Fluorescenza-mediata di tomografia per la rilevazione e la quantificazione di infiammazione intestinale murina del macrofago-correlati
15 dicembre 2017
Specifica della destinazione sonde rappresenta uno strumento innovativo per l'analisi dei meccanismi molecolari, come espressione della proteina in vari tipi di malattia (ad es., infiammazione, infezione e tumorigenesi). In questo studio, descriviamo una valutazione tomografica tridimensionale quantitativa di infiltrazione del macrofago intestinale in un modello murino di colite usando la tomografia di fluorescenza-mediata specifica per F4/80.
L'obiettivo generale di questo approccio di imaging in vivo specifico per il bersaglio è visualizzare i marcatori molecolari dell'attività della malattia nella malattia infiammatoria intestinale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle malattie infiammatorie intestinali e della ricerca terapeutica correlata sull'influenza delle terapie sperimentali o di specifici eventi cellulari sull'infiammazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'attività della malattia può essere monitorata longitudinalmente e in modo non invasivo.
Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui disturbi infiammatori, può anche essere applicato per studiare altre malattie, come il cancro o le malattie immunitarie. Per indurre la colite, riempire la scorta di acqua potabile dei topi sperimentali con due grammi di destrano solfato di sodio, o DSS, disciolto in 100 millilitri di acqua potabile autoclavata, stimando cinque millilitri di acqua per topo al giorno. 24 ore prima della scansione, caricare il cocktail di anticorpi di interesse in una siringa sterile al riparo dalla luce e iniettare gli anticorpi per via endovenosa nelle vene della coda degli animali da esperimento.
Il giorno dell'esperimento, utilizzare un rasoio elettrico per radere il pelo nella regione addominale degli animali da esperimento per ridurre al minimo la riflessione e l'assorbimento della luce. Utilizzando un fantoccio che imita i tessuti di spessore e caratteristiche di assorbimento definiti, riempire il fantoccio con un volume specifico della soluzione anticorpale di interesse e misurare la fluorescenza sul dispositivo FMT. Quindi, su una tomografia veterinaria mediata da fluorescenza o dispositivo FMT per piccoli animali, fare clic su Nuovo studio e includere i traccianti pertinenti nella descrizione dello studio, inclusi i parametri di imaging e le dosi.
Creare gruppi di studio secondo il disegno sperimentale, dotando ogni gruppo del numero appropriato di animali. Quando il sistema è stato calibrato per i costrutti traccianti, posizionare il primo topo anestetizzato in posizione supina in una cassetta per esami riscaldabile a 42 gradi Celsius. Inserire la cassetta nel sistema di imaging e selezionare il campione appropriato dal gruppo di studio corrispondente.
Selezionare il tracciante somministrato per assicurarsi che i valori della concentrazione del tracciante siano calcolati correttamente e acquisire l'immagine di riflettanza della fluorescenza alla lunghezza d'onda appropriata per la scansione. Fare clic su Acquisisci immagine per delineare il campo di scansione e confermare che il campo di scansione appaia come una sovrapposizione sull'immagine di riflettanza della fluorescenza. Regolare il campo di scansione fino a circondare la regione di interesse, facendo attenzione a evitare errori o aree di pelo rimanente.
A seconda della destinazione dell'immagine, selezionare una risoluzione del campo di scansione per impostare il numero di punti dati dell'immagine all'interno del campo di scansione. Quindi fare clic su Scansione per iniziare l'acquisizione dell'immagine alla lunghezza d'onda selezionata. Al termine della scansione, rimuovere l'animale dalla cassetta per consentire all'animale di riprendersi completamente con il monitoraggio prima di tornare nella sua gabbia.
L'FMT può quindi essere ripetuto in vari punti temporali a seconda della funzione sperimentale. Per analizzare le immagini acquisite, aprire l'apposito software di analisi delle immagini e selezionare i dati grezzi per la prima scansione. Utilizzando lo strumento di ricostruzione, crea mappe 3D della distribuzione della fluorescenza.
Quando tutte le scansioni sono state aggiunte al set di dati di ricostruzione appropriato, aprire il primo set di dati di interesse. Verranno mostrate tutte le scansioni eseguite per il singolo animale da esperimento selezionato. Selezionare la scansione appropriata e fare clic su Carica.
Una ricostruzione 3D della distribuzione del tracciante apparirà come una sovrapposizione dell'immagine di riflettanza della fluorescenza inizialmente acquisita. Successivamente, identifica i punti focali dell'accumulo di etichette non specifiche sulle mappe 3D ricostruite e utilizza lo strumento di misurazione per selezionare la regione di interesse. Il software genererà quindi un'intensità di fluorescenza per la regione di interesse, nonché misurazioni della quantità picomolare del tracciante per il quale è stata calibrata la scansione.
