Name: Tomografia Computerizzata guidata nel dominio del tempo Tomography Diffuse fluorescenza in animali di piccola taglia per la localizzazione dei biomarcatori tumorali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Scopri la tomografia a fluorescenza diffusa guidata da TC per visualizzare i biomarcatori tumorali in modelli murini di glioma. Questa tecnica combina imaging ottico e raggi X per monitorare terapie molecolari con elevata sensibilità.

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Questo lavoro è stato finanziato da borse di studio del National Cancer Institute di R01 CA120368, le R01 CA109558 (KMT, RWH, FEG, BWP), RO1 CA132750 (MJ, BWP) e K25 CA138578 (FL), e la Canadian Institutes of Research Award borsa Salute post-dottorato (KMT ). Lo sviluppo del sistema di tomografia di fluorescenza è stato parzialmente finanziato da Advanced Research Technologies (Montreal, QC).

1. Preparazione degli animali <ol><li> Anestetizzare topo nudo (Charles River, Wilmington, MA) con intra-peritoneale iniezione di ketamina xilazina (100 mg / kg: 10 mg / kg ip). </li><li> Luogo del mouse nel frame stereotassico, fare un&#39;incisione nel cuoio capelluto sul lato sinistro del cranio e, utilizzando un ago calibro 18, creare un 1 mm di diametro foro nel cranio, 2 mm dalla linea centrale e 2 mm dietro il bregma. </li><li> Iniettare 5 × 10 5 U251 cellule umane di glioblastoma neuronali (gentilmente fornito dal Dr. Mark Israele a Dartmouth College, Hanover, NH) in 5 ml di soluzione tampone fosfato nell&#39;emisfero cerebrale sinistro ad una profondità di circa 2 mm sotto la superficie del cervello. Utilizzare un micro-siringa Hamilton 18 ed un smussato fine 27-gauge per l&#39;impianto delle cellule ed inserire la punta dell&#39;ago 3 millimetri dalla superficie esterna del cranio e poi ritirarsi 1 mm a creare una tasca per le cellule. </li><li> Suture sito di incisione e consentire recupero da un intervento chirurgico. </li><li> Attendere ~ 14 giorni per permettere al tumore di crescere prima di imaging. </li></ol> 2. Fluorescenza Tomografia sistema di calibrazione <ol><li> Il giorno di imaging mouse, avviare il sistema e consentire laser e sensori di luce per riscaldare per circa 20 minuti per evitare derive della sensibilità del sistema. </li><li> Mettere a 100 °-by-4 ° di ingegneria linea diffusore (Thorlabs, Newton, NJ), al centro diretta del portale imaging, normale al laser di eccitazione: un picosecondo-pulsato 80-MHz multimodale 635 nm diodo laser (PicoQuant Photonics Nord America Inc., Westfield, MA). Regolare l&#39;angolo del diffusore per massimizzare la quantità di segnale rilevata da tutti i canali di raccolta luce cinque. Una descrizione completa della geometria di imaging viene fornito altrove 11,14,15. </li><li> Posizionare OD 2 filtri a densità neutra (Thorlabs, Newton, NJ) davanti a tutti i tubi fotomoltiplicatori fluorescenza di rilevamento (PMT) e OD 1 filtri a densità neutra (Thorlabs, Newton, NJ) di fronte a PMT rilevamento tutti trasmittanza. Raccogliere 100 profili temporali diffusione impulsi (TPSF) del laser, ciascuno con una 1-s tempo di integrazione. </li><li> Normalizzare ogni TPSF dal riferimento laser, corretto per la deriva temporale di riferimento laser, e la media di tutte le iterazioni per ogni rivelatore. Questi sono i medi TPSFs rilevatore specifiche funzioni di risposta dello strumento (IRF) utilizzati nella ricostruzione dell&#39;immagine ottica. </li></ol> 3. Imaging Protocol <ol><li> Anestetizzare la topo con 2% di isoflurano ossigeno (1 L / min). </li><li> Iniettare 1 nanomole di IRDye 800CW-EGF e 1 nanomole di Alexa Fluor 647 in 100 ml di soluzione tampone fosfato, per via intraperitoneale, 12 ore prima di imaging per indirizzare la crescita epidermico fattore di sovraespressione del recettore nel tumore. </li><li> Posizionare il mouse sulle vetroresina supporta del letto imaging, disponendo il mouse in modo che il suo naso rimane in un cono di fornire l&#39;anestesia isoflurano. </li><li> EnAssicurarsi che il mouse viene posizionato opportunamente sul letto: cioè, che quando il letto è fissato nel sistema tomografia fluorescenza il mouse è al centro approssimativo del cavalletto di imaging. Tale posizionamento