Tomografia Computerizzata guidata nel dominio del tempo Tomography Diffuse fluorescenza in animali di piccola taglia per la localizzazione dei biomarcatori tumorali

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di produrre immagini a fluorescenza dell'espressione del recettore del fattore di crescita epidermico in un modello murino di glioma ortotopico. Ciò si ottiene inoculando nell'emisfero cerebrale sinistro di un topo A IIC una proteina fluorescente verde che esprime cellule di glioma umano U2 51. Dopo che il tumore è cresciuto per due settimane, al topo viene iniettato un cocktail di due traccianti fluorescenti.

Il topo viene quindi sottoposto a imaging su un sistema a raggi X per piccoli animali per raccogliere i dati anatomici necessari per un'accurata ricostruzione dell'immagine. I dati vengono utilizzati per posizionare anatomicamente la sorgente e rilevare le posizioni del sistema di tomografia ottica, mentre un software personalizzato viene utilizzato per raccogliere i dati di fluorescenza e per costruire l'immagine finale. In definitiva, questo metodo può costruire un'immagine di un tumore in base alla sua sovraespressione del fattore di crescita epidermico utilizzando sia la fluorescenza che l'imaging a raggi X, la cui accuratezza può essere confrontata con la risonanza magnetica con mezzo di contrasto.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la tomografia a fluorescenza per piccoli animali basata su coppie di carica è che il rilevamento del conteggio di singoli fotoni utilizzando tubi fotomoltiplicatori offre una sensibilità e una gamma dinamica molto più elevate per il rilevamento della luce. Questo metodo può essere utilizzato per monitorare e misurare il successo delle terapie molecolari misurando l'espressione dei loro bersagli, mentre i tumori sottocutanei sono facilmente visualizzabili con metodi non tomografici utilizzando l'imaging di superficie. Questo sistema è progettato per l'imaging attraverso tessuti spessi fino a diversi centimetri, il che lo rende particolarmente adatto per l'immagine, il contrasto, la somministrazione di agenti e la fuoriuscita nei tumori cerebrali.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'espressione dei biomarcatori del cancro, può essere applicato anche ad altri studi su malattie come l'infezione, l'obesità o elementi dell'invecchiamento come l'Alzheimer. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà a causa della natura diffusa della propagazione della luce nei tessuti biologici e della difficoltà nell'utilizzare la tomografia a raggi X per la ricostruzione della luce diffusa. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale.

Poiché le fasi di raccolta dei dati e di ricostruzione dell'immagine possono essere difficili da imparare, è importante assicurarsi che i dati raccolti dal sistema fluorescente siano ben calibrati. Il pacchetto software quasi veloce è stato progettato per leggere i dati ottici e utilizzare le immagini della tomografia a raggi X per creare una mesh agli elementi finiti, che viene utilizzata come modello spaziale per la ricostruzione della fluorescenza. Per iniziare, posizionare un topo nudo atimico anestetizzato su un telo chirurgico sterile e confermare la profondità dell'anestesia prima di procedere, pulire e disinfettare la pelle sull'area dell'incisione.

Utilizzando Betadine, posizionare un telo chirurgico sterile sul sito di incisione utilizzando un bisturi, praticare una piccola incisione leggermente a sinistra della linea mediana e 0,5 centimetri dietro la linea intraoculare. Pulisci la superficie del cranio eliminando il tessuto connettivo in modo che i punti di riferimento possano essere identificati. Una volta che il cranio è esposto, usa un trapano ad alta velocità con una punta sterile da un millimetro per fare un foro che si trova due millimetri a sinistra della linea centrale e due millimetri dietro il bgma.

Caricare una siringa Hamilton Micros con un ago smussato calibro 27 con le cellule da impiantare. Quindi, posiziona il mouse su un fotogramma stereotassico. Quindi confermare un piano chirurgico ed estetico profondo con un pizzico di dita e sostituire il telo chirurgico sull'animale.

Quindi, fissare la siringa caricata sul telaio stereotassico. Posizionare la siringa sopra il foro nel cranio e inserire la punta dell'ago tre millimetri sotto la superficie del cranio. Quindi, ritira l'ago di un millimetro per creare una tasca.