In questo esperimento, è stato impiegato un anticorpo coniugato a fluorescenza contro F4/80 murino per visualizzare direttamente i macrofagi attivati. Un accumulo significativamente elevato di tracciante fluorescente è stato misurato mediante tomografia mediata da fluorescenza nel colon dei topi colitici rispetto agli animali di controllo non colitici, indicando un aumento dell'infiltrazione di monociti e della differenziazione in macrofagi attivi negli animali colitici. Al contrario, l'applicazione di un anticorpo IgG coniugato a fluorescenza non specifico non ha provocato una risposta di fluorescenza rilevabile nell'addome o nell'intestino nel gruppo di controllo colitico o non colitico, dimostrando la specificità dell'interazione sonda-bersaglio dell'anticorpo F4/80.
Le misurazioni ex vivo dell'accumulo di traccianti diretti a F4/80 nei colon espiantati verificano ulteriormente l'origine del colon dell'accumulo di tracciante F4/80 rilevato in vivo. Infatti, quantità calcolate di anticorpi legati si correlano bene con un numero istologicamente determinato di macrofagi infiltranti, confermando che l'imaging in vivo con traccianti specifici può essere indicativo dell'attività locale della malattia. Una volta padroneggiato, questo può essere eseguito e analizzato in un paio di minuti se eseguito correttamente.
Le fasi di preparazione, compresa la produzione di traccianti specifici a base di anticorpi, richiedono in genere da due a tre giorni. Quando si pianifica una procedura sperimentale come questa, è importante includere controlli appropriati e affidabili, sia per l'anticorpo che per il modello di malattia animale. Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la colonscopia o la citometria a flusso, per rispondere a ulteriori domande e per convalidare e quantificare i dati.
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Panoramica
Questo studio presenta un approccio di imaging in vivo specifico per il bersaglio, finalizzato alla visualizzazione di marcatori molecolari dell'attività della malattia nella malattia infiammatoria intestinale. Avvalendosi di una valutazione tomografica tridimensionale quantitativa, la ricerca si concentra sull'infiltrazione di macrofagi intestinali in un modello murino di colite.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Immunologia
- Malattia Infiammatoria Intestinale
Contesto
- I sonde specifiche per il bersaglio sono strumenti innovativi per l'analisi dei meccanismi molecolari.
- Possono essere utilizzate per studiare l'espressione proteica in varie malattie.
- Questo metodo consente un monitoraggio longitudinale e non invasivo dell'attività della malattia.
- Può essere applicato a disturbi infiammatori, cancro e malattie correlate al sistema immunitario.
Scopo dello studio
- Visualizzare i marcatori molecolari dell'attività della malattia nella malattia infiammatoria intestinale.
- Indagare domande fondamentali nella ricerca terapeutica relative all'infiammazione.
- Valutare l'influenza di terapie sperimentali sull'infiammazione.
Metodi Utilizzati
- Induzione di colite mediante l'uso di sodio dextrano solfato (DSS).
- Somministrazione endovenosa di un cocktail di anticorpi in topi sperimentali.
- Tomografia mediata da fluorescenza per l'immagine dell'infiltrazione di macrofagi.
- Monitoraggio longitudinale dell'attività della malattia in vivo.
Risultati principali
- Visualizzazione riuscita dell'infiltrazione dei macrofagi intestinali.
- Dimostrata la capacità di monitorare l'attività della malattia in modo non invasivo.
- Forniti approfondimenti sulle dinamiche dell'infiammazione nella colite.
- Sono state identificate potenziali applicazioni per lo studio di altre malattie.
Conclusioni
- L'approccio di imaging specifico per il bersaglio è efficace per lo studio della malattia infiammatoria intestinale.
- Questo metodo può migliorare la comprensione dei meccanismi della malattia e degli effetti terapeutici.
- La ricerca futura potrà estenderne l'applicazione ad altre malattie infiammatorie e correlate al sistema immunitario.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
L'imaging longitudinale non invasivo dell'infiltrazione dei macrofagi consente la rilevazione precoce delle risposte infiammatorie in modelli preclinici, riducendo la dipendenza da endpoint terminali e supportando la riduzione del rischio meccanicistica di terapie antinfiammatorie. La tomografia quantitativa a fluorescenza 3D fornisce un'elevata affidabilità predittiva sull'interazione con il bersaglio e sugli effetti modificanti la malattia, guidando le decisioni di avanzamento o interruzione nei programmi per la malattia infiammatoria intestinale e altre patologie immuno-mediate. Questo approccio migliora la continuità traslazionale allineando i risultati dell'imaging in vivo con la validazione istopatologica, ottimizzando la selezione del portafoglio e l'allocazione delle risorse nei percorsi di scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante la visualizzazione dell'accumulo di macrofagi positivi per F4/80 come lettura funzionale dell'infiammazione intestinale.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico grazie a interazioni specifiche tra sonda e bersaglio, dimostrate dall'assenza di segnale nei controlli con IgG non specifiche.
