Indagine di Synaptic Tagging / Cattura e Cross-cattura utilizzando acuta fettine di ippocampo da Roditore

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare la plasticità a lungo termine e i suoi processi associativi come il tagging sinaptico, la cattura e il cross tagging nei neuroni parametallici CA one utilizzando fette di ippocampo Q da roditori. Ciò si ottiene sezionando prima il cervello e isolando rapidamente l'ippocampo nel liquido cerebrospinale artificiale freddo ossigenato. Il secondo passo consiste nel preparare fette acute dell'ippocampo utilizzando un'affettatrice manuale e incubarle in una camera di interfaccia.

Successivamente, due elettrodi stimolanti e due elettrodi di registrazione sono posizionati nella regione CA 1 per registrare le risposte EPSP di campo e di picco della popolazione da due input sinaptici. Il passo finale consiste nell'indurre una forma transitoria di plasticità in un input sinaptico e una forma persistente di plasticità in un altro input all'interno di una specifica finestra temporale. In definitiva, le risposte EPSP sul campo da entrambi gli input vengono registrate per periodi prolungati per studiare i meccanismi di cattura e cattura incrociata del tagging sinaptico.

Il tagging e l'acquisizione sinaptica forniscono una base concettuale per il modo in cui la memoria a breve termine si trasforma in memoria a lungo termine entro un determinato periodo di tempo. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi sperimentali sono difficili da apprendere perché coinvolgono la stimolazione e la registrazione da più input sinaptici. A dimostrare la procedura saranno Mahesh Shira, studenti laureati in machete e maima Sharma del mio laboratorio.

Per iniziare questa procedura, preparare un liquido cerebrospinale e farlo bollire con il 95% di ossigeno e il 5% di anidride carbonica. Riempire il fondo della camera di interfaccia con acqua distillata fino a circa il 70% della sua capacità. Quindi accendere il regolatore di temperatura preimpostato a 32 gradi Celsius.

Quindi, lavare la camera superiore per 10-15 minuti facendo scorrere acqua distillata attraverso il tubo di afflusso ad alta portata prima di passare ad A CSF a una portata di un millilitro al minuto. Quindi posizionare una rete nella camera superiore per fornire una superficie di appoggio per le fette. Avviare il carbogeno nella camera inferiore, immergere il tubo di afflusso nell'A CSF che viene continuamente carbogeno.

Attendere 20 minuti affinché l'A CSF sia saturo di carbogeno e riempia la camera superiore. In questa fase, montare una lama di rasoio sul tritatutto e assicurarsi che il tagliente sia allineato in modo uniforme. Testare tagliando una piccola carta da filtro per assicurarsi che la lama sia ben fissata.

Quindi impostare il micrometro a nonio scorrevole nella posizione iniziale. Ora prendi la testa di un ratto soppresso e usando una forbice dell'iride, fai un taglio attraverso il cranio posteriore per rimuovere il tronco cerebrale. Quindi fai una piccola incisione lungo il lato destro del cranio e un'incisione più lunga a sinistra.

Rimuovere con cautela il cranio con un UR osseo partendo dal lato sinistro e andando verso il lato destro del cranio. Per rivelare la corteccia e il sottile strato di dura madre che la ricopre, rimuovere con cura la dura madre con una spatola sottile e poi rimuovere le placche frontali con l'osso. Successivamente, rimuovere la dura madre rimanente in particolare nella giunzione tra la corteccia e il cervelletto con l'estremità piatta di una spatola ed evitare di danneggiare il cervello mantenendo la pressione verso l'alto.

Usando la spatola, raccogli delicatamente il cervello in una capsula di Petri su un blocco di raffreddamento di alluminio riempito con liquido cerebrospinale freddo e gassato per isolare l'ippocampo usando un bisturi numero 11, fai un taglio dritto per rimuovere il cervelletto e un altro taglio per rimuovere un quarto della parte anteriore del cervello. Quindi eseguire un taglio sagittale poco profondo lungo la linea mediana. A partire dalla linea mediana.

Rimuovere con cautela la corteccia con l'ablatore a falce per rivelare l'ippocampo dorsale. Successivamente, rimuovi lo strato di corteccia sopra l'ippocampo. Fai un piccolo taglio alla commessura ippocampale.

Rimuovere delicatamente l'ippocampo con l'ablatore a falce, partendo dall'estremità dorsale con movimenti rotatori. Successivamente, rimuovere la corteccia e i tessuti connettivi attorno all'ippocampo isolato utilizzando l'estremità curva dell'ablatore a falce. Per affettare il tessuto ippocampale, posizionare un pezzo di carta da filtro watman da 30 millimetri imbevuta di liquido cerebrospinale sulla fase di affettatura dell'affettatrice manuale.

Trasferisci il tessuto ippocampale sulla carta da filtro. Usando l'estremità piatta dell'ablatore a falce, spostare la carta da filtro per allineare l'ippocampo con un orientamento corretto rispetto alla lama dell'affettatrice, in modo che l'ippocampo venga tagliato con un angolo di circa 70 gradi rispetto alla fia. Quindi, tampona la soluzione in eccesso che circonda il tessuto ippocampale.