può essere guidata ruotando il laser di eccitazione 180 ° sul mouse, assicurando che il punto focale del laser illumina un punto approssimativamente al centro del mouse dal punto di vista del laser a tutti gli angoli. </li><li> Una volta posizionato, trasferire accuratamente il letto di imaging e il mouse per il microCT (eXplore Locus, GE Healthcare, London, ON) scanner e raccogliere informazioni anatomiche con una risoluzione di 93 micron isotropo per la testa tutto il mouse. </li><li> Visualizzare la serie di immagini CT e scegliere la fetta (s) di essere ripreso con il sistema di tomografia fluorescenza. </li><li> Trasferire accuratamente il letto di imaging e il mouse al sistema tomografia di fluorescenza. Scegli il numero di posizioni di origine per raccogliere i dati relativi il mouse per ogni SLIC di imaginge (32), il tempo di integrazione per ogni misurazione TPSF (1 s), il numero di iterazioni per ogni posizione della sorgente (10), e la posizione e il numero di fette di imaging desiderati dalla serie di immagini CT dal punto 3,6. I numeri tra parentesi sono valori tipici per ciascun parametro di imaging cedere ~ 5 minuti di acquisizione dati per fetta imaging. </li><li> Mettere filtri notch triple (Chroma Technology Corp., Bellows Falls, VT) di fronte ai PMT rivelazione a fluorescenza, a limitare ogni luce laser di raggiungere i rivelatori di fluorescenza, e OD 2 filtri a densità neutra di fronte PMT di rilevazione della trasmittanza per evitare la saturazione di tali rivelatori. </li><li> Eseguire il software di acquisizione dati, raccogliendo fluorescenza e TPSFs trasmittanza in ciascuna posizione determinata sorgente rivelatore e per ogni lunghezza d&#39;onda di eccitazione (635 nm e 755 nm per eccitare il Alexa 647 e IRDye 800CW-EGF traccianti, rispettivamente). Per ogni serie di TPSFs collezionati, monitorare e registrare l&#39;intensità del lasercon un canale di riferimento PMT. </li></ol> 4. Ricostruzione di immagini <ol><li> Determinare la superficie esterna del mouse e la posizione delle aste di supporto di imaging letto dalle immagini CT e creare maschere che copre i confini del mouse e le aste di imaging separatamente. </li><li> Utilizzare la maschera mouse per produrre un mesh ad elementi finiti dell&#39;animale utilizzando il software NIRFAST 19. </li><li> Localizzare le posizioni della sorgente e del rivelatore dal sistema tomografia fluorescenza sulla superficie della rete basata su fluorescenza e microCT registrazione coordinate spaziali 20. </li><li> Rimuovere ottici punti di dati associati con posizioni di origine o rivelatore che interagiscono con la posizione delle aste di imaging letto di supporto. </li><li> Normalizzare i dati raccolti in ciascuna posizione del rivelatore di origine dal riferimento laser, corrette per la deriva temporale di riferimento laser, e corretto per sensibilità del filtro, che sono stati determinati per via sperimentale<html> al momento dell&#39;acquisto 15. </li><li> Prendere il Rapporto Nato dei dati (fluorescenza diviso trasmittanza) per ciascuna sorgente-rivelatore di posizione e si moltiplicano con un modello di simulazione in avanti di trasmittanza in base alla mesh ad elementi finiti animale uniformi proprietà ottiche. Questo viene fatto per ridurre gli errori associati alla accoppiamento sorgente o rilevatore-tessuto 21, per calibrare i dati al modello 22, e per regolare i dati per altri aspetti del modello-dati corrispondenza 23,24. </li><li> Costruire un vettore di dati composto della differenza scala dei dati raccolti rapporto nati ad entrambe le lunghezze d&#39;onda. Il fattore di scala è stato scelto per ottimizzare il contrasto vincolante EGFR. Eseguire dominio del tempo ricostruzione delle immagini con i dati di differenza calibrato utilizzando il TPSF per ciascun canale di rilevamento come input, e creare mappe fluorescenza del mdc mirata tracciante 15. </li></ol> 5. Risultati rappresentativi &quot;&gt; Un esempio di una ricostruzione fluorescenza con sovrapposto un co-registrato immagine anatomica CT dalla testa di un topo con un tumore U251 glioma ortotopica è presentato in figura 1b. Il centro di massa del glioma determinata dalla ricostruzione fluorescente (figura 1b ) era entro 1 