Applicazione di morsetto di patch automatico guidato per immagini per lo studio dei neuroni in fettine di cervello
31 luglio 2017
Questo protocollo descrive come effettuare esperimenti automatici con patch-cluster guidati dall'immagine utilizzando un sistema recentemente sviluppato per apparecchiature elettrofisiologiche standard in vitro .
L'obiettivo generale di questa tecnologia è quello di utilizzare la visione artificiale per rilevare automaticamente le cellule fluorescenti ed eseguire il patch clamp automatizzato di queste cellule in fette cerebrali acute. Questo metodo può aiutare a superare le principali difficoltà nel campo dell'elettrofisiologia del patch clamp, come l'identificazione, il targeting e il patch clamp di cellule marcate in fluorescenza. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è in grado di rilevare automaticamente pipette patch, celle fluorescenti e integrare i passaggi con il patch clamp automatico.
Questa innovazione aumenta significativamente la produttività sperimentale. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia o alla diagnosi di disturbi neurologici, perché il patch clamp automatico guidato da immagini ad alta produttività può essere utilizzato per screening farmacologici in preparazioni neuronali più fisiologiche. Questo metodo può essere applicato anche ad altre preparazioni in vitro, come gli organelli neuronali tipici, o le colture a fette, i neuroni dissociati e qualsiasi cellula non neuronale.
Per iniziare questa procedura, accendere l'amplificatore, il controller del microscopio e il controller del manipolatore. Quindi, esegui Autopatcher IG con python da un terminale a riga di comando modificando prima la directory in cui è installato Autopatcher IG. Quindi, digita Python Autopatcher_IG.
PYW nel terminale della riga di comando e premere il tasto Invio. Successivamente, riempire tutta la pipetta di vetro con la soluzione interna e caricarla sullo stadio principale. Spostare la punta della pipetta sul campo visivo del microscopio e metterla a fuoco.
Se la tastiera viene utilizzata per spostare i manipolatori nel tavolino del microscopio, aggiornare le coordinate premendo Z sulla tastiera. La calibrazione primaria converte l'angolo e la distanza di movimento del manipolatore nel sistema di coordinate del microscopio. Il manipolatore viaggia in tre direzioni con distanza preimpostata e il software rileva le coordinate della punta della pipetta all'interno del campo visivo del microscopio.
Fare clic sul pulsante di avvio della calibrazione sulla GUI principale per l'unità corrispondente su cui è caricata la pipetta. Successivamente, salvare la calibrazione facendo clic su Salva calibrazione nella parte inferiore della GUI principale. Questa taratura primaria deve essere eseguita una sola volta, a meno che l'organizzazione fisica del carro non venga modificata.
In questo passaggio, posizionare una fetta di cervello al centro della camera di registrazione. Stabilizza la fetta di cervello con una presa a fetta o un'arpa. Per rilevare la cella fluorescente, trova l'area di interesse sotto l'ingrandimento quattro volte.
Quindi, spostare il tavolino del microscopio attivando la modalità clic per spostare e fare clic sul centro dell'area di interesse. In alternativa, utilizzare la tastiera per spostare il tavolino del microscopio. Quindi, passare alla lente ad alto ingrandimento e regolare la messa a fuoco spostando il microscopio sull'asse Z utilizzando RF sulla tastiera.
Il software dirige il microscopio e la fotocamera per scattare una serie di immagini a diverse profondità. Quindi, queste immagini vengono sottoposte all'elaborazione della visione artificiale per trovare cellule marcate in fluorescenza. L'output finale è un elenco di coordinate delle celle rilevate.
Fare clic sul pulsante di rilevamento della cella sulla colonna principale della GUI unità zero. Se il LED o la sorgente luminosa laser della configurazione non possono essere controllati dal segnale TTL, accendere manualmente il LED o il laser. Spegnere il LED o il laser se necessario.
Un elenco di coordinate delle celle apparirà nella GUI delle posizioni di memoria. Rimuovi le celle indesiderate dall'elenco facendo clic sul pulsante X accanto alle coordinate. In alternativa, se le celle target non sono marcate in modo fluorescente, fare clic su Modalità mouse sulla GUI principale.
Quindi, fai clic sulla cella di interesse, sulla cella apparirà un punto giallo con un numero e le coordinate della cella appariranno nella GUI delle posizioni di memoria. Per eseguire la calibrazione secondaria al fine di rilevare le coordinate di offset della pipetta, riempire 1/3 di una pipetta di vetro con soluzione interna. Quindi, caricare la pipetta sul supporto per pipetta fissato allo stadio principale.
