automaticamente le pipette per il patch clamp, le cellule fluorescenti e di integrare questi passaggi con il patch clamp automatico.Questa innovazione aumenta in modo significativo la produttività sperimentale. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia o alla diagnosi di disturbi neurologici, poiché la tecnica automatica di patch-clamp guidata da immagini ad alta produttività può essere utilizzata per schermature farmacologiche in preparazioni neuronali più fisiologiche. Questo metodo può essere applicato anche ad altre preparazioni in vitro, come organelli neuronali tipici, colture di sezioni, neuroni dissociati, nonché a qualsiasi tipo di cellula non neuronale.Per iniziare questa procedura, accendere l'amplificatore, il controllore del microscopio e il controllore del manipolatore. Successivamente, eseguire Autopatcher IG con Python da un terminale della riga di comando cambiando prima la directory in cui è installato Autopatcher IG. Quindi, digitare Python Autopatcher_IG.PYW nel terminale della riga di comando e premere il tasto invio. Successivamente, riempire completamente la pipetta di vetro con la soluzione interna e caricarla sullo stadio. Spostare la punta della pipetta nel campo visivo del microscopio e metterla a fuoco.Se il selettore numerico viene utilizzato per spostare i manipolatori nella piastra del microscopio, aggiornare le coordinate premendo Z sulla tastiera. La calibrazione principale converte l'angolo e la distanza dello spostamento del manipolatore nel sistema di coordinate del microscopio. Il manipolatore si muove in tre direzioni con una distanza preimpostata e il software rileva le coordinate della punta della pipetta all'interno del campo visivo del microscopio.Fare clic sul pulsante di avvio della calibrazione nell'interfaccia grafica principale per l'unità corrispondente su cui è caricata la pipetta. Successivamente, salvare la calibrazione facendo clic su salva calibrazione nella parte inferiore dell'interfaccia grafica principale. Questa calibrazione primaria è necessaria solo una volta, a meno che non venga modificata l'organizzazione fisica dell'apparato.In questo passaggio, posizionare una sezione cerebrale al centro della camera di registrazione. Stabilizzare la sezione cerebrale con un supporto per sezioni o con un arco. Per rilevare la cellula fluorescente, individuare l'area di interesse con un ingrandimento quattro volte.Quindi, spostare la piastra del microscopio attivando la modalità clic per spostare e facendo clic sul centro dell'area di interesse. In alternativa, utilizzare il tastierino per spostare la piastra del microscopio. Successivamente, passare all'obiettivo ad alto ingrandimento e regolare la messa a fuoco spostando il microscopio lungo l'asse Z utilizzando il tasto RF sul tastierino.Il software guida il microscopio e la fotocamera per acquisire una serie di immagini a diverse profondità. Successivamente, queste immagini vengono sottoposte a un'elaborazione mediante visione artificiale per individuare le cellule marcate con fluorescenza. L'output finale è un elenco delle coordinate delle cellule rilevate.Fare clic sul pulsante "rileva cellula" nella colonna principale dell'interfaccia grafica (GUI), unità zero. Se la sorgente luminosa a LED o laser dell'apparato non può essere controllata tramite segnale TTL, accendere manualmente il LED o il laser. Spegnere il LED o il laser se necessario.Un elenco di coordinate cellulari verrà visualizzato nell'interfaccia grafica delle posizioni di memoria. Rimuovere le cellule indesiderate dall'elenco facendo clic sul pulsante X accanto alle coordinate. In alternativa, se le cellule bersaglio non sono marcate con fluorescenza, fare clic su modalità mouse nell'interfaccia grafica principale.Quindi, fare clic sulla cellula di interesse: apparirà un punto giallo con un numero sulla cellula e le coordinate della cellula verranno visualizzate nell'interfaccia grafica delle posizioni di memoria. Per eseguire la calibrazione secondaria al fine di rilevare le coordinate di offset della pipetta, riempire 1/3 di una pipetta di vetro con la soluzione interna. Successivamente, inserire la pipetta nel supporto per pipette collegato alla testa dello stadio.Ingrandendo poco, utilizzare i tasti uno e due sul tastierino numerico per passare dall'unità uno all'unità