mm dal centro tumore di massa determinata dal contrasto migliorare la risonanza magnetica (Figura 1a). Le immagini CT e MRI sono stati co-registrazione basato su un reciproco-informazioni di trasformazione. <img src="/files/ftp_upload/4050/4050fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Con mdc (gadolinio) immagine di risonanza magnetica della testa mouse (a). Il mouse è stato inoculato ortotopicamente con una linea cellulare umana glioma U251. La posizione del tumore, che assorbe l&#39;agente di contrasto più del cervello normale, può essere visto nel cerebrale sinistro (a destra in immagine) e indicato dalla freccia bianca. Il corresponding immagine tomografia computerizzata (dalla stessa posizione sulla testa mouse) è rappresentato in (b) con il fattore di crescita epidermico mirata fluorescenza meno il sovrapposta mirati ricostruzione fluorescenza. Le unità di fluorescenza sono in mm inverso e si riferiscono al coefficiente di assorbimento di fluorescenza associato mirata moltiplicato per la sua efficienza quantica e dalla sua concentrazione.

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Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Fluorescenza tomografia (FT) è un sensibile, modalità di radiazioni ionizzanti senza l&#39;imaging molecolare basata su visibile e vicino infrarosso trasporto leggero attraverso il tessuto biologico. La maggior parte l&#39;interesse per FT si è concentrata sulla sua capacità di accelerare la scoperta di farmaci e lo sviluppo di piccoli animali in modelli sperimentali 1 e un settore chiave della ricerca è stato lo studio di espressione biomarker del cancro e la risposta alle terapie molecolari 26. Attualmente, ci sono due approcci concorrenti al sistema di progettazione FT. Il disegno più comune si basa su raffreddati charge-coupled device (CCD) per il rilevamento della fluorescenza 4-9. Questo design garantisce una elevata densità di misurazioni, massimizzando campionamento tessutale poiché ciascun pixel nella fotocamera CCD in grado di rilevare la luce che ha viaggiato un unico percorso attraverso il tessuto. Tuttavia, le telecamere CCD hanno una limitata gamma dinamica e rumore di lettura limita la loro sensibilità finale. Il secondo disegno evita la possibilità limitazioni<html> zioni di rilevamento della fotocamera CCD impiegando altamente sensibile a singolo fotone conteggio tecnologia basata sull&#39;uso di rivelatori come tubi fotomoltiplicatori o fotodiodi a valanga 10-13. Lo svantaggio di questi metodi di individuazione più sensibili è che ogni rivelatore può raccogliere la luce in un singolo punto, quindi, per ottenere campionamento denso tessuto, sia rivelatori molti devono essere utilizzati (che è molto costoso), oppure molte sporgenze devono essere esposte con lo stesso rivelatore (che può richiedere molto tempo). Mentre il livello ottimale di campionamento tessuto per FT piccolo animale non è stato concordato, e può variare caso per caso, si conviene che il singolo fotone strumentazione conteggio è più adatto per esplorare i limiti di sensibilità in termini di FT della sua capacità di rilevare basse concentrazioni di marcatori molecolari. In questo studio, forniamo una metodologia per la realizzazione FT utilizzando singoli fotoni strumentazione di rilevamento conteggio di localizzare i tumori nei topi. ENT &quot;&gt; Ci sono quattro passaggi critici coinvolti per la produzione di serie di dati robusti con il tempo-correlata single-photon FT conteggio. La prima è l&#39;applicazione di una procedura di calibrazione adatto e semplice. Nella metodologia presentata, le rispettive sensibilità di ciascun canale di rilevazione sono contabilizzate per la raccolta da una misura di base di luce di eccitazione trasmessa attraverso una linea-diffusore progettato per dirigere frazioni uguali di luce per ogni rivelatore 15. Inoltre, la luce rilevata durante un esperimento è continuamente tarato al laser di riferimento, sia in termini di intensità e significano . tempo, che può variare nel tempo, per il funzionamento di un canale di riferimento laser 11,15 La seconda fase critica è la raccolta accurata e co-registrazione di imaging anatomico per guidate ricostruzioni fluorescenza I dati FT offre non solo