Applicazione di morsetto di patch automatico guidato per immagini per lo studio dei neuroni in fettine di cervello
31 luglio 2017
Questo protocollo descrive come effettuare esperimenti automatici con patch-cluster guidati dall'immagine utilizzando un sistema recentemente sviluppato per apparecchiature elettrofisiologiche standard in vitro .
L'obiettivo generale di questa tecnologia è utilizzare la visione artificiale per rilevare automaticamente le cellule fluorescenti ed eseguire il patch clamp automatizzato di queste cellule in sezioni cerebrali acute. Questo metodo può contribuire a superare alcune difficoltà fondamentali nel campo dell'elettrofisiologia con patch clamp, come l'identificazione, il targeting e l'esecuzione del patch clamp su cellule marcate con fluorescenza. Il principale vantaggio di questa tecnica è la capacità di rilevare automaticamente le pipette per il patch clamp, le cellule fluorescenti e di integrare questi passaggi con il patch clamp automatico.
Questa innovazione aumenta in modo significativo la produttività sperimentale. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia o alla diagnosi di disturbi neurologici, poiché la tecnica automatica di patch-clamp guidata da immagini ad alta produttività può essere utilizzata per schermature farmacologiche in preparazioni neuronali più fisiologiche. Questo metodo può essere applicato anche ad altre preparazioni in vitro, come organelli neuronali tipici, colture di sezioni, neuroni dissociati, nonché a qualsiasi tipo di cellula non neuronale.
Per iniziare questa procedura, accendere l'amplificatore, il controllore del microscopio e il controllore del manipolatore. Successivamente, eseguire Autopatcher IG con Python da un terminale della riga di comando cambiando prima la directory in cui è installato Autopatcher IG. Quindi, digitare Python Autopatcher_IG.
PYW nel terminale della riga di comando e premere il tasto invio. Successivamente, riempire completamente la pipetta di vetro con la soluzione interna e caricarla sullo stadio. Spostare la punta della pipetta nel campo visivo del microscopio e metterla a fuoco.
Se il selettore numerico viene utilizzato per spostare i manipolatori nella piastra del microscopio, aggiornare le coordinate premendo Z sulla tastiera. La calibrazione principale converte l'angolo e la distanza dello spostamento del manipolatore nel sistema di coordinate del microscopio. Il manipolatore si muove in tre direzioni con una distanza preimpostata e il software rileva le coordinate della punta della pipetta all'interno del campo visivo del microscopio.
Fare clic sul pulsante di avvio della calibrazione nell'interfaccia grafica principale per l'unità corrispondente su cui è caricata la pipetta. Successivamente, salvare la calibrazione facendo clic su salva calibrazione nella parte inferiore dell'interfaccia grafica principale. Questa calibrazione primaria è necessaria solo una volta, a meno che non venga modificata l'organizzazione fisica dell'apparato.
In questo passaggio, posizionare una sezione cerebrale al centro della camera di registrazione. Stabilizzare la sezione cerebrale con un supporto per sezioni o con un arco. Per rilevare la cellula fluorescente, individuare l'area di interesse con un ingrandimento quattro volte.
Quindi, spostare la piastra del microscopio attivando la modalità clic per spostare e facendo clic sul centro dell'area di interesse. In alternativa, utilizzare il tastierino per spostare la piastra del microscopio. Successivamente, passare all'obiettivo ad alto ingrandimento e regolare la messa a fuoco spostando il microscopio lungo l'asse Z utilizzando il tasto RF sul tastierino.
Il software guida il microscopio e la fotocamera per acquisire una serie di immagini a diverse profondità. Successivamente, queste immagini vengono sottoposte a un'elaborazione mediante visione artificiale per individuare le cellule marcate con fluorescenza. L'output finale è un elenco delle coordinate delle cellule rilevate.
