Quantificazione tridimensionale del muco intestinale mediante imaging tissutale a montaggio intero

La nostra ricerca si concentra sui meccanismi dell'iniezione microbica nei tessuti mucosi, sottolineando il ruolo fondamentale del muco nel modulare queste interazioni. La quantificazione tradizionale del muco 2D manca di dettagli spaziali e volumetrici. Il nostro protocollo consente un'analisi 3D accurata, rivelando cambiamenti strutturali e distributivi da interventi molecolari trascurati nei metodi esistenti.

Questo protocollo combina imaging ormonale con quantificazione 3D, fornendo misurazioni robuste e riproducibili dell'architettura del muco intestinale applicabili a diverse condizioni sperimentali e interventi molecolari che superano la valutazione 2D convenzionale. Per cominciare, posiziona un topo anestetizzato da sei-otto settimane su una borsa riscaldante, per mantenere la temperatura corporea. Disinfettare la superficie cutanea del topo con alcol e fare un'incisione nella parte inferiore sinistra dell'addome per esporre il ceco mantenendo l'anestesia.

Ora, identifica l'ileone o colon prossimale. Posiziona l'anello intestinale su una garza sterile. Risciacquare con PBS sterile e fissare entrambe le estremità con pinze arteriose per creare un anello chiuso lungo tre centimetri.

In anestesia, iniettare non più di 200 microlitri di PBS sterile o reagente cloruro di carbamoilcolina nell'anello intestinale legato. Dopo 30 minuti di trattamento, preleva il ciclo intestinale dall'animale soppresso. Usando la pinza, tieni l'anello intestinale e sciacqualo delicatamente con PBS sterile.

Taglia longitudinalmente l'anello intestinale, con una piccola porzione non tagliata, e risciacqua nuovamente il tessuto in PBS sterile. Appiattisci il fazzoletto in una teglia da sei centimetri e taglia la parte rimanente. Usa segmenti di filo di rame per ancorarlo alla base dell'agarosio.

Ora, aggiungi 10 millilitri di soluzione al 4% di paraformaldeide al piatto per fissare il tessuto per 12-24 ore. Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione di paraformaldeide e lavare il tessuto almeno tre volte con PBS per rimuovere eventuali residui di paraformaldeide. Successivamente, immergi il tessuto in 10 millilitri di buffer bloccante composto da PBS integrato con 0,4% di Triton X-100 e 3% di BSA, e conservato a quattro gradi Celsius per 12-24 ore.

Rimuovi il buffer di blocco. Tingere il tessuto con una soluzione di colorante contenente agglutinina e falloidina del germe di grano. Nei tessuti dell'intestino tenue e del colono trattati con PBS, il muco WGA-positivo era prevalentemente localizzato nelle cellule calicalici sulla superficie epiteliale.

Dopo il trattamento con cloruro di carbamoilcolina, la quantità di muco WGA-positivo nel lumen intestinale aumentò sensibilmente sia nell'intestino tenue che nel colon, ma il muco si disperse sporadicamente invece di formare uno strato continuo. Il volume di muco WGA-positivo associato alle cellule goblet è stato significativamente ridotto dopo il trattamento con cloruro di carbamoilcolina sia nell'intestino tenue che nel colon, indicando secrezione attiva. Tutti i volumi di muco delle cellule caliciforme nei tessuti trattati con PBS erano inferiori a 1.000 micrometri cubi.

Gli elementi WGA-positivi superiori a 1.000 micrometri cubi sono stati classificati come muco secreto nel lume. Il trattamento con cloruro di carbamoilcolina ha aumentato il volume totale del muco secreto di circa cinque a venti volte sia nei tessuti dell'intestino tenue che nel colono.