Indagine di Synaptic Tagging / Cattura e Cross-cattura utilizzando acuta fettine di ippocampo da Roditore

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare la plasticità a lungo termine e i suoi processi associativi, come il marcatore sinaptico, l'acquisizione e il marcatore incrociato, nei neuroni paramediali CA1 utilizzando fette ippocampali Q da roditori. Questo viene ottenuto prima dissezionando il cervello e isolando rapidamente l'ippocampo in un liquido cerebrospinale artificiale ossigenato e freddo. Il secondo passaggio consiste nel preparare fette ippocampali acute utilizzando un tagliatore manuale per tessuti e incubarle in una camera a interfaccia.

Successivamente, due elettrodi stimolanti e due elettrodi di registrazione vengono posizionati nella regione CA1 per registrare risposte di EPSP di campo e risposte di spike di popolazione da due input sinaptici. Il passaggio finale consiste nell'indurre una forma transitoria di plasticità in un input sinaptico e una forma persistente di plasticità in un altro input entro una finestra temporale specifica. Infine, le risposte di EPSP di campo provenienti da entrambi gli input vengono registrate per periodi prolungati al fine di studiare i meccanismi di tagging sinaptico, di cattura e di cattura incrociata.

La marcatura e il recupero sinaptico forniscono una base concettuale per comprendere come la memoria a breve termine si trasformi in memoria a lungo termine entro un determinato arco di tempo. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché i passaggi sperimentali sono difficili da apprendere, in quanto richiedono stimolazione e registrazione da più input sinaptici. La procedura sarà dimostrata da Mahesh Shira, Machete e Maima Sharma, studenti laureati del mio laboratorio.

Per iniziare questa procedura, preparare un liquido cerebrospinale artificiale (A CSF) e spumeggiarlo con una miscela di 95% di ossigeno e 5% di anidride carbonica. Riempire la parte inferiore della camera a interfaccia con acqua distillata fino a circa il 70% della sua capacità. Successivamente, accendere il controllore di temperatura impostato a 32 gradi Celsius.

Successivamente, lavare la camera superiore per 10-15 minuti facendo passare acqua distillata attraverso il tubo di ingresso a flusso elevato, prima di passare ad A CSF a un flusso di un millilitro al minuto. Quindi posizionare una rete nella camera superiore per fornire una superficie di appoggio per le sezioni. Avviare il carbogen nella camera inferiore immergendo il tubo di ingresso nell'A CSF che viene continuamente carbogenato.

Attendere 20 minuti affinché il liquido CSF A sia saturato con carbogeno e riempia la camera superiore. In questo passaggio, montare una lametta sul taglia tessuti e assicurarsi che il bordo tagliente sia perfettamente allineato. Verificare tagliando un piccolo pezzo di carta filtro per assicurarsi che la lametta sia saldamente fissata.

Quindi impostare il micrometro vernier scorrevole sulla sua posizione iniziale. Ora ottenere la testa di un ratto eutanasizzato e, utilizzando una forbice a iride, praticare un taglio attraverso il cranio posteriore per rimuovere il bulbo encefalico. Successivamente, effettuare un piccolo incisione lungo il lato destro del cranio e un'incisione più lunga sul lato sinistro.

Rimuovere con attenzione il cranio utilizzando un trapano per osso a partire dal lato sinistro e procedendo verso il lato destro del cranio. Per esporre la corteccia e il sottile strato di dura madre che la ricopre, rimuovere con cura la dura madre utilizzando una spatola sottile, quindi rimuovere le placche frontali insieme all'osso. Successivamente, rimuovere la dura madre residua in corrispondenza della giunzione tra corteccia e cervelletto utilizzando l'estremità piatta della spatola, evitando di danneggiare il cervello mantenendo la pressione verso l'alto.

Utilizzando la spatola, prelevare delicatamente il cervello e posizionarlo in una piastra di Petri posta su un blocco refrigerante in alluminio riempito con A CSF fredda e gassata per isolare l'ippocampo. Utilizzando un bisturi numero 11, effettuare un taglio dritto per rimuovere il cervelletto e un altro taglio per rimuovere un quarto della porzione anteriore del cervello. Successivamente, eseguire un taglio sagittale superficiale lungo la linea mediana, partendo dalla linea mediana.

Rimuovere con attenzione la corteccia utilizzando lo scaler a falce per esporre l'ippocampo dorsale. Successivamente, rimuovere lo strato di corteccia sovrastante l'ippocampo. Praticare un piccolo taglio alla commessura ippocampale.

Rimuovere delicatamente l'ippocampo con lo scaler a falce, partendo dall'estremità dorsale utilizzando movimenti rotatori. Successivamente, rimuovere qualsiasi corteccia e tessuti connettivi intorno all'ippocampo isolato utilizzando l'estremità curva dello scaler a falce. Per tagliare il tessuto ippocampale, posizionare un pezzo di carta filtrante Watman da 30 millimetri imbevuta di liquido cerebrospinale (CSF) sulla piattaforma di taglio del tagliatore manuale.

Trasferire il tessuto ippocampale sulla carta da filtro. Utilizzando l'estremità piatta del bisturi a falce, spostare la carta da filtro in modo da allineare l'ippocampo in un'orientazione corretta rispetto alla lama del tagliacampione, in modo che l'ippocampo venga tagliato con un angolo di circa 70 gradi rispetto al fia. Successivamente, asciugare la soluzione in eccesso che circonda il tessuto ippocampale.

