Name: Preparazione di fettine di cervello acuto utilizzando un ottimizzata N-metilico-D-metodo di ripristino protettivo glucamine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Impara il metodo di recupero protettivo NMDG per preparare fette cerebrali acute da animali adulti. Questa tecnica ottimizzata migliora la conservazione neuronale per registrazioni patch clamp in elettrofisiologia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato finanziato dall'Istituto Allen for Brain Science. Gli autori desiderano ringraziare i fondatori di Allen Institute, Paul G. Allen e Jody Allen, per la loro visione, incoraggiamento e sostegno. Ringraziamo anche il personale del supporto tecnico di Allen Institute per l'esecuzione di genotipizzazione, allevamento e cura degli animali.

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Na + Spike-in migliora Gigaohm guarnizione formazione e Patch Clamp successo di registrazione La versione iniziale del metodo protettivo recupero NMDG è stata progettata specificamente per gli animali di invecchiamento e dell'adulto2,5. Alcuni primi utilizzatori hanno anche cercato di applicare questa metodologia giovanile cervello animale per affettare (cioè, topi < 30 giorni di età). Tuttavia, è stato notato che in contrasto con l'eccezionale conservazione neuronale a confermato visivamente con il metodo di ripristino protettivo NMDG in questa fascia di età, formazione guarnizione gigaohm può frequentemente stallo fuori, che conduce al morsetto patch falliti tentativi di registrazione. Un'ipotesi è che NMDG cationi più prontamente sono intrappolati nelle fette del cervello giovanile rispetto a fette del cervello adulto e possono impedire la formazione di tenuta; Tuttavia, guarnizioni gigaohm possono formare prontamente mentre fette del cervello giovanile sono completamente sommerse in aCSF NMDG (dati non mostrati), indicando così che NMDG aCSF per sé non ostacola il gigaohm guarnizione formazione.
La rapida transizione dalla soluzione di Na+ di bassa-alta al completamento del passaggio di recupero del cervello iniziale fetta danneggia le membrane neuronali e perturba il processo di formazione di sigillo. Questo è intuitivo, dato che la transizione da basso a alto Na+, caldo-freddo temperatura e drammatica elevazione del Ca2 + a rapporto Mg2 + portare collettivamente ad una massiccia recrudescenza dell'attività sinaptica spontanea. Questa fase di rimbalzo inibitorio nel cervello affettare procedura rischia di riperfusione dopo un insulto ischemico a specchio. Così, attenuando ulteriormente danno della membrana neuronale nella fase di recupero iniziale che una graduale procedura di spike in Na+ è stata incorporata in cui l'elevazione della concentrazione di Na+ nella camera di incubazione di recupero protettivo NMDG sta lentamente e riproducibile elevato con una tempistica precisa. Come nella procedura di recupero protettivo originale, la dissociazione temporale di Na+ altezza da temperatura e Ca2 +/Mg2 + rapporto altezza è benefica. Ma inoltre, la procedura di spike in Na+ conduce a piccoli aumenti incrementali in concentrazione extracellulare di Na+ sopra i primi punti di tempo e grandi aumenti verso i punti di tempo tardo, che permette di avere il tessuto cerebrale un possibilità di ospitare meglio ai crescenti livelli di Na+ . Questa procedura è che un'alternativa a exchange soluzione graduale controllata da una pompa di perfusione o gravità linee di gocciolamento che portano ad un costante incremento nei livelli di Na+ e richiedono attenzione per afflusso e il deflusso per evitare l'overflow della camera fetta. In particolare, in questo Na+ a spillo-in procedura l'osmolarità della soluzione nella camera di fetta aumenta gradualmente in un periodo di diversi minuti prima che le fette vengono restituite al normale osmolalità soluzione, ma questo non ha influenzato negativamente la salute fetta o la toppa morsetto registrazione di successo. Una soluzione di taglio ad alta osmolalità è stata utilizzata in precedenza per le preparazioni di fetta del midbrain per meglio preservare i neuroni della dopamina per il patch clamp registrazioni57,58, dimostrando così che questo temporaneo iperosmolarità può essere utile in alcuni contesti.