- Valore predittivo: Correla l'accumulo del tracciante in vivo con il legame dell'anticorpo ex vivo e con i conteggi istologici dei macrofagi, rafforzando la fiducia nel bersaglio per lo screening di immunomodulatori.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Genera mappe quantitative standardizzate di fluorescenza 3D e misurazioni di traccianti nell'ordine dei picomoli, consentendo schermature riproducibili di composti in modelli di colite.
- Scalabilità: Permette il monitoraggio longitudinale in diversi punti temporali, riducendo l'utilizzo di animali e aumentando la potenza statistica negli studi sull'efficacia terapeutica.
- Riutilizzo della piattaforma: Compatibile con la validazione successiva mediante colonscopia o citometria a flusso, supportando flussi di lavoro integrati per la validazione degli obiettivi terapeutici e l'allineamento dei biomarcatori.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Modella l'infiammazione intestinale attraverso la colite indotta da DSS, un sistema ampiamente utilizzato per lo studio della patogenesi delle malattie infiammatorie intestinali (IBD) e della risposta terapeutica.
- Continuità traslazionale: Collega l'imaging non invasivo agli endpoint istologici, consentendo decisioni di avanzamento aggiustate per il rischio basate su dati concordanti in vivo e ex vivo.
- De-risking meccanicistico: Monitora l'infiltrazione di monociti e la dinamica della differenziazione dei macrofagi, fornendo informazioni sui meccanismi cellulari d'azione dei terapeutici sperimentali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
La tomografia mediata da fluorescenza si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'identificazione del composto promettente fino ai test di efficacia preclinica, in particolare per composti immunomodulanti nell'infiammazione gastrointestinale.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi quantificando l'infiltrazione di macrofagi come lettura farmacodinamica della modulazione del percorso nei modelli di colite.
- Screening: Fornisce output quantitativi pronti per il saggio (intensità di fluorescenza, concentrazione del tracciante) che consentono il confronto tra gruppi di trattamento e punti temporali.
- Analisi: Fornisce set di dati tridimensionali ricostruibili e misurazioni di regioni di interesse che facilitano l'analisi statistica degli effetti del trattamento sulla localizzazione delle cellule immunitarie.
- Ricerca traslazionale: Collega l'imaging in vivo alla validazione ex vivo, rafforzando l'allineamento dei biomarcatori e la continuità preclinica per candidati mirati alla MII.
- Riutilizzo aziendale: Rappresenta una capacità di imaging riutilizzabile applicabile al di fuori dell'infiammazione intestinale, nel tracciamento delle cellule immunitarie, negli studi sulle cellule staminali e nei modelli di oncologia.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica mediante un'immagine specifica e quantificabile dell'attività dei macrofagi.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la standardizzazione grazie alla quantificazione calibrata del tracciante e al monitoraggio longitudinale intra-individuale.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo decisioni precoci di prosecuzione o interruzione basate sul monitoraggio non invasivo dell'attività della malattia, riducendo il rischio biologico in fase avanzata.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione adeguata al rischio attraverso dati concordanti di imaging e dati istologici, affinando i criteri di avanzamento nei percorsi di immunomodulatori.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'imaging a fluorescenza, nella preparazione dei traccianti e nella gestione di piccoli animali per iniezioni endovenose e protocolli di anestesia.
- È subordinato all'accesso a un sistema di tomografia mediata da fluorescenza per piccoli animali dotato di selezione appropriata delle lunghezze d'onda e software di ricostruzione.
- Necessita di una standardizzazione tra i gruppi di lavoro per quanto riguarda i protocolli di imaging, il dosaggio dei traccianti e l'analisi delle regioni di interesse, al fine di garantire un'interpretazione coerente dei dati.
- Comporta considerazioni di adattamento tra diversi sistemi modello, inclusa la rimozione del pelo e l'ottimizzazione dell'imaging addominale per ridurre al minimo le interferenze del segnale.
- Comprende limitazioni pratiche, come il tempo necessario di 2–3 giorni per la preparazione del tracciante e la necessità di controlli appropriati di isotipo e di malattia per assicurare la specificità.