Con una carta da filtro piegata, affettare l'ippocampo, trasversalmente, e scartare il tessuto dall'estremità dell'ippocampo dove la morfologia della fetta non è chiara. Quindi affettare il tessuto rimanente in fette spesse 400 micron regolando il micrometro a nonio dopo ogni ciclo di affettatura. Dopo ogni taglio, trasferire delicatamente la fetta dalla lama utilizzando un pennello con setole morbide in un piccolo bicchiere riempito con A CSF gassato freddo.

Quindi trasferire delicatamente le fette sulla rete nella camera delle fette utilizzando una pipetta di plastica pulita. Con una punta larga, regolare attentamente la posizione delle fette in modo da facilitare la posizione degli elettrodi e controllare la registrazione per assicurarsi che le fette siano sufficientemente circondate da uno strato di A CSF, ma non completamente sommerse. Dopodiché, copri la camera e incuba le fette per due o tre ore in esperimenti di marcatura sinaptica e cattura.

Al microscopio posizionare i due elettrodi stimolanti nello strato radi dell'atomo CA 1 per stimolare le fibre collaterali di Schaffer e quando si registra l'elettrodo nella regione dendritica apicale di ca one a metà strada tra gli elettrodi stimolanti. Per registrare le risposte F-E-P-S-P, posizionare un altro elettrodo di registrazione nello strato paride. Livello DO per la registrazione del picco di popolazione.

Quando tutti gli elettrodi toccano la fetta, erogare una stimolazione di prova per garantire che sia possibile ottenere un segnale EPSP di campo adeguato in entrambi gli ingressi. Una volta ottenuto un segnale F-E-P-S-P corretto, abbassare con cautela gli elettrodi di circa 200 micron utilizzando le manopole di movimento fine dei manipolatori. Quindi attendere 20 minuti affinché la fetta si riprenda.

Successivamente, determinare la relazione di ingresso e uscita misurando la pendenza del campo EPSP su una gamma di intensità di corrente da 20 microampere a 100 microampere. Quindi, per ogni input, impostare l'intensità di stimolazione che evoca il 40% della pendenza massima dell'EPSP del campo come stimoli costanti durante l'esperimento. Dopo 15-20 minuti, iniziare a registrare la registrazione del basale una linea di base stabile di almeno 30-60 minuti prima dell'induzione L-T-P-L-T-D in un input, indurre un LTP precoce utilizzando un protocollo di tetina debole costituito da una singola stimolazione ad alta frequenza.

Mentre l'altro input continua a registrare il basale 30 minuti dopo l'induzione precoce dell'LTP, indurre un LTP tardivo nell'input S due, utilizzando un protocollo di tetina forte che prevede una stimolazione ripetuta ad alta frequenza con un intervallo intertreno di 10 minuti. Quindi registrare le risposte EPSP sul campo per durate estese per rivelare la trasformazione dell'LTP precoce in input S uno in LTP tardivo mediante l'etichettatura sinaptica e la cattura. Allo stesso modo, in un esperimento di cattura incrociata, indurre prima un LTP precoce e un input seguito 30 minuti dopo da un'induzione LTD tardiva in un altro input, utilizzando un forte protocollo di stimolazione a bassa frequenza costituito da 900 burst in una durata di 15 minuti.

Quindi registrare le risposte EPSP sul campo per periodi prolungati per rivelare la trasformazione dell'LTP precoce nell'input S uno in LTP tardivo mediante l'acquisizione incrociata. In questa rappresentazione, due elettrodi stimolanti sono posizionati nello strato radi dell'atomo CA 1 per stimolare due input sinaptici indipendenti ma sovrapposti. Su CA un neurone parametallico due elettrodi di registrazione extracellulare.

Uno per registrare F-E-P-S-P dal compartimento dendritico apicale. E un altro per registrare il picco di popolazione somatica dai corpi cellulari parametallici si trova rispettivamente nello strato radi atomo e nello strato para. Questa figura mostra la settimana prima del forte paradigma per studiare il tagging e la cattura sinaptica.

La tetina debole viene applicata a S uno per indurre LTP precoce, seguita da tetina forte di S due a 30 minuti per indurre LTP tardiva, e questa figura mostra la settimana prima del paradigma forte per studiare il cross tagging. L'LTP precoce è indotta da una tetina debole in S uno, seguita dall'induzione di LTD tardiva in S due utilizzando un forte protocollo di stimolazione a bassa frequenza. Dopo 30 minuti in S one, l'LTP iniziale viene trasformato in LTP tardivo della durata di sei ore, mostrando il cross tagging e l'acquisizione.

Una volta padroneggiata, questa tecnica di dissezione e preparazione della fetta può essere eseguita molto rapidamente entro tre o cinque minuti. Pertanto, la vitalità delle fette può essere preservata per registrazioni a lungo termine. Utilizzando questo metodo, è possibile testare anche gli effetti di diversi agenti farmacologici sui processi di marcatura e cattura sinaptica.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come condurre esperimenti di plasticità funzionale a lungo termine e dei processi di tagging e cattura sinaptica.