Implementando una procedura ottimizzata che unisce il metodo di ripristino protettivo NMDG e graduale Na+ spike-nel passaggio l'utilità di questa metodologia di fetta di cervello è stato esteso per coprire giovanile attraverso secoli di animale adulti maturi. Questo protocollo aggiornato ora è adatto per una vasta gamma di età animale utilizzando una singola formulazione di aCSF NMDG ottimale e la procedura. Se necessario, la procedura di spike in Na+ può essere applicata con un ritardo progressivamente più e/o il corso di tempo più lento per migliorare la redditività delle fette del cervello dai più vecchi animali e abbiamo fornito una guida di base delle pianificazioni di spike consigliati secondo all'animale di età (Vedi tabella 2). Mentre abbiamo fornito un quadro di base adatto per una vasta gamma di applicazioni, ulteriori passaggi avanzati possono essere esplorati per rafforzare ulteriormente e vitalità e longevità delle fette di cervello da animali di invecchiamento e dell'adulti. Ad esempio, strategie di restauro di glutatione sono particolarmente efficaci in questo senso e possono essere implementate come descritto altrove2,6.
Migliorare la velocità effettiva per sfidare gli esperimenti L'analisi delle connessioni sinaptiche registrando morsetto patch è un'applicazione esigente che richiede ottima conservazione della struttura di un neurone e la funzione al fine di raggiungere un'elevata affidabilità di successo. Come il numero di neuroni simultaneamente da registrare aumenta linearmente, il livello di difficoltà tecnica sale supra-linearmente. Esistono numerose modalità di guasto, e una delle cause più frequenti di errori è l'incapacità di guarnizioni adeguate gigaohm forma su uno o più delle cellule mirate. Questo può rallentare drammaticamente progressi, in particolare quando tre o più neuroni debbono essere effettuati simultaneamente. Coerente con l'individuazione del più veloce gigaohm guarnizione tempo di formazione con il metodo di recupero protettivo NMDG ottimizzato, c'era un netto miglioramento nel tasso di successo e throughput di registrazione morsetto multi-neurone patch esperimenti con sia adulto transgenici fette di cervello del topo e fette di cervello neurochirurgica umano adulto. Il miglioramento nell'efficienza è quasi certamente attribuibile sia alla formazione di sigillo di gigaohm più rapida e affidabile e la conservazione di un neurone migliorata delle fette con questo protocollo. Questo protocollo si concentra sui benefici in modo esplicito per toppa morsetto applicazioni di registrazione, guadagni simili sono previsti per altre applicazioni impegnative sperimentale dove la vitalità di fetta di cervello è fondamentale.

La preparazione di fetta cerebrale acuto è un sistema di modello sperimentale essenziale nell'ambito delle neuroscienze. Circa la metà di un secolo, questa piattaforma ha permesso studi dinamici funzionali del cervello vivente in una vasta gamma di specie animali e regioni anatomiche del cervello. Se l'uso previsto è biochimica, imaging funzionale, morfologia o elettrofisiologia, è della massima importanza per garantire l'integrità ottima e la vitalità del tessuto affettato. È per questo motivo che la preparazione di fetta di cervello del roditore giovanile altamente resiliente (cioè, più giovane di postnatale giorno 30 per topi) è stato il più preferito fino ad oggi. La difficoltà nell'ottenere il cervello sufficientemente sano fette da adulto maturo e animali di invecchiamento ha dimostrato di essere una sfida formidabile per la maggior parte e ha imposto severe limitazioni per studiare l'architettura funzionale del cervello maturo. Ciò è particolarmente vero per il morsetto di patch di registrazione, una tecnica che richiede ottima conservazione morfologica e funzionale ed è indispensabile per la caratterizzazione di proprietà intrinseche e sinaptica dettagliate di singoli neuroni identificati. Per i parecchi decenni passati, la stragrande maggioranza di elettrofisiologi morsetto patch è affidati a un metodo di 'protezione taglio' utilizzando saccarosio-sostituiti basso Na+ aCSF1 per la preparazione di fettine di cervello sano da giovanile e in misura molto minore misura, giovani animali adulti. Questo metodo si basa sulla premessa che l'afflusso passivo Na+ e l'ingresso di acqua successive e cella gonfiore durante la fase di taglio fetta è l'insulto predominante che conduce alla scarsa sopravvivenza dei neuroni, specialmente per quei neuroni situato nella strati superficiali che hanno più probabilità di sostenere trauma diretto dal movimento della lama. Tuttavia, il metodo di protezione taglio lascia ancora molto a desiderare per la preparazione di fetta di cervello da animali adulti maturi indipendentemente dalla formulazione particolare aCSF implementato.