due. Successivamente, portare la pipetta nel campo visivo e regolare la messa a fuoco utilizzando il tastierino numerico. Quindi, caricare la calibrazione principale facendo clic su carica calibrazione.Passare all'obiettivo del microscopio ad alta ingrandimento e fare clic 40 volte sull'interfaccia grafica principale. Portare la punta della pipetta al centro. Quindi, fare clic sul pulsante di calibrazione secondaria nell'interfaccia grafica principale, sotto l'unità in uso.Per eseguire il patching di una cellula bersaglio, fare clic sul pulsante di controllo del patch per aprire l'interfaccia grafica di controllo del patch. Fare clic sul pulsante vai a posizione accanto alla cellula di interesse nell'elenco delle coordinate presente nell'interfaccia grafica della posizione di memoria. Successivamente, fare clic sul pulsante CTM dell'unità nell'interfaccia grafica principale per abilitare lo spostamento.Fare clic sulla cellula di interesse per spostare la punta della pipetta sulla cellula. A causa delle limitazioni meccaniche del manipolatore, quando si percorre una distanza superiore a 500 micrometri, potrebbe verificarsi un lieve errore di posizionamento. Per prevenire un ampio errore meccanico di posizionamento, è necessario eseguire una calibrazione secondaria nelle vicinanze della cellula bersaglio.Successivamente, utilizzare il pulsante dell'unità selezionata per commutare il segnale di ingresso tra le due unità. Fare clic sul pulsante patch nell'interfaccia grafica di controllo del patch. Il patching automatico avrà inizio e la pressione e la resistenza potranno essere monitorate tramite l'interfaccia grafica di controllo del patch.L'algoritmo di patching automatico monitora la resistenza e controlla la pressione attraverso una serie di cicli logici, al fine di formare un gigaseal. Una finestra popup notifica la formazione del gigaseal. Il sistema utilizza la variazione della resistenza per riconoscere il contatto con la superficie cellulare.Nel caso in cui il contatto con la superficie cellulare non venga rilevato in tempo, utilizzare il pulsante successivo per avanzare alla fase di patch mantenendo lo stesso tentativo di patch automatico. Manipolare il processo automatico in qualsiasi momento cliccando sui rispettivi pulsanti nell'interfaccia di controllo del patch. Successivamente, selezionare sì per effettuare l'ingresso con combinazione di Zap e aspirazione.In alternativa, selezionare "no" per interrompere solo con aspirazione. Quindi, salvare il registro della patch dell'esperimento. Questa figura mostra le posizioni selezionate caricate nell'interfaccia grafica della sequenza di comandi.La colonna di sinistra mostra l'elenco delle coordinate e la colonna di destra mostra l'elenco dei comandi sotto forma di segnali TTL per ciascuna posizione. Di seguito sono riportate le schermate durante l'esperimento di applicazione del farmaco, corrispondenti alle tre posizioni selezionate. La soluzione di KCL è stata mescolata con un colorante fluorescente rosso allo scopo di visualizzazione.L'unità uno era la pipetta contenente KCl e l'unità due era la pipetta per il patching. In questa figura, le iniezioni di corrente a gradino mostrano un neurone con scarica regolare. Sono mostrati qui i tracciati di registrazione in volt-clamp derivanti dall'applicazione locale di soluzione di cloruro di potassio 500 millimolare in tre posizioni diverse.La traccia rossa con corrente entrante è stata registrata durante la prova in cui l'applicazione di cloruro di potassio era vicina alla cellula in patch. La freccia rossa indica il momento dell'applicazione del cloruro di potassio. Utilizzando questo metodo, è possibile eseguire una prova di patch clamp entro quattro minuti senza un addestramento approfondito, rispetto al patching manuale.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'optogenetica, la chemogenetica e manipolazioni farmacologiche, al fine di rispondere a domande relative al proprio progetto di ricerca. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica potrebbe aprire la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per esplorare studi ad alto rendimento su recettori sinaptici e canali ionici in diverse preparazioni in vitro. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire esperimenti di patch clamp automatizzati guidati da immagini.