Il passo successivo consiste nell'iniettare lentamente le cellule nell'emisfero cerebrale sinistro per un periodo di cinque minuti. Una volta completata l'iniezione, prelevare l'ago e tamponare il foro con Betadine. Per evitare che le cellule crescano al di fuori del sito di iniezione, rimuovere il topo dal telaio stereotassico e riempire il foro esposto con cera ossea preriscaldata.

Infine, chiudere il sito di incisione con una sutura sterile di nylon da cinque oh. Rimettere il topo in una gabbia riscaldata e monitorarlo fino a quando non si riprende dopo il recupero, iniettare nel topo 130 microlitri di 0,1 milligrammi per chilogrammo di buprenorfina IP e lasciare che il tumore cresca per 14 giorni prima dell'imaging. Il giorno dell'imaging del topo, avviare il sistema per consentire ai laser e ai rilevatori di luce di riscaldarsi per circa 20 minuti.

Per evitare derive e sensibilità del sistema, posizionare un diffusore di linee ingegnerizzato di 100 gradi per quattro gradi al centro diretto del portale di imaging per disperdere i laser di eccitazione tra i canali di rilevamento del sistema con la stessa intensità. Regolare manualmente l'angolazione del diffusore per massimizzare la quantità di segnale rilevata da tutti e cinque i canali di raccolta della luce. Al secondo posto la densità ottica.

Due filtri a densità neutra davanti a tutti i tubi fotomoltiplicatori per la rilevazione della fluorescenza chiamati PMT e densità ottica. Un filtro a densità neutra davanti a tutti i rilevamenti di trasmittanza. I PMT raccolgono 100 funzioni di diffusione dell'impulso temporale o T psf del laser, ciascuna con un tempo di integrazione di un secondo per ciascun laser in sequenza, normalizzano ogni TPSF in base al riferimento laser, correggono la deriva temporale nel riferimento laser e fanno la media su tutte le iterazioni per ciascun rivelatore e ciascun laser separatamente.

Questi TPS medi sono le funzioni di risposta dello strumento specifiche del rivelatore utilizzate nella ricostruzione ottica dell'immagine 12 ore prima della procedura di imaging. Iniettare nel topo di prova un cocktail di traccianti fluorescenti. La calibrazione accurata del sistema di tomografia fluorescente e la limitazione del movimento dell'animale sono gli aspetti più difficili di questa procedura.

La ricostruzione delle immagini è così mal posata che anche lievi errori nella raccolta dei dati possono portare a errori significativi nell'immagine ricostruita. Per garantire la raccolta di dati accurati, immobilizziamo il mouse nel miglior modo possibile e ripetiamo la calibrazione prima e dopo la scansione per migliorare le possibilità di ottenere una calibrazione accurata quando è pronto. Posizionare l'animale anestetizzato sui supporti in fibra di vetro del piano di imaging.

Dopo aver posizionato la testa nel cono del naso per l'anestesia gassosa continua, fissare i denti sulla barra del morso e fissare l'animale con del nastro adesivo. Il mouse deve essere posizionato approssimativamente al centro del gantry di imaging. Questo posizionamento può essere guidato ruotando il laser di eccitazione di 180 gradi attorno al mouse, assicurando che il punto focale del laser illumini un punto approssimativamente al centro del mouse dalla prospettiva del laser a tutti gli angoli.

Una volta posizionato correttamente, trasferire con cura il piano di imaging e il mouse sullo scanner micro CT e raccogliere informazioni anatomiche ad una risoluzione di 93 micrometri isotropa per l'intera testa del topo. Visualizzare lo stack di immagini CT e scegliere le fette da visualizzare con il sistema di tomografia a fluorescenza. Trasferire con cautela il letto di imaging e il mouse nel sistema di tomografia a fluorescenza.