Una soluzione semplice ma efficace a questo problema è stato descritto2,3,4,5,6 e chiamato il metodo slice di cervello 'protettiva recupero'. La versione originale di questo metodo utilizza un aCSF NMDG-sostituiti, come NMDG è stato identificato come il più versatile ed efficace tra vari altri sostituti di ioni del sodio di candidato (tra cui saccarosio, glicerolo, colina e Tris). La formulazione di media è stata ulteriormente migliorata da aggiunta di HEPES resistere l'edema del cervello fetta e fornire più forte pH buffer7, così come l'aggiunta di integratori per contrastare gli effetti dannosi dello stress ossidativo (tabella 1). Empiricamente è stato determinato che un'incubazione di recupero iniziale passo in basso Na+, basso Ca2 +, e alta Mg2 + NMDG aCSF subito dopo cervello adulto tessuto affettare era necessario e sufficiente per migliorato neuronale conservazione su una vasta gamma di regioni del cervello, tipi cellulari e animali età3,5,6.
In particolare, precedenti incarnazioni di che cosa ora è doppiato il metodo di protezione si trovano nella letteratura1,8,9,10,11,12, 13, anche se il pieno potenziale per adulto in età matura e invecchiamento cervello animale fetta e patch clamp registrazione non era riconosciuto o ha dimostrato in queste opere precedenti. Inoltre, sfumate variazioni procedurali continuano ad emergere a sostegno di specifiche applicazioni sperimentali4,14,15,16. L'organo collegiale del lavoro di questi numerosi gruppi di ricerca conferisce elevata fiducia nella robustezza del metodo protettivo recupero per conservazione migliore del tessuto. Il metodo di ripristino protettivo NMDG ora è stata ampiamente adottato e implementato in numerosi studi di ricerca pubblicata utilizzando preparazioni di fetta di cervello animale adulto. Questi studi acuti fetta span neocortical3,17,18, hippocampal15,19,20,21, striatal22 , 23 , 24, mesencefalo25,26,27,28,29e hindbrain30,31,32, 33 , 34 regioni e una varietà di tipi del neurotrasmettitore e del neuromodulatore cui glutamatergic4,30, GABAergici18,20,31,35 ,36, dopaminergici24,29,37,38, colinergici14,37,38, 39, noradrenergico40e serotoninergici27,28 neurotrasmissione. Il metodo è anche adatto per optogenetica controllo dell'attività neuronale in fette derivato da animali transgenici3,39 o a seguito di in vivo iniezioni virale17,27, 28,40,41,42,43, come bene come Ca2 + imaging funzionale di attività neuronale2,44 ,45,46. Analisi di breve termine plasticità4,47,48 e di diverse forme di lungo termine plasticità16,35,48 sono state segnalato. Uno studio recente ha applicato il metodo di recupero protettivo NMDG per facilitare l'ampia e sistematica di sondaggio delle connessioni sinaptiche nella corteccia visiva in fettine di cervello di topo adulto maturo utilizzando la octopatch registrazione configurazione49 — un potente dimostrazione dell'utilità e robustezza di questo metodo. Il metodo di protezione è stato applicato con successo anche in contesti sperimentali precedentemente imprevisti, ad esempio, una migliore conservazione del sistema vascolare e periciti nel cervello adulto corticale fette50, toppa morsetto registrazione da trapiantato popolazioni Interneurone in 1 – 1,5 anni del morbo di Alzheimer del mouse modelli20e un cervello adulto fetta del ricevitore traffico saggio51.