informazioni anatomiche.; Pertanto, al fine di creare un modello di trasporto luce che può essere utilizzato per ricostruire la lozione di sorgenti fluorescenti all&#39;interno di un campione dalla fluorescenza rilevata sulla superficie del campione, l&#39;anatomia del campione in relazione al sistema FT deve essere accuratamente conosciuto. Nel nostro sistema, le informazioni anatomico viene acquisita da un micro-tomografia computerizzata sistema di coordinate spaziali che sono stati registrati spazialmente con quelli del sistema FT 15,20. La terza fase critica significa anche garantire che una esposizione ottimale (cioè, il tempo totale di rilevamento di fotoni per ogni proiezione laser) è alle dipendenze di ogni fonte-rivelatore di posizione. Questo è importante per due ragioni: primo, per garantire che vi sia sufficiente di segnale-rumore in ciascuna posizione di rilevazione e secondo per evitare la saturazione rivelatore, che potrebbe danneggiare le unità di rilevamento. Al fine di ottenere l&#39;esposizione ottimale in ogni posizione rivelatore, un controllo automatico dell&#39;esposizione viene impiegato, che triangola essenzialmente ottimizzare l&#39;esposizione da due, bassa segnale esposizioni 14. La quarta criticapassaggio della metodologia fa riferimento ai dati raccolti fluorescenza alla quantità di luce trasmessa eccitazione. Questo riferimento viene spesso chiamato il rapporto Nato, e offre molti vantaggi per FT, con il principale dei quali una mitigazione del modello-dati gli errori di configurazione 23,24. Il sistema presentato è stato progettato per rilevare la luce di eccitazione sia fluorescenza e trasmette contemporaneamente incanalando la luce di ogni canale di rilevamento in 2 tubi fotomoltiplicatori separati. In questo modo, si evita qualsiasi effetto di movimento sulla precisione del rapporto Born. Con un robusto set di dati che a mano, la ricostruzione immagine del tempo nel dominio dei dati implica la soluzione del problema inverso della mesh ad elementi finiti con l&#39;espressione: d = Jx dove d è un vettore con n x m elementi per n source-rivelatore proiezioni e m TPSF tempo cancelli; J è un n x m-by-l sensibilità matrice (o Jacobiana), per i nodi l nel mesh, ed x è il vettore di fluorescenza proprietà ottiche in ciascun nodo, con l dimensione d è i dati calibrati raccolti durante l&#39;esperimento e J è simulato usando la soluzione di elemento finito. al ravvicinamento diffusione nel dominio del tempo di trasporto fluorescenza 25. La dimensione temporale di J è anche convoluta con le funzioni specifiche del rivelatore strumento di reazione. X è una rappresentazione della mappa fluorescenza di interesse ed è risolto per utilizzare un Levenberg Marqardt-non-negative almeno approccio quadrati con Tikhonov regolarizzazione 15. La metodologia qui presentata, che descrive un procedimento in grado di localizzare tumori fluorescente in topi usando altamente sensibili Photon Counting rivelazione di fluorescenza, ha il potenziale per spingere i limiti di FT. In uno studio precedente, il potenziale di impiegare questoapproccio larger-than-topi modelli animali, come i ratti, così come la sensibilità migliorata rispetto alla progettazione di sistemi esistenti in topo di dimensioni esemplari, è stata dimostrata 17. L&#39;applicazione immediata di questo approccio sarebbe per il monitoraggio di espressione biomarker in vivo in modelli animali di tumore di piccole dimensioni per valutare l&#39;efficacia dei farmaci in un high-throughput mezzi. La capacità del sistema per eccitare e rilevare fluorescenza a lunghezze d&#39;onda multiple permette la rilevazione simultanea di più marcatori fluorescenti. Altri marcatori fluorescenti fornire un mezzo di interrogare molteplici aspetti di una patologia, simultaneamente, o potrebbero essere utilizzati, come in questo studio, di impiegare metodi di imaging più quantitativi come dual-reporter metodi di misurazione in vivo potenziale di legame, un marker di densità recettore 26,27.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> IRDye 800CW-EGF </td><td> LI-COR Biosciences </td><td> 926-08446 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647, succinimidil estere </td><td> Life Technologies </td><td> A20106 </td><td> Reagito con acqua per ridurre il legame non specifico </td></tr></tbody></table>