Con una carta filtro piegata, sezionare l'ippocampo in senso trasversale e scartare il tessuto proveniente dall'estremità estrema dell'ippocampo, dove la morfologia del taglio non è chiara. Successivamente, tagliare il tessuto rimanente in fette spesse 400 micron regolando il micrometro nonio dopo ogni serie di tagli. Dopo ogni taglio, trasferire delicatamente la fetta dalla lama utilizzando un pennello con setole morbide in un piccolo becher riempito con A CSF fredda e gassata.

Quindi trasferire delicatamente le sezioni sulla rete nella camera per sezioni utilizzando una pipetta Pasteur di plastica pulita. Con una punta larga, regolare attentamente la posizione delle sezioni in modo da facilitare la localizzazione dell'elettrodo e la verifica della registrazione, assicurandosi che le sezioni siano sufficientemente circondate da uno strato di A CSF, ma non completamente immerse. Successivamente, coprire la camera e incubare le sezioni per due o tre ore negli esperimenti di marcatura sinaptica e cattura.

Sotto il microscopio, posizionare i due elettrodi stimolanti nello strato radiatum della regione CA1 per stimolare le fibre collaterali di Schaffer e un elettrodo di registrazione nella regione dendritica apicale del CA1, a metà strada tra gli elettrodi stimolanti. Per registrare le risposte F-E-P-S-P, posizionare un altro elettrodo di registrazione nello strato pyramidale. DO strato per la registrazione del potenziale di popolazione.

Quando tutti gli elettrodi toccano la sezione, applicare una stimolazione di prova per verificare che sia possibile ottenere un segnale adeguato di EPSP di campo in entrambi gli ingressi. Una volta ottenuto un segnale F-E-P-S-P adeguato, abbassare con attenzione gli elettrodi di circa 200 micron utilizzando le manopole di movimento fine dei manipolatori. Successivamente, attendere 20 minuti per consentire alla sezione di riprendersi.

In seguito, determinare la relazione ingresso-uscita misurando la pendenza del PEPS di campo in un intervallo di intensità di corrente compreso tra 20 microampere e 100 microampere. Quindi, per ogni ingresso, impostare l'intensità di stimolazione che evoca una pendenza del PEPS di campo pari al 40% del valore massimo come stimolo costante per tutta la durata dell'esperimento. Dopo 15-20 minuti, iniziare a registrare una linea di base stabile della durata minima di 30-60 minuti prima dell'induzione di LTP-LTD in un ingresso; in un ingresso, indurre un LTP precoce utilizzando un protocollo di tetanizzazione debole costituito da una singola stimolazione ad alta frequenza.

Mentre l'altro ingresso continua a registrare il valore di base per 30 minuti dopo l'induzione dell'LTP precoce, indurre un LTP tardivo nell'ingresso S due, utilizzando un protocollo di tetanizzazione forte che prevede stimolazioni ad alta frequenza ripetute con un intervallo interstimolo di 10 minuti. Successivamente, registrare le risposte del PECC di campo per periodi prolungati al fine di rivelare la trasformazione dell'LTP precoce nell'ingresso S uno in LTP tardivo mediante il processo di marcatura sinaptica e cattura. Analogamente, in un esperimento di cattura incrociata, indurre prima un LTP precoce in un ingresso, seguito dopo 30 minuti dall'induzione di un LTD tardivo in un altro ingresso, utilizzando un protocollo di stimolazione a bassa frequenza forte costituito da 900 raffiche in una durata di 15 minuti.

Quindi registrare le risposte EPSP del campo per durate prolungate per rivelare la trasformazione dell'LTP precoce nell'input S1 in LTP tardivo mediante il cross capture. In questa rappresentazione, due elettrodi stimolanti sono posizionati nello strato radiatum della regione CA1 per stimolare due input sinaptici indipendenti ma sovrapposti. Su neuroni paramediali CA1 due elettrodi di registrazione extracellulare.

Uno per registrare F-E-P-S-P dal compartimento dendritico apicale e un altro per registrare lo spike di popolazione somatico dai corpi cellulari parametrali situati rispettivamente nello strato radiatum e nello strato pyramidale. Questa figura mostra la settimana precedente al paradigma forte utilizzato per lo studio della marcatura sinaptica e dell'acquisizione.

Una tetanizzazione debole è applicata a S1 per indurre una LTP precoce, seguita da una tetanizzazione forte di S2 a 30 minuti per indurre una LTP tardiva, e questa figura mostra il periodo precedente al paradigma forte per lo studio del cross-tagging. La LTP precoce è indotta da una tetanizzazione debole in S1, seguita dall'induzione di una LTD tardiva in S2 mediante un protocollo di stimolazione a bassa frequenza intensa. Dopo 30 minuti in S1, la LTP precoce si trasforma in LTP tardiva che dura sei ore, dimostrando il fenomeno del cross-tagging e capture.

Una volta padroneggiata, questa tecnica di dissezione e preparazione di fette può essere eseguita molto rapidamente in tre-cinque minuti. Pertanto, la vitalità delle fette può essere preservata per registrazioni a lungo termine. Utilizzando questo metodo, è inoltre possibile verificare gli effetti di diversi agenti farmacologici sui processi di marcatura sinaptica e di cattura.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come condurre esperimenti sulla plasticità funzionale a lungo termine e sui processi di marcatura sinaptica e cattura.