Il seguente protocollo descrive le procedure dettagliate per l'implementazione di un metodo di recupero protettivo NMDG ottimizzato di preparazione di fetta di cervello per migliorare la redditività delle fette del cervello acuto. I principi per una migliore conservazione di un neurone sono discusse, così come dimostrazione dei chiari vantaggi di questa metodologia per complessi multi-neurone toppa morsetto registrazione esperimenti in fettine di cervello di topo transgenico adulto giovane e adulto maturo fette di cervello umano neurochirurgica. Il seguente protocollo è stato convalidato per i topi da 21 giorni a più anni, anche per quanto riguarda esemplari neurochirurgici umani derivati da pazienti adulti.

<table><tbody><tr><td>Compresstome VF-200</td><td>Precisionary Instruments</td><td>VF-200</td><td>Affettatrice vibrante per tessuti (consigliata)</td></tr><tr><td>N-metil-D-glucamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2004</td><td>Costituente aCSF</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td>Costituente aCSF</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td>Costituente aCSF</td></tr><tr><td>Fosfato di sodio monobasico diidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71505</td><td>Costituente aCSF</td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Sigma</td><td>Aldrich S5761</td><td>Costituente aCSF</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td>Costituente aCSF</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7021</td><td>Costituente aCSF</td></tr><tr><td>Ascorbato di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4034</td><td>costituente</td></tr> <tr><td>aCSFThiourea</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8656</td><td>costituente aCSF</td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5280</td><td>costituente aCSF</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio diidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902</td><td>costituente aCSF</td></tr><tr><td>Solfato di magnesio eptaidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1880</td><td>costituente aCSF</td></tr><tr><td>2,2,2-Tribromoetanolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T48402</td><td>Componente anestetico 1</td></tr><tr><td>2-metil-2-butanolo&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>240486</td><td>Componente anestetico 2</td></tr><tr><td>Pinze smussate curve</td><td>Strumenti per la scienza 11065-07</td><td></td><td>Strumenti per la dissezione cerebrale</td></tr><tr><td>Forbici per dissezione fine (supercut)Strumenti per la</td> <td>scienza</td> fine <td>14058-09</td><td>Strumenti per la dissezione del cervello</td></tr><tr><td>Forbici grandi per impieghi gravosi 7''</td> <td>Strumenti</td> per la scienza <td>14000-18</td><td>Strumenti per la dissezione del cervello</td></tr><tr><td>Spatola in metallo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z511455-1PAK</td><td>Strumenti di dissezione cerebrale</td></tr><tr><td>Lamette da barba</td><td>VWR</td><td>89031-954</td><td>Strumenti di dissezione cerebrale</td></tr><tr><td>Brain Slice Keeper-4</td><td>Automate Scientific</td><td>S-BSK4</td> Rete di <td>nylon per camera di tenuta della fetta di cervello</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0198</td><td>Per la costruzione di camere di recupero per piccole fette</td></tr><tr><td>Becher in vetro Pyrex (250 mL)</td><td>VWR</td><td>89090-434</td><td>Per la costruzione di camere di recupero per piccole fette</td></tr><tr><td>Piatto in plastica da 35 mm, rotondo</td><td>VWR</td><td>100488-376</td><td>Per la costruzione di camere di recupero per piccole fette</td></tr><tr><td>Pietre per diffusori di gas (10 &; m)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>59277</td><td>Per la carbogenazione costante (bolle fini)</td></tr><tr><td>Agarosio Tipo I-B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0576</td><td>Per l'inclusione di campioni cerebrali</td></tr><tr><td>Punte per micro caricatori</td><td>Eppendorf</td><td>22491229</td><td>Per il riempimento di elettrodi a pinza per patch</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>VWR</td><td>102092-312</td><td>Per realizzare una piattaforma di dissezione personalizzata</td></tr><tr><td>Acido cloridrico&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1758-100ML</td><td>Per la regolazione del pH dei terreni</td></tr><tr><td>Idrossido