Fare clic sul pulsante "rileva cellula" nella colonna principale dell'interfaccia grafica (GUI), unità zero. Se la sorgente luminosa a LED o laser dell'apparato non può essere controllata tramite segnale TTL, accendere manualmente il LED o il laser. Spegnere il LED o il laser se necessario.
Un elenco di coordinate cellulari verrà visualizzato nell'interfaccia grafica delle posizioni di memoria. Rimuovere le cellule indesiderate dall'elenco facendo clic sul pulsante X accanto alle coordinate. In alternativa, se le cellule bersaglio non sono marcate con fluorescenza, fare clic su modalità mouse nell'interfaccia grafica principale.
Quindi, fare clic sulla cellula di interesse: apparirà un punto giallo con un numero sulla cellula e le coordinate della cellula verranno visualizzate nell'interfaccia grafica delle posizioni di memoria. Per eseguire la calibrazione secondaria al fine di rilevare le coordinate di offset della pipetta, riempire 1/3 di una pipetta di vetro con la soluzione interna. Successivamente, inserire la pipetta nel supporto per pipette collegato alla testa dello stadio.
Ingrandendo poco, utilizzare i tasti uno e due sul tastierino numerico per passare dall'unità uno all'unità due. Successivamente, portare la pipetta nel campo visivo e regolare la messa a fuoco utilizzando il tastierino numerico. Quindi, caricare la calibrazione principale facendo clic su carica calibrazione.
Passare all'obiettivo del microscopio ad alta ingrandimento e fare clic 40 volte sull'interfaccia grafica principale. Portare la punta della pipetta al centro. Quindi, fare clic sul pulsante di calibrazione secondaria nell'interfaccia grafica principale, sotto l'unità in uso.
Per eseguire il patching di una cellula bersaglio, fare clic sul pulsante di controllo del patch per aprire l'interfaccia grafica di controllo del patch. Fare clic sul pulsante vai a posizione accanto alla cellula di interesse nell'elenco delle coordinate presente nell'interfaccia grafica della posizione di memoria. Successivamente, fare clic sul pulsante CTM dell'unità nell'interfaccia grafica principale per abilitare lo spostamento.
Fare clic sulla cellula di interesse per spostare la punta della pipetta sulla cellula. A causa delle limitazioni meccaniche del manipolatore, quando si percorre una distanza superiore a 500 micrometri, potrebbe verificarsi un lieve errore di posizionamento. Per prevenire un ampio errore meccanico di posizionamento, è necessario eseguire una calibrazione secondaria nelle vicinanze della cellula bersaglio.
Successivamente, utilizzare il pulsante dell'unità selezionata per commutare il segnale di ingresso tra le due unità. Fare clic sul pulsante patch nell'interfaccia grafica di controllo del patch. Il patching automatico avrà inizio e la pressione e la resistenza potranno essere monitorate tramite l'interfaccia grafica di controllo del patch.
L'algoritmo di patching automatico monitora la resistenza e controlla la pressione attraverso una serie di cicli logici, al fine di formare un gigaseal. Una finestra popup notifica la formazione del gigaseal. Il sistema utilizza la variazione della resistenza per riconoscere il contatto con la superficie cellulare.
Nel caso in cui il contatto con la superficie cellulare non venga rilevato in tempo, utilizzare il pulsante successivo per avanzare alla fase di patch mantenendo lo stesso tentativo di patch automatico. Manipolare il processo automatico in qualsiasi momento cliccando sui rispettivi pulsanti nell'interfaccia di controllo del patch. Successivamente, selezionare sì per effettuare l'ingresso con combinazione di Zap e aspirazione.
In alternativa, selezionare "no" per interrompere solo con aspirazione. Quindi, salvare il registro della patch dell'esperimento. Questa figura mostra le posizioni selezionate caricate nell'interfaccia grafica della sequenza di comandi.