A basso ingrandimento, utilizzare uno e due sulla tastiera per passare dall'unità uno all'unità due. Quindi, portare la pipetta nel campo visivo e regolare la messa a fuoco utilizzando la tastiera. Quindi, caricare la calibrazione primaria facendo clic su calibrazione del carico.
Impostare l'obiettivo del microscopio su un ingrandimento elevato e fare clic 40 volte sull'interfaccia grafica principale. Portare la punta della pipetta al centro. Quindi, fare clic sul pulsante di calibrazione secondaria sulla GUI principale, sotto l'unità in uso.
Per applicare una patch a una cella di destinazione, fare clic sul pulsante di controllo patch per aprire l'interfaccia grafica di controllo patch. Fare clic sul pulsante Vai a accanto alla cella di interesse nell'elenco delle coordinate nell'interfaccia grafica della posizione di memoria. Successivamente, fare clic sul pulsante CTM dell'unità nella GUI principale per abilitare il movimento.
Fare clic sulla cella di interesse per spostare la punta della pipetta sulla cellula. A causa della limitazione meccanica del manipolatore, quando si viaggia per una distanza superiore a 500 micrometri, potrebbe verificarsi un leggero errore di posizionamento. Per evitare un errore di posizionamento meccanico di grandi dimensioni, è necessario eseguire una calibrazione secondaria vicino alla cella target.
Quindi, utilizzare il pulsante selezionato dall'unità per commutare il segnale di ingresso tra le due unità. Fare clic sul pulsante patch nella GUI di controllo patch. Inizierà il patching automatico e la pressione e la resistenza potranno essere monitorate sulla GUI di controllo patch.
L'algoritmo di patching automatico monitora la resistenza e controlla la pressione attraverso una serie di loop logici, per formare un gigaseal. Una finestra popup notifica la formazione di un gigaseal. Il sistema utilizza la variazione di resistenza per riconoscere il contatto cella-superficie.
Nella situazione in cui il contatto cellula-superficie non viene rilevato in tempo, utilizzare il pulsante successivo per avanzare nella fase di applicazione delle patch rimanendo nella stessa prova di applicazione automatica delle patch. Manipolare il processo automatico in qualsiasi momento facendo clic sui rispettivi pulsanti sulla GUI di controllo patch. Quindi, selezionare sì per eseguire il rodaggio con Zap e aspirazione combinati.
In alternativa, selezionare no per rodare solo con l'aspirazione. Quindi, salva il registro delle patch dell'esperimento. Questa figura mostra le posizioni selezionate caricate nell'interfaccia grafica della sequenza di comandi.
La colonna di sinistra mostra l'elenco delle coordinate e la colonna di destra mostra l'elenco dei comandi sotto forma di segnali TTL per ogni posizione. Ecco gli screenshot durante l'esperimento di applicazione del farmaco, corrispondenti alle tre posizioni selezionate. La soluzione di KCL è stata miscelata con colorante fluorescente rosso ai fini della visualizzazione.
L'unità uno era la pipetta contenente KCL e l'unità due era la pipetta di patching. In questa figura, le iniezioni di corrente di passo mostrano un normale neurone a picco. Qui sono mostrate le tracce di registrazione del morsetto di tensione dall'applicazione locale di una soluzione di cloruro di potassio da 500 millimolari in tre posizioni.
La traccia rossa con corrente verso l'interno è stata registrata dallo studio quando l'applicazione di cloruro di potassio era vicina alla cella patch. La freccia rossa indica i tempi di applicazione del cloruro di potassio. Utilizzando questo metodo, è possibile eseguire una prova di patch clamp entro quattro minuti senza una formazione approfondita rispetto al patching manuale.
Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'optogenetica, la chemiogenetica e le manipolazioni farmacologiche per rispondere alle domande relative al progetto di ricerca. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica potrebbe aprire la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per esplorare studi ad alto rendimento dei recettori sinaptici e dei canali ionici in diverse preparazioni in vitro. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire esperimenti di patch clamp automatizzati guidati da immagini.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per condurre esperimenti di patch-clamp guidati da immagini automatiche utilizzando una tecnologia avanzata di visione artificiale. Questo approccio migliora l'efficienza nell'identificazione e nel targeting di cellule marcate fluorescentemente in sezioni cerebrali acute.