tomografia computerizzata guidata nel dominio del tempo tomography diffuse fluorescenza in animali di piccola taglia per la localizzazione dei biomarcatori tumorali

Computed Tomography-guided Time-domain Diffuse Fluorescence Tomography in Small Animals for Localization of Cancer Biomarkers

Piccoli animali di imaging di fluorescenza molecolare (FMI) può essere un potente strumento per la scoperta della droga preclinica e studi di sviluppo 1. Tuttavia, l&#39;assorbimento della luce da cromofori dei tessuti (ad esempio, l&#39;emoglobina, acqua, lipidi, la melanina) che stabilisce limiti propagazione ottica segnale attraverso spessori superiori a pochi millimetri 2. Rispetto ad altre lunghezze d&#39;onda visibili, l&#39;assorbimento del tessuto per il rosso e nel vicino infrarosso (near-IR) assorbimento della luce si riduce e non elastico di scattering della luce diventa il dominante del tessuto meccanismo di interazione. Lo sviluppo relativamente recente di agenti fluorescenti che assorbono ed emettono luce nel vicino-IR gamma (600-1000 nm), ha guidato lo sviluppo di sistemi di imaging e modelli di propagazione della luce che possono raggiungere tutto il corpo tridimensionale imaging in piccoli animali 3. Nonostante i grandi passi avanti in questo settore, la natura mal posto della tomografia di fluorescenza diffusa resta un importanteproblema per la stabilità, il recupero contrasto e la risoluzione spaziale delle tecniche di ricostruzione di immagine e l&#39;approccio ottimale per FMI nei piccoli animali deve essere ancora concordato. La maggior parte dei gruppi di ricerca hanno investito in charge-coupled device (CCD) basati su sistemi che forniscono abbondante la sensibilità dei tessuti di campionamento, ma non ottimale 4-9, mentre il nostro gruppo e pochi altri 10-13 hanno perseguito sistemi basati su rivelatori di sensibilità molto elevate , che in questo momento consentire campionamento tessuto denso essere raggiunta solo a costo di immagini a bassa velocità. Qui mostriamo la metodologia per l&#39;applicazione di singoli fotoni tecnologia di rilevamento in un sistema di tomografia di fluorescenza di localizzare una lesione cancerosa del cervello in un modello murino. La fluorescenza tomografia (FT) sistema impiegato fotone singolo conteggio utilizzando tubi fotomoltiplicatori (PMT) e ricco di informazioni nel dominio del tempo di rilevamento di luce in un non-contatto conformazione 11. Questo fornisce una simultanea colcolta di eccitazione e di emissione di luce trasmessa, e comprende il controllo dell&#39;esposizione automatica a fluorescenza di eccitazione 14, riferimenti laser, e co-registrazione con un piccolo animale tomografia computerizzata (microCT) del sistema 15. Un modello di topo nudo è stata utilizzata per l&#39;imaging. L&#39;animale è stato inoculato ortotopicamente con una linea cellulare umana glioma (U251), l&#39;emisfero cerebrale sinistro e ripreso 2 settimane dopo. Il tumore è stato fatto per fluorescenza mediante iniezione di un tracciante fluorescente, IRDye 800CW-EGF (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) mirato al recettore del fattore di crescita epidermico, una proteina di membrana cellulare note per essere sovra-espresso nella linea U251 tumore e molti altri tumori 18. Un secondo, non mirati tracciante fluorescente, Alexa Fluor 647 (Life Technologies, Grand Island, NY) è stato anche iniettato per tenere conto di non-effetti mediati dal recettore per l&#39;adozione dei traccianti mirati a fornire un mezzo per quantificare vincolante tracciante e la disponibilità del recettore / densità 27. A CT-guidata, time-dominio algoritmo è stato utilizzato per ricostruire la posizione di entrambi traccianti fluorescenti (cioè, la posizione del tumore) nel cervello di topo e la loro capacità di localizzare il tumore è stato verificato mediante contrasto risonanza magnetica. Sebbene dimostrata per imaging di fluorescenza in un modello murino glioma, il metodo presentato in questo video può essere esteso a diversi modelli tumorali in vari modelli animali di piccole potenzialmente fino alle dimensioni di un topo 17.