La colonna di sinistra mostra l'elenco delle coordinate e la colonna di destra mostra l'elenco dei comandi sotto forma di segnali TTL per ciascuna posizione. Di seguito sono riportate le schermate durante l'esperimento di applicazione del farmaco, corrispondenti alle tre posizioni selezionate. La soluzione di KCL è stata mescolata con un colorante fluorescente rosso allo scopo di visualizzazione.
L'unità uno era la pipetta contenente KCl e l'unità due era la pipetta per il patching. In questa figura, le iniezioni di corrente a gradino mostrano un neurone con scarica regolare. Sono mostrati qui i tracciati di registrazione in volt-clamp derivanti dall'applicazione locale di soluzione di cloruro di potassio 500 millimolare in tre posizioni diverse.
La traccia rossa con corrente entrante è stata registrata durante la prova in cui l'applicazione di cloruro di potassio era vicina alla cellula in patch. La freccia rossa indica il momento dell'applicazione del cloruro di potassio. Utilizzando questo metodo, è possibile eseguire una prova di patch clamp entro quattro minuti senza un addestramento approfondito, rispetto al patching manuale.
Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'optogenetica, la chemogenetica e manipolazioni farmacologiche, al fine di rispondere a domande relative al proprio progetto di ricerca. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica potrebbe aprire la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per esplorare studi ad alto rendimento su recettori sinaptici e canali ionici in diverse preparazioni in vitro. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire esperimenti di patch clamp automatizzati guidati da immagini.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per eseguire esperimenti automatici di patch-clamp guidati da immagini, utilizzando tecnologie avanzate di visione artificiale. Questo approccio aumenta l'efficienza nell'identificazione e nel targeting di cellule marcate con fluorescenza in sezioni cerebrali acute.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Elefisiologia
- Neuroscienze
- Tecniche di imaging
Sfondo
- La tecnica di elettrofisiologia patch-clamp è fondamentale per lo studio dell'attività neuronale.
- L'identificazione e il targeting di cellule specifiche possono risultare difficili.
- Le tecniche automatizzate possono migliorare la produttività sperimentale.
- La marcatura fluorescente facilita l'identificazione delle cellule.
Scopo dello studio
- Automatizzare il rilevamento di cellule fluorescenti per esperimenti di patch-clamp.
- Aumentare l'efficienza delle registrazioni elettrofisiologiche.
- Semplificare i test farmacologici in preparati neuronali.
Metodi Utilizzati
- Tecnologia di visione artificiale per il rilevamento delle cellule.
- Configurazione automatizzata del patch-clamp per la registrazione.
- Integrazione dei processi di rilevamento e registrazione.
- Applicazione a diverse preparazioni neuronali in vitro.
Risultati principali
- Automazione riuscita dell'identificazione cellulare e del patch-clamping.
- Aumento della produttività negli esperimenti elettrofisiologici.
- Applicazioni potenziali nella ricerca farmacologica.
- Versatilità nell'applicazione a diversi tipi cellulari.
Conclusioni
- Questa tecnica migliora in modo significativo l'efficienza sperimentale.
- Permette di affrontare le principali sfide dei metodi tradizionali di patch-clamp.
- L'approccio ha implicazioni per la ricerca sulle patologie neurologiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La tecnica automatizzata del patch clamp guidato da immagini affronta le limitazioni in termini di produttività nell'elettrofisiologia neuronale, consentendo una validazione funzionale scalabile di bersagli canali ionici e recettori sinaptici. Questa capacità supporta i flussi di lavoro della scoperta precoce riducendo la variabilità tecnica e aumentando la densità dei dati per le campagne di identificazione dei composti promettenti. Il metodo migliora l'affidabilità predittiva nella validazione dei bersagli fornendo letture elettrofisiologiche quantitative e riproducibili da preparazioni neuronali fisiologicamente rilevanti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante la misurazione diretta dell'eccitabilità neuronale e delle proprietà sinaptiche in cellule marcate con fluorescenza.
- Valore operativo: Riduce la dipendenza da operatori esperti, standardizzando l'esecuzione del patch clamp tra diversi utenti e sedi.