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Questo video mostra una tecnica per la registrazione patch-clamp dalla superficie della membrana dendritica. Questo aiuta a esaminare direttamente le proprietà elettriche dei dendriti e dei canali ionici voltaggio-dipendenti sottostanti nei neuroni dopaminergici.

Registrazioni Patch-Clamp dal dendrite di un neurone dopaminergico in una fetta di cervello

Questo video mostra il posizionamento di una pipetta a punta fine vicino a fette di cervello, formando un sigillo con una cellula neuronale. L'aspirazione rompe la membrana cellulare, creando così un patch clamp a cellula intera che consente misurazioni di corrente per esperimenti di elettrofisiologia.

Stabilire una configurazione di voltage-clamp a cellula intera per registrazioni elettrofisiologiche in fette di cervello

Questo video delinea un metodo per l'imaging e la registrazione simultanea dell'attività elettrica da fette di cervello transgenico che contengono proteine fluorescenti specifiche per i neuroni. La procedura prevede il mantenimento della fetta di cervello in una camera di perfusione con liquido cerebrospinale artificiale aerato, l'utilizzo di una sorgente luminosa per eccitare le cellule marcate con fluorescenza e la registrazione dei segnali elettrici con una sonda multicanale e un patch clamp.

Monitoraggio ottico ed elettrofisiologico simultaneo delle cellule neuronali in fette di cervello

In questo video, le fette di cervello sono immobilizzate in una camera di registrazione e le cellule di interesse vengono localizzate e focalizzate utilizzando un microscopio controllato da computer. Il sistema automatizzato di elaborazione delle immagini posiziona quindi con precisione una pipetta patch per sigillare la membrana cellulare e monitorare i segnali elettrici.

Tecnica automatizzata di patch clamp guidata da immagini per lo studio dei neuroni nelle fette di cervello

Questo video mostra la procedura per mappare le connessioni sinaptiche fissando una fetta di cervello, posizionando pipette per ottenere configurazioni di cellule intere e stimolando i neuroni presinaptici a registrare le risposte postsinaptiche, chiarendo così la connettività neuronale.

Registrazione accoppiata con patch clamp delle connessioni neuronali in fette cerebrali acute

In questo articolo, si descrive un metodo utile per lo studio ligando funzione di canale ionico in neuroni di fettine di cervello acuto isolato. Questo metodo comporta l'uso di un farmaco-riempita micropipetta per applicazione locale di farmaci per neuroni registrati utilizzando tecniche standard di patch clamp.

Applicazione locale di farmaci allo studio delle funzioni recettore nicotinico in fettine di cervello del mouse

Le registrazioni di patch-clamp e il riempimento simultaneo di biocitina intracellulare di neuroni accoppiati sinapticamente in fette cerebrali acute consentono un'analisi correlata delle loro proprietà strutturali e funzionali. Lo scopo di questo protocollo è quello di descrivere le fasi tecniche essenziali della registrazione elettrofisiologica da microcircuiti neuronali e la loro successiva analisi morfologica.

Elettrofisiologici e morfologica Caratterizzazione neuronali Microcircuiti in Acute Fette cervello Utilizzando accoppiati di patch-clamp Recordings

Questo protocollo viene illustrata l'implementazione di un ottimizzato N-metilico-D-glucamine (NMDG) protezione recupero metodo di preparazione di fetta di cervello. Una formulazione di singolo supporto viene utilizzata per ottenere in modo affidabile fette di cervello sano da animali di tutte le età e per diverse applicazioni sperimentali.

Preparazione di fettine di cervello acuto utilizzando un' ottimizzata N-metilico-D-metodo di ripristino protettivo glucamine

Questo protocollo descrive passaggi procedurali di base per l'esecuzione di cellule intere registrazioni patch-clamp. Questa tecnica consente di studiare il comportamento elettrico dei neuroni, e quando eseguito in sezioni di cervello, permette di valutare diverse funzioni neuronali da neuroni che sono ancora integrati in circuiti cerebrali relativamente ben conservati.

Registrazioni Whole-cell patch-clamp nel cervello fette

La tecnica del patch clamp fetta è un metodo efficace per analizzare i cambiamenti indotti dall'apprendimento nella proprietà intrinseche e plasticità delle sinapsi eccitatorie o inibitorie.

Sezione tecnica del Patch Clamp per l'analisi di plasticità indotta su apprendimento

Le fette di cervello ex vivo possono essere utilizzate per studiare gli effetti degli anestetici volatili sulle risposte evocate agli input afferenti. L'optogenetica è impiegata per attivare indipendentemente afferenze talamocorticali e corticocorticali alla neocorteccia non primaria, e le risposte sinaptiche e di rete sono modulate con isoflurano.

Attivazione optogenetica delle vie afferenti nelle fette cerebrali e modulazione delle risposte mediante anestetici volatili

Impara la tecnica di patch-clamp automatico guidato per immagini per studiare l'attività neuronale in fettine acute di cervello. Questo metodo aumenta l'efficienza sperimentale e facilita screening farmacologici ad alto rendimento.

Applicazione di morsetto di patch automatico guidato per immagini per lo studio dei neuroni in fettine di cervello

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