Diffuse la tomografia di fluorescenza offre un approccio relativamente a basso costo e potenzialmente ad alta dappertutto per preclinica<em&gt; In vivo</em&gt; Immagine del tumore. La metodologia di raccolta dei dati ottici, la calibratura e la ricostruzione delle immagini è presentato per una tomografia computerizzata guidata senza contatto nel dominio del tempo di sistema utilizzando il targeting fluorescente del tumore recettore fattore di crescita epidermico biomarker in un modello di glioma mouse.

Tomografia Computerizzata guidata nel dominio del tempo Tomography Diffuse fluorescenza in animali di piccola taglia per la localizzazione dei biomarcatori tumorali

L'imaging molecolare a fluorescenza (FMI) per piccoli animali può essere uno strumento potente per gli studi di scoperta e sviluppo di farmaci in ambito preclinico1. Tuttavia, la luce ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è produrre immagini di fluorescenza dell'espressione del recettore del fattore di crescita epidermico in un modello murino di glioma ortotopico. Questo risultato si ottiene inoculando l'emisfero cerebrale sinistro di un topo A IIC con cellule di glioma umano U2 51 che esprimono la proteina verde fluorescente. Dopo due settimane di crescita tumorale, il topo viene iniettato con un cocktail di due traccianti fluorescenti.Il topo viene quindi sottoposto a imaging mediante un sistema radiografico per piccoli animali per acquisire i dati anatomici necessari per una ricostruzione accurata delle immagini. Questi dati vengono utilizzati per posizionare anatomicamente la sorgente e determinare le posizioni dei rilevatori del sistema di tomografia ottica, e un software personalizzato viene impiegato per raccogliere i dati di fluorescenza e costruire l'immagine finale. In definitiva, questo metodo permette di ottenere un'immagine di un tumore sulla base della sua sovraespressione del fattore di crescita epidermico, combinando imaging fluorescente e radiografico, la cui accuratezza può essere confrontata con quella dell'imaging a risonanza magnetica con mezzo di contrasto.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la tomografia fluorescente per piccoli animali basata su dispositivi a accoppiamento di carica, è che il rilevamento a conteggio di fotoni singoli mediante tubi fotomoltiplicatori offre una sensibilità e una gamma dinamica molto più elevate nella rilevazione della luce. Questo metodo può essere utilizzato in ultima analisi per monitorare e valutare il successo di terapie molecolari misurando l'espressione dei loro bersagli. Sebbene i tumori sottocutanei possano essere facilmente immaginati con metodi non tomografici mediante imaging superficiale, questo sistema è progettato per effettuare immagini attraverso tessuti spessi fino a diversi centimetri, risultando particolarmente adatto all'immagine, al confronto, alla somministrazione di agenti di contrasto e alla loro fuoriuscita nei tumori cerebrali.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'espressione dei biomarcatori del cancro, può essere applicato anche ad altri studi di patologie come infezioni, obesità o elementi legati all'invecchiamento, come l'Alzheimer. In generale, le persone alle prime armi con questo metodo incontreranno difficoltà a causa della natura diffusa della propagazione della luce nei tessuti biologici e della complessità nell'utilizzare la tomografia a raggi X per la ricostruzione della luce diffusa. Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale.Considerando che le fasi di acquisizione dati e ricostruzione delle immagini possono essere difficili da apprendere, è importante assicurarsi che i dati raccolti dal sistema fluorescente siano ben calibrati. Il pacchetto software near fast è stato progettato per leggere i dati ottici e utilizzare le immagini di tomografia a raggi X per creare una mesh a elementi finiti, che viene usata come modello spaziale per la ricostruzione della fluorescenza. Per iniziare, posizionare un topo nudo atimico anestetizzato su un telo chirurgico sterile e verificare la profondità dell'anestesia prima di procedere; quindi pulire e disinfettare la cute nella zona di incisione.Utilizzando Betadine, posizionare un telo chirurgico sterile sul sito dell'incisione; con un bisturi, effettuare una piccola incisione leggermente a sinistra della linea mediana e 0,5 centimetri posteriormente rispetto alla linea interoculare. Pulire la superficie del cranio rimuovendo ogni tessuto connettivo in modo da poter identificare i punti di riferimento anatomici. Una volta esposto il cranio, utilizzare un