- Valore predittivo: Aumenta la quantità di dati ottenuti per esperimento, favorendo il rigore statistico negli studi sull'interazione con il bersaglio e sui meccanismi d'azione.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Genera preparazioni neuronali standardizzate adatte a campagne di screening farmacologiche e genetiche successive.
- Output quantitativo: Fornisce metriche in tempo reale di resistenza e pressione che consentono il rilevamento automatizzato della formazione del sigillo e l'ottimizzazione del processo.
- Scalabilità: Permette il targeting multiplo di più cellule per fetta, aumentando la densità sperimentale senza incrementi proporzionali del tempo operativo.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la malattia: Facilita lo studio dei fenotipi neuronali in sezioni cerebrali acute, mantenendo l'architettura nativa dei circuiti e il contesto fisiopatologico.
- Continuità traslazionale: Collega l'elettrofisiologia di scoperta alla validazione preclinica, consentendo letture coerenti tra diversi sistemi modello.
- De-risking meccanicistico: Permette la valutazione diretta degli effetti dei composti sulla funzione dei canali ionici e sui pattern di attivazione neuronale in tessuto integro.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della biologia della scoperta come passaggio di validazione funzionale successivo all'identificazione del bersaglio e precedente all'ottimizzazione del composto leader, fornendo una conferma elettrofisiologica dell'interazione con il bersaglio in ambienti neuronali naturali.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi consentendo la registrazione automatizzata e ad alta fedeltà dell'attività neuronale in risposta a perturbazioni farmacologiche o genetiche.
- Screening: Migliora la riproducibilità e la capacità analitica del saggio, permettendo la valutazione sistematica di librerie di composti sull'eccitabilità neuronale e sulla trasmissione sinaptica.
- Analisi: Fornisce letture elettrofisiologiche quantitative (ad esempio, frequenza di scarica, resistenza di ingresso, relazioni corrente-voltaggio) che informano sulle relazioni struttura-attività e sulla selettività del bersaglio.
- Ricerca traslazionale: Mantiene la rilevanza fisiologica registrando l'attività dai neuroni in fette cerebrali acute, preservando i profili di espressione nativi e i segnali del microambiente.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità elettrofisiologica riutilizzabile applicabile in diversi programmi di scoperta nel campo delle neuroscienze, rivolti a canali ionici, recettori accoppiati a proteine G (GPCR) e proteine sinaptiche.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Migliora la fiducia nella validazione degli obiettivi attraverso una misurazione diretta e quantitativa della funzione neuronale in preparazioni fisiologicamente rilevanti.
- Valore operativo: Aumenta la produttività sperimentale e riduce la variabilità mediante l'automazione della rilevazione delle cellule, del targeting e dell'esecuzione della patch.
- Valore strategico: Permette decisioni più rapide di tipo go/no-go generando dati funzionali solidi già nelle fasi iniziali del processo di scoperta.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione degli obiettivi in base al rischio, basandosi sulla modulazione elettrofisiologica confermata in circuiti neuronali rilevanti per la malattia.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in elettrofisiologia, integrazione della visione artificiale e utilizzo di micromanipolatori per la configurazione del sistema e la risoluzione dei problemi.
- Dipende da un'etichettatura fluorescente stabile, dalla preparazione adeguata delle pipette per il patch-clamp e dal controllo ambientale per il mantenimento ottimale delle fette.
- Necessita di protocolli software standardizzati e procedure di calibrazione per garantire la riproducibilità tra esperimenti e utenti.
- L'adattamento a tipi cellulari non neuronali o dissociati potrebbe richiedere modifiche agli algoritmi di rilevamento e ai parametri di formazione del patch.
- I limiti pratici includono errori meccanici di posizionamento a distanze elevate e la dipendenza da rapporti ottimali segnale-rumore fluorescente per un rilevamento cellulare affidabile.
