In vivo metodo di imaging per distinguere infiammazione acuta e cronica

L'obiettivo generale di questa procedura è distinguere visivamente l'infiammazione acuta e cronica nei topi vivi. Ciò si ottiene mediante iniezione sottocutanea di quattro, palla 12 me state, 13 acetato o PMA per innescare un'intensa risposta infiammatoria acuta. Successivamente viene eseguita l'iniezione intraperitoneale di substrato chemiluminescente, luminol o lucigeno per indurre segnali luminosi nel sito dell'infiammazione.

La luminescenza del luminol indica un'infiammazione acuta. Mentre il lucigeno in luminescenza rivela aree di infiammazione cronica o in fase avanzata, l'animale viene quindi posizionato all'interno di un imager a bioluminescenza, che visualizza i segnali di luminescenza prodotti dai substrati di chemiluminescenza nei siti di infiammazione. Vengono quindi eseguite fasi di imaging sequenziale per catturare l'emissione massima di luminescenza per l'analisi quantitativa e la procedura di imaging viene ripetuta in vari punti temporali per seguire diverse risposte infiammatorie.

In definitiva, i risultati dell'imaging longitudinale mostrano risposte infiammatorie differenziali basate sulla cinetica di emissione dei due substrati luminescenti. Dato l'importante ruolo dell'infiammazione in una varietà di malattie umane, riteniamo che questo metodo di imaging non invasivo possa aiutare a studiare i ruoli differenziali di neutrofili e macrofagi in una varietà di condizioni patologiche. A dimostrare la procedura sarà la signora

Tanya Topper e le tecnologie di imaging di un laboratorio. Inizia questo protocollo con la preparazione dei reagenti e delle soluzioni come descritto nel protocollo di testo, anestetizzare i topi nudi NCR e confermare l'anestesia generale mediante perdita di movimento e frequenza respiratoria costante. Trasferire un animale in un cono nasale alimentato con gas misto isof fluoruro per mantenere l'animale sotto anestesia.

Utilizzare una salvietta imbevuta di alcol isopropilico per pulire e disinfettare il sito di iniezione sul fianco sinistro. Utilizzando una tecnica sterile, iniettare 50 microlitri della soluzione di inoculazione della PMA nello spazio sottocutaneo. Sul fianco sinistro.

Rimuovere il liquido in eccesso dal sito di iniezione utilizzando un tampone di alcol isopropilico. Riportare l'animale nella gabbia di stabulazione e monitorare attentamente il suo recupero dall'anestesia. Per facilitare il recupero, utilizzare un termoforo per mantenere l'animale al caldo dopo l'anestesia dell'animale.

Come prima, prepararsi a iniettare per via intraperitoneale, 10 milligrammi per millilitro di soluzione di luminol per l'imaging dell'infiammazione acuta o 2,5 milligrammi per millilitro di lucigeno in soluzione per l'imaging dell'infiammazione cronica. Il dosaggio finale è di 100 milligrammi per chilogrammo per il luminol e di 25 milligrammi per chilogrammo. Per la lucin, può essere utilizzata una dose più bassa di lucin per evitare possibili tossicità.

Per alcuni ceppi di topi, trasferire l'animale nella camera di imaging di un sistema di imaging a bioluminescenza. Eseguire l'imaging sequenziale a bioluminescenza a intervalli di un minuto. Ogni fase dell'imaging è composta da un tempo di acquisizione di un minuto.

F-stop pari a un binning pari a 16 e un ritardo di zero secondi. All'interno del pannello di acquisizione delle immagini, abilitare l'imaging sequenziale in più fasi facendo clic sul pulsante di impostazione della sequenza. Fornire 15 passaggi di imaging di un minuto nel profilo di acquisizione per determinare l'uscita massima di luminescenza.

La sessione di imaging di 15 minuti consente un tempo sufficiente per l'assorbimento del substrato e la circolazione sistemica. Dopo l'acquisizione dell'immagine, trasferire l'animale dalla camera di imaging alla gabbia di alloggiamento. Per facilitare il recupero, utilizzare un termoforo per mantenere l'animale al caldo.

Durante l'analisi post-acquisizione, utilizzare il pacchetto software di imaging per calcolare il segnale di bioluminescenza totale di picco attraverso regioni di interesse o ROI standardizzate. Le immagini sono presentate come radianza con indicazione della soglia minima e massima. I dati quantitativi sono presentati come flusso totale in fotoni al secondo.

Per R-O-I-P-M-A è un potente agonista della proteina chinasi C che attiva la volpe per la produzione di ioni superossido e innesca intense risposte infiammatorie acute. L'iniezione sottocutanea di PMA in topi nudi NCR ha causato una rapida irritazione cutanea e un'infiammazione acuta nei siti di iniezione. Queste immagini rappresentano l'imaging longitudinale a bioluminescenza utilizzando luminolo e lucina come substrati nelle prime fasi dell'infiammazione.

Si osserva una significativa bioluminescenza del luminol che indica alti livelli di attività della mielo perossidasi dei neutrofili o dell'MPO nei siti di iniezione del PMA. Al contrario, non è stata osservata alcuna lucidità significativa nella bioluminescenza durante queste prime fasi dell'infiammazione a partire dal secondo giorno, formazione di croste e quindi luminescenza ridotta. L'intensità è stata osservata quando la guarigione delle ferite è diventata evidente.

È stato osservato un aumento della bioluminescenza del lugen. Questi risultati illustrano che la bioluminescenza del luminolo è associata alla fase acuta dell'infiammazione, mentre il lugen in bioluminescenza è strettamente associato alla riparazione dei tessuti nelle fasi tardive dell'infiammazione. Insieme. Questo risultato dimostra la capacità di utilizzare la sottospecificità differenziale per distinguere gli stadi infiammatori acuti e cronici.

È importante sottolineare che l'imaging è mediato dall'attività enzimatica endogena delle cellule immunitarie e non c'è bisogno dell'espressione del cazzo dei reporter.