trapano ad alta velocità con una punta sterile da un millimetro per creare un foro situato due millimetri a sinistra della linea centrale e due millimetri al di dietro rispetto al bgma.Caricare una siringa Hamilton Micros con un ago ottuso da 27 gauge con le cellule da impiantare. Successivamente, posizionare il topo su un telaio stereotassico. Quindi, confermare un piano anestetico chirurgico profondo con una pinzatura del dito del piede e sostituire il campo operatorio sull'animale.Successivamente, fissare la siringa caricata sul telaio stereotassico. Posizionare la siringa sopra il foro nel cranio e inserire la punta dell'ago a tre millimetri sotto la superficie del cranio. Successivamente, ritirare l'ago di un millimetro per creare una tasca.Il passo successivo consiste nell'iniettare lentamente le cellule nell'emisfero cerebrale sinistro nel corso di un periodo di cinque minuti. Al termine dell'iniezione, ritirare l'ago e tamponare il foro con Betadine. Per impedire la crescita delle cellule al di fuori del sito di iniezione, rimuovere il topo dal telaio stereotassico e riempire il foro esposto con cera ossea preriscaldata.Infine, chiudere il sito dell'incisione con sutura sterile in nylon 5-0. Riporre il topo in una gabbia riscaldata e monitorare fino al completo recupero; dopo il recupero, iniettare il topo con 130 microlitri di buprenorfina 0,1 milligrammi per chilogrammo per via intraperitoneale e lasciare crescere il tumore per 14 giorni prima dell'imaging. Nel giorno dell'imaging del topo, avviare il sistema per consentire ai laser e ai rivelatori di luce di riscaldarsi per circa 20 minuti.Per evitare deriva e variazioni di sensibilità del sistema, posizionare esattamente al centro del supporto di imaging un diffusore lineare progettato di 100 gradi per quattro gradi per distribuire i laser di eccitazione tra i canali di rilevamento del sistema con uguale intensità. Regolare manualmente l'angolo del diffusore per massimizzare il segnale rilevato da tutti e cinque i canali di raccolta della luce. Successivamente, posizionare la densità ottica.Due filtri di densità neutrale davanti a tutti i fotomoltiplicatori (PMT) per la rilevazione della fluorescenza e densità ottica. Un filtro di densità neutrale davanti a ogni rilevazione di trasmissione. I PMT raccolgono 100 funzioni di allargamento temporale dell'impulso o TPSF del laser, ciascuna con un tempo di integrazione di un secondo per ogni laser in sequenza, normalizzano ogni TPSF rispetto al riferimento del laser, correggono la deriva temporale del riferimento del laser e mediano su tutte le iterazioni per ciascun rivelatore e per ciascun laser separatamente.Questi TPS medi sono le funzioni di risposta strumentale specifiche del rilevatore utilizzate nella ricostruzione dell'immagine ottica 12 ore prima della procedura di imaging. Iniettare nel topo in prova un cocktail di traccianti fluorescenti. La calibrazione accurata del sistema di tomografia fluorescente e la limitazione del movimento dell'animale sono gli aspetti più difficili di questa procedura.La ricostruzione dell'immagine è così mal posta che anche errori minimi nella raccolta dei dati possono portare a errori significativi nell'immagine ricostruita. Per garantire una raccolta dati accurata, immobilizziamo il topo nel modo più accurato possibile e ripetiamo la calibrazione prima e dopo la scansione per aumentare la probabilità di ottenere una calibrazione precisa. Quando pronto, posizionare l'animale anestetizzato sui supporti in fibra di vetro del lettino di imaging.Dopo aver posizionato la testa all'interno del cono nasale per l'anestesia gassosa continua, fissare i denti sulla barra bite e immobilizzare l'animale con del nastro adesivo. Il topo deve essere posizionato approssimativamente al centro del gantry di imaging. Questo posizionamento può essere guidato ruotando il laser di eccitazione di 180 gradi attorno al topo, assicurandosi che il punto focale del laser illumini un punto pressoché centrale rispetto al topo, visto dalla prospettiva del laser, a ogni angolo.Dopo aver posizionato correttamente, trasferire con attenzione il lettino di imaging e il topo al microscopio TC e acquisire informazioni anatomiche con una risoluzione isotropica di 93 micrometri per l'intera testa del topo. Visualizzare la serie di immagini TC e selezionare le sezioni da acquisire con il sistema di tomografia a fluorescenza. Trasferire con cura il lettino di imaging e il topo nuovamente al sistema di tomografia a fluorescenza.Scegliere il numero di posizioni della sorgente per ciascuna sezione di