Scegliere il numero di posizioni della sorgente per ogni slice di imaging, il tempo di integrazione per ogni misurazione TPSF, il numero di iterazioni per ogni posizione della sorgente e la posizione e il numero di slice di imaging desiderati dallo stack di immagini CT creato in precedenza. Successivamente, posizionare i filtri davanti ai PMT di rilevamento della fluorescenza per bloccare tutta la luce di eccitazione e i filtri di densità ottica a densità neutra davanti ai PMT di rilevamento della trasmittanza. Per evitare la saturazione di questi rivelatori, eseguire il software di acquisizione dati che raccoglie la fluorescenza e la trasmittanza t psfs in ogni posizione definita del rivelatore di sorgente a entrambe le lunghezze d'onda di eccitazione.

Per ogni set di T psf raccolto, monitorare e registrare l'intensità del laser con un canale PMT di riferimento. Determinare la superficie esterna del mouse e la posizione del piano di imaging. Supporta le aste dalle immagini TC e crea maschere che coprono i confini del topo e dell'asta di imaging.

Separatamente, usa la maschera del mouse per produrre una mesh agli elementi finiti dell'animale utilizzando il software quasi veloce. Localizzare le posizioni della sorgente e del rivelatore dal sistema di tomografia a fluorescenza sulla superficie della rete in base alle coordinate di registrazione spaziale micro CT e fluorescente. Rimuovere i punti dati ottici associati alle posizioni della sorgente o del rivelatore che interagiscono con la posizione del letto di imaging.

Le aste di supporto normalizzano i dati raccolti in ogni posizione del rivelatore sorgente dal riferimento laser, correggono la deriva temporale nel riferimento laser e correggono la sensibilità del filtro, che sono state determinate da test sperimentali al momento dell'acquisto. Prendi il rapporto di nascita dei dati per ogni posizione del rivelatore sorgente e moltiplicalo con una simulazione del modello in avanti della trasmittanza basata sulla mesh animale agli elementi finiti per proprietà ottiche uniformi. Questo viene fatto per mitigare gli errori associati all'accoppiamento tissutale della sorgente o del rivelatore, per calibrare i dati sul modello e per regolare i dati per altri aspetti della mancata corrispondenza dei dati del modello, costruire un vettore di dati composto dalla differenza in scala dei dati del rapporto di nascita raccolti a entrambe le lunghezze d'onda.

Il fattore di scala viene scelto per massimizzare il contrasto di legame dell'EGFR, eseguire la ricostruzione dell'immagine nel dominio del tempo con i dati di differenza calibrati utilizzando il TPSF per ciascun canale di rilevamento come input e creare mappe di fluorescenza del tracciante mirato con contrasto migliorato. Ecco un esempio di ricostruzione a fluorescenza sovrapposta a un'immagine anatomica TC coregistrata da un topo con un tumore glioma ortotopico U2 51. Il centro di massa del glioma determinato dalla ricostruzione della fluorescenza era entro un millimetro dal centro di massa del tumore, determinato dalla risonanza magnetica con mezzo di contrasto.

Il software per l'acquisizione dei dati è costruito su misura per questo dispositivo, ma la maggior parte delle tecniche di elaborazione delle immagini può essere eseguita utilizzando il software quasi veloce available@nearfasts.org. Pertanto, durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante assicurarsi che sia il sistema che i dati siano calibrati accuratamente prima della ricostruzione dell'immagine. Questa calibrazione richiede che la sensibilità e le differenze temporali tra i rivelatori siano prese in considerazione dopo la ricostruzione dell'immagine di un tracciante mirato a un biomarcatore.

L'imaging simile di un tracciante non bersaglio fornisce un mezzo per correggere l'assorbimento non mediato dal recettore. Ciò consente di quantificare la quantità di legame del tracciante e la densità del recettore in vivo dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha ispirato altri ricercatori a progettare sistemi di tomografia a fluorescenza guidata dall'imaging a raggi X e ha aperto la strada all'imaging di tutto il corpo di animali più grandi.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire un esperimento di tomografia a fluorescenza diffusa, che combina l'imaging anatomico a raggi X e i sistemi di imaging ottico per l'imaging dei biomarcatori del cancro.