di sodio&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221465-25G</td><td>Per la regolazione del pH dei terreni</td></tr><tr><td>Idrossido di potassio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221473</td><td>Per la regolazione del pH dei terreni</td></tr><tr><td>Pipette di trasferimento in plastica 3 mL graduate</td><td>VWR</td><td>89497-676</td><td>Per il trasferimento di fette</td></tr><tr><td>Lame per iniettori in ceramica di zirconio</td><td>Lame speciali Cadence EF-INZ10</td><td></td><td>http://cadenceinc.com/</td></tr> <tr><td>KG-33 in vetro borosilicato capillare con filamento</td><td>King Glass Company</td><td>Preventivo personalizzato</td><td>ID: 0,87 mm, OD 1,50 mm</td></tr><tr><td>Biocitina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4261</td><td>Soluzione per pipette interne</td></tr><tr><td>Fosfocreatina dissodica</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7936</td><td>Soluzione per pipette interna</td></tr><tr><td>Gluconato di potassio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G4500-100G</td><td>Soluzione per pipette interne</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3889</td><td>Soluzione per pipette interne</td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9187</td><td>Soluzione per pipette interne</td></tr><tr><td>Na2-GTP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51120</td><td>Soluzione per pipette interne</td></tr><tr><td>saccarosio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389</td><td>Soluzione per pipette interne</td></tr><tr><td>Bagno d'acqua riscaldato (2,5 L)</td><td>VWR</td><td>13491-060</td><td>Varie</td></tr><tr><td>Carta da filtro proiettili</td><td>VWR</td><td>28456-022</td><td>Varie</td></tr><tr><td>Colla cianoacrilica</td><td>Amazon</td><td>B000BQRBO6</td><td>Varie</td></tr><tr><td>Capsula di Petri in vetro</td><td>VWR</td><td>89000-326</td><td>Varie</td></tr><tr><td>10X Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5493</td><td>Varie</td></tr><tr><td>Siringhe da 30 ml</td><td>VWR</td><td>BD302832</td><td>Varie</td></tr><tr><td>Siringhe da 1 ml</td><td>VWR</td><td>BD-309628</td><td></td></tr> Vari <tr><td>aghi da 25 5/8 gauge VWR</td><td></td><td>89219-292</td><td></td></tr><tr><td>Vari Thermomixer (con blocco provette da 1,5 mL)</td><td>VWR</td><td>89232-908</td><td>Per mantenere l'agarosio fuso&nbsp;</td></tr></tbody></table>

preparazione di fettine di cervello acuto utilizzando un' ottimizzata n-metilico-d-metodo di ripristino protettivo glucamine

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Questo protocollo è una guida pratica per la N-metil-D-glucamine (NMDG) protezione recupero metodo di preparazione di fetta di cervello. Numerosi studi recenti hanno convalidato l'utilità di questo metodo per migliorare la conservazione di un neurone e complessiva vitalità di fetta di cervello. L'implementazione di questa tecnica di early adopter ha facilitato le indagini dettagliate in funzione del cervello utilizzando diverse applicazioni sperimentali e che abbracciano una vasta gamma di età degli animali, regioni del cervello e tipi di cellule. Passaggi sono descritti per effettuare la tecnica di fetta di cervello protettivo recupero utilizzando una procedura avanzata e formulazione di media di liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) NMDG ottimizzata in modo affidabile ottenere fette di cervello sano per elettrofisiologia di patch clamp. Con questo approccio aggiornato, si osserva un miglioramento sostanziale nella velocità e affidabilità di gigaohm sigillare formazione durante mirati toppa morsetto esperimenti di registrazione mantenendo ottima conservazione neuronale, facilitando in tal modo impegnativo applicazioni sperimentali. Risultati rappresentativi sono forniti dal morsetto del multi-neurone patch registrazione esperimenti test connettività sinaptica nelle fette del cervello neocorticale preparato da giovani topi transgenici adulti e maturi adulti esemplari umani neurochirurgici. Inoltre, il metodo di recupero protettivo NMDG ottimizzato del cervello affettare è compatibile con gli animali sia giovani che adulti, risolvendo così una limitazione della metodologia originale. In sintesi, un singolo supporto formulazione e cervello affettare la procedura può essere implementate attraverso le varie specie ed età per ottenere ottima conservazione di attuabilità e tessuto.