imaging, il tempo di integrazione per ogni misurazione TPSF, il numero di iterazioni per ciascuna posizione della sorgente e la posizione e il numero delle sezioni di imaging desiderate a partire dallo stack di immagini TC creato in precedenza. Successivamente, posizionare dei filtri davanti ai fotomoltiplicatori di rilevamento della fluorescenza per bloccare tutta la luce di eccitazione e inserire filtri di densità neutra con densità ottica davanti ai fotomoltiplicatori di rilevamento della trasmissione. Per evitare la saturazione di questi rivelatori, eseguire il software di acquisizione dati per raccogliere i TPSF di fluorescenza e trasmissione in ogni posizione definita tra sorgente e rivelatore, a entrambe le lunghezze d'onda di eccitazione.Per ogni serie di psf di T acquisite, monitorare e registrare l'intensità del laser mediante un canale PMT di riferimento. Determinare la superficie esterna del topo e la posizione del piano di imaging. Utilizzare le aste di supporto dalle immagini di TC e creare maschere che ricoprano i confini del topo e dell'asta di imaging.Separatamente, utilizzare la maschera del mouse per produrre una mesh a elementi finiti dell'animale mediante il software near fast. Localizzare le posizioni della sorgente e del rivelatore del sistema di tomografia a fluorescenza sulla superficie della mesh in base alle coordinate di registrazione spaziale ottenute dalla micro-TC e dalla fluorescenza. Rimuovere i punti dati ottici associati alle posizioni della sorgente o del rivelatore che interagiscono con la posizione del lettino di imaging.Le bacchette di supporto normalizzano i dati raccolti in ogni posizione sorgente-rivelatore mediante il riferimento laser, correggendo alla deriva temporale del riferimento laser e alle sensibilità dei filtri, determinate mediante test sperimentali al momento dell'acquisto. Si calcola il rapporto di Born per i dati di ogni posizione sorgente-rivelatore e lo si moltiplica per una simulazione del modello diretto della trasmittanza basata sulla mesh animale a elementi finiti per proprietà ottiche uniformi. Questo passaggio serve per ridurre gli errori associati all'accoppiamento del tessuto con la sorgente o con il rivelatore, per calibrare i dati al modello e per correggere i dati in relazione ad altri aspetti di discrepanza tra modello e dati; si costruisce quindi un vettore di dati composto dalla differenza scalata dei dati del rapporto di Born raccolti a entrambe le lunghezze d'onda.Il fattore di scala viene scelto per massimizzare il contrasto del legame dell'EGFR, eseguire la ricostruzione dell'immagine nel dominio temporale con i dati differenziali calibrati utilizzando la TPSF per ogni canale di rilevamento come ingresso e creare mappe di fluorescenza del tracciante mirato con contrasto migliorato osservato. Di seguito è riportato un esempio di una ricostruzione di fluorescenza sovrapposta a un'immagine anatomica CT coregistrata proveniente da un topo con un tumore ortotopico di glioma U251. Il centro di massa del glioma determinato mediante la ricostruzione della fluorescenza era entro un millimetro rispetto al centro di massa del tumore determinato mediante risonanza magnetica con contrasto. Il software per l'acquisizione dei dati è stato sviluppato appositamente per questo dispositivo, ma la maggior parte delle tecniche di elaborazione delle immagini può essere eseguita utilizzando il software near fasts disponibile su @nearfasts.org. Pertanto, durante l'esecuzione di questa procedura, è fondamentale assicurarsi che sia il sistema che i dati siano calibrati con precisione prima della ricostruzione delle immagini. Questa calibrazione richiede che vengano considerate le differenze di sensibilità e temporali tra i rivelatori, a seguito della ricostruzione dell'immagine di un tracciante mirato a un biomarcatore.L'analisi con imaging di un tracciante non mirato fornisce un metodo per correggere l'assorbimento non mediato da recettori. Ciò consente di quantificare sia la quantità di legame del tracciante che la densità dei recettori in vivo. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha ispirato altri ricercatori a progettare sistemi di tomografia a fluorescenza guidati da imaging a raggi X, aprendo la strada all'imaging dell'intero organismo in animali di maggiori dimensioni.Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire un esperimento di tomografia fluorescente diffusa, che combina sistemi di imaging anatomico a raggi X e di imaging ottico per l’imaging di biomarcatori tumorali.

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