Fluorescenza-mediata di tomografia per la rilevazione e la quantificazione di infiammazione intestinale murina del macrofago-correlati

L'obiettivo generale di questo approccio di imaging in vivo specifico per il bersaglio è visualizzare i marcatori molecolari dell'attività della malattia nella malattia infiammatoria intestinale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle malattie infiammatorie intestinali e della ricerca terapeutica correlata sull'influenza delle terapie sperimentali o di specifici eventi cellulari sull'infiammazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'attività della malattia può essere monitorata longitudinalmente e in modo non invasivo.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui disturbi infiammatori, può anche essere applicato per studiare altre malattie, come il cancro o le malattie immunitarie. Per indurre la colite, riempire la scorta di acqua potabile dei topi sperimentali con due grammi di destrano solfato di sodio, o DSS, disciolto in 100 millilitri di acqua potabile autoclavata, stimando cinque millilitri di acqua per topo al giorno. 24 ore prima della scansione, caricare il cocktail di anticorpi di interesse in una siringa sterile al riparo dalla luce e iniettare gli anticorpi per via endovenosa nelle vene della coda degli animali da esperimento.

Il giorno dell'esperimento, utilizzare un rasoio elettrico per radere il pelo nella regione addominale degli animali da esperimento per ridurre al minimo la riflessione e l'assorbimento della luce. Utilizzando un fantoccio che imita i tessuti di spessore e caratteristiche di assorbimento definiti, riempire il fantoccio con un volume specifico della soluzione anticorpale di interesse e misurare la fluorescenza sul dispositivo FMT. Quindi, su una tomografia veterinaria mediata da fluorescenza o dispositivo FMT per piccoli animali, fare clic su Nuovo studio e includere i traccianti pertinenti nella descrizione dello studio, inclusi i parametri di imaging e le dosi.

Creare gruppi di studio secondo il disegno sperimentale, dotando ogni gruppo del numero appropriato di animali. Quando il sistema è stato calibrato per i costrutti traccianti, posizionare il primo topo anestetizzato in posizione supina in una cassetta per esami riscaldabile a 42 gradi Celsius. Inserire la cassetta nel sistema di imaging e selezionare il campione appropriato dal gruppo di studio corrispondente.

Selezionare il tracciante somministrato per assicurarsi che i valori della concentrazione del tracciante siano calcolati correttamente e acquisire l'immagine di riflettanza della fluorescenza alla lunghezza d'onda appropriata per la scansione. Fare clic su Acquisisci immagine per delineare il campo di scansione e confermare che il campo di scansione appaia come una sovrapposizione sull'immagine di riflettanza della fluorescenza. Regolare il campo di scansione fino a circondare la regione di interesse, facendo attenzione a evitare errori o aree di pelo rimanente.

A seconda della destinazione dell'immagine, selezionare una risoluzione del campo di scansione per impostare il numero di punti dati dell'immagine all'interno del campo di scansione. Quindi fare clic su Scansione per iniziare l'acquisizione dell'immagine alla lunghezza d'onda selezionata. Al termine della scansione, rimuovere l'animale dalla cassetta per consentire all'animale di riprendersi completamente con il monitoraggio prima di tornare nella sua gabbia.

L'FMT può quindi essere ripetuto in vari punti temporali a seconda della funzione sperimentale. Per analizzare le immagini acquisite, aprire l'apposito software di analisi delle immagini e selezionare i dati grezzi per la prima scansione. Utilizzando lo strumento di ricostruzione, crea mappe 3D della distribuzione della fluorescenza.

Quando tutte le scansioni sono state aggiunte al set di dati di ricostruzione appropriato, aprire il primo set di dati di interesse. Verranno mostrate tutte le scansioni eseguite per il singolo animale da esperimento selezionato. Selezionare la scansione appropriata e fare clic su Carica.

Una ricostruzione 3D della distribuzione del tracciante apparirà come una sovrapposizione dell'immagine di riflettanza della fluorescenza inizialmente acquisita. Successivamente, identifica i punti focali dell'accumulo di etichette non specifiche sulle mappe 3D ricostruite e utilizza lo strumento di misurazione per selezionare la regione di interesse. Il software genererà quindi un'intensità di fluorescenza per la regione di interesse, nonché misurazioni della quantità picomolare del tracciante per il quale è stata calibrata la scansione.

In questo esperimento, è stato impiegato un anticorpo coniugato a fluorescenza contro F4/80 murino per visualizzare direttamente i macrofagi attivati. Un accumulo significativamente elevato di tracciante fluorescente è stato misurato mediante tomografia mediata da fluorescenza nel colon dei topi colitici rispetto agli animali di controllo non colitici, indicando un aumento dell'infiltrazione di monociti e della differenziazione in macrofagi attivi negli animali colitici. Al contrario, l'applicazione di un anticorpo IgG coniugato a fluorescenza non specifico non ha provocato una risposta di fluorescenza rilevabile nell'addome o nell'intestino nel gruppo di controllo colitico o non colitico, dimostrando la specificità dell'interazione sonda-bersaglio dell'anticorpo F4/80.

Le misurazioni ex vivo dell'accumulo di traccianti diretti a F4/80 nei colon espiantati verificano ulteriormente l'origine del colon dell'accumulo di tracciante F4/80 rilevato in vivo. Infatti, quantità calcolate di anticorpi legati si correlano bene con un numero istologicamente determinato di macrofagi infiltranti, confermando che l'imaging in vivo con traccianti specifici può essere indicativo dell'attività locale della malattia. Una volta padroneggiato, questo può essere eseguito e analizzato in un paio di minuti se eseguito correttamente.

Le fasi di preparazione, compresa la produzione di traccianti specifici a base di anticorpi, richiedono in genere da due a tre giorni. Quando si pianifica una procedura sperimentale come questa, è importante includere controlli appropriati e affidabili, sia per l'anticorpo che per il modello di malattia animale. Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la colonscopia o la citometria a flusso, per rispondere a ulteriori domande e per convalidare e quantificare i dati.