Componenti Principali dello Studio
Area della Scienza
- Eletrofisiologia
- Neuroscienza
- Tecniche di Imaging
Contesto
- L'elettrofisiologia patch-clamp è cruciale per studiare l'attività neuronale.
- Identificare e targetizzare cellule specifiche può essere impegnativo.
- Le tecniche automatizzate possono migliorare il rendimento sperimentale.
- Il marcaggio fluorescente aiuta nell'identificazione delle cellule.
Obiettivo dello Studio
- Automatizzare la rilevazione di cellule fluorescenti per esperimenti patch-clamp.
- Aumentare l'efficienza delle registrazioni elettrofisiologiche.
- Facilitare gli screening farmacologici in preparazioni neuronali.
Metodi Utilizzati
- Tecnologia di visione artificiale per il rilevamento delle cellule.
- Setup patch-clamp automatizzato per la registrazione.
- Integrazione dei processi di rilevamento e registrazione.
- Applicazione a varie preparazioni neuronali in vitro.
Risultati Principali
- Automazione di successo dell'identificazione delle cellule e del patch-clamping.
- Aumento del rendimento per gli esperimenti elettrofisiologici.
- Possibili applicazioni nella ricerca farmacologica.
- Versatilità nell'applicazione a diversi tipi di cellule.
Conclusioni
- Questa tecnica migliora significativamente l'efficienza sperimentale.
- Affronta le sfide chiave nei metodi patch-clamp tradizionali.
- L'approccio ha implicazioni per la ricerca sui disturbi neurologici.
Domande Frequenti
Executive Industry Relevance
Automated image-guided patch clamp addresses throughput limitations in neuronal electrophysiology, enabling scalable functional validation of ion channel and synaptic receptor targets. This capability supports early discovery workflows by reducing technical variability and increasing data density for lead identification campaigns. The method enhances predictive confidence in target validation by providing quantitative, reproducible electrophysiological readouts from physiologically relevant neuronal preparations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct measurement of neuronal excitability and synaptic properties in fluorescently labeled cells.
- Operational Value: Reduces reliance on expert operators, standardizing patch clamp execution across users and sites.
- Predictive Value: Increases data yield per experiment, supporting statistical rigor in target engagement and mechanism of action studies.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized neuronal preparations suitable for downstream pharmacological and genetic screening campaigns.
- Quantitative Output: Provides real-time resistance and pressure metrics that enable automated seal formation detection and process optimization.
- Scalability: Supports multiplexed targeting of multiple cells per slice, increasing experimental density without proportional increases in operator time.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Facilitates study of neuronal phenotypes in acute brain slices, maintaining native circuitry and pathophysiological context.
- Translational Continuity: Bridges discovery electrophysiology with preclinical validation by enabling consistent readouts across model systems.
- Mechanistic De-risking: Allows direct assessment of compound effects on ion channel function and neuronal firing patterns in intact tissue.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology workflows as a functional validation step following target identification and preceding lead optimization, providing electrophysiological confirmation of target engagement in native neuronal environments.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling automated, high-fidelity recording of neuronal activity in response to pharmacological or genetic perturbations.
- Screening: Enhances assay reproducibility and throughput, allowing systematic evaluation of compound libraries on neuronal excitability and synaptic transmission.
- Analytics: Delivers quantitative electrophysiological readouts (e.g., spike frequency, input resistance, current-voltage relationships) that inform structure-activity relationships and target selectivity.
- Translational Research: Maintains physiological relevance by recording from neurons in acute brain slices, preserving native expression profiles and microenvironmental cues.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electrophysiology capability applicable across neuroscience discovery programs targeting ion channels, GPCRs, and synaptic proteins.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves target validation confidence through direct, quantitative measurement of neuronal function in physiologically relevant preparations.
- Operational Value: Increases experimental throughput and reduces variability via automation of cell detection, targeting, and patch execution.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions by generating robust functional data early in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on confirmed electrophysiological modulation in disease-relevant neuronal circuits.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, computer vision integration, and micromanipulator operation for system setup and troubleshooting.
- Dependent on stable fluorescence labeling, appropriate patch pipette preparation, and environmental control for healthy slice maintenance.
- Necessitates standardized software protocols and calibration procedures to ensure reproducibility across experiments and users.
- Adaptation to non-neuronal or dissociated cell types may require adjustments to detection algorithms and patching parameters.
- Practical limitations include mechanical positioning errors at extended travel distances and dependency on optimal fluorescent signal-to-noise ratios for reliable cell detection.