Questo protocollo viene illustrata l'implementazione di un ottimizzato N-metilico-D-glucamine (NMDG) protezione recupero metodo di preparazione di fetta di cervello. Una formulazione di singolo supporto viene utilizzata per ottenere in modo affidabile fette di cervello sano da animali di tutte le età e per diverse applicazioni sperimentali.

Preparazione di fettine di cervello acuto utilizzando un' ottimizzata N-metilico-D-metodo di ripristino protettivo glucamine

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di preparare fette di cervello sane da animali adulti maturi che siano adatte per esperimenti di elettrofisiologia con patch clamp. Quindi questo metodo di recupero protettivo NMDG ottimizzato per la preparazione di fette di cervello consente ai ricercatori di esplorare le proprietà intrinseche e sinaptiche dei tipi di cellule cerebrali in molte regioni cerebrali diverse e per animali di praticamente qualsiasi età. Quindi il vantaggio principale di questa particolare tecnica è che permette di preparare fette di cervello che hanno un grado di conservazione neuronale più elevato rispetto alle metodologie precedenti.E anche che queste fette di cervello sono più adatte per la registrazione con patch clamp. Questo metodo è stato ottimizzato per il tessuto cerebrale di topo adulto. Può essere utilizzato per una varietà di altre specie, tra cui il tessuto cerebrale umano resecato neurochirurgicamente.Per iniziare questa procedura, impostare la stazione di affettatura con l'affettatrice per tessuti e gli strumenti chirurgici. Fissare una lama dell'iniettore in zirconio-ceramica al braccio della lama utilizzando la colla adesiva rapida. Quindi inserire il portacampioni e allineare il bordo anteriore della lama al bordo del portacampioni.Lasciando un piccolo spazio per garantire che la lama non raschi il metallo. Riempire un becher da 250 millilitri con 200 millilitri di NMDG HEPES aCSF. E pre-raffreddarlo su ghiaccio con una carbogenazione costante per più di 10 minuti.Quindi impostare la camera di recupero iniziale della fetta cerebrale riempiendola con 150 millilitri di NMDG HEPES aCSF. E posizionare la camera in un bagno d'acqua a 32-34 gradi Celsius. Per allestire una camera di contenimento della fetta cerebrale, riempire il serbatoio con 450 millilitri di HEPES aCSF e lasciarlo riscaldare a temperatura ambiente sotto costante carbogenazione fino all'uso.Successivamente, preparare l'agarosio fuso per l'inclusione dei tessuti ritagliando un blocco di agarosio al 2% dal piatto precedentemente preparato utilizzando l'estremità aperta di una fiala conica da 50 millilitri. Tappare la fiala conica, quindi cuocerla nel microonde per 10-30 secondi fino a quando l'agarosio inizia a sciogliersi. Non surriscaldare.Versare l'agarosio fuso in tubi da 1,5 millilitri. Mantenere l'agarosio allo stato fuso utilizzando un termomiscelatore impostato a 42 gradi Celsius con una vigorosa agitazione. E assicurarsi attentamente che l'agarosio fuso non si solidifichi prematuramente.Pre-raffreddare il blocco di raffreddamento accessorio per l'affettatrice su ghiaccio in questo momento. In questa procedura, fai un taglio sulla pelle della testa per esporre la calotta cranica. Quindi, usa le forbici da taglio super fine per tagliare via la pelle sopra la calotta cranica.E fai piccole incisioni lateralmente su entrambi i lati della base ventrale caudale del cranio. Eseguire ulteriori tagli superficiali a partire dalla faccia dorsale caudale del cranio muovendosi in direzione rostrale lungo la linea mediana dorsale. Facendo attenzione a non danneggiare il cervello sottostante.Successivamente, eseguire un taglio a T finale perpendicolare alla linea mediana a livello dei bulbi olfattivi. Successivamente, utilizzare la pinza a punta tonda per afferrare il cranio partendo dall'aspetto rostrale mediale e sbucciare verso la direzione laterale caudale da un lato. Ripetere questa procedura per aprire l'altro lato.E rimuovere le metà dorsali della calotta cranica per esporre il cervello. Estrarre delicatamente il cervello intatto nel becher di NMDG HEPES aCSF pre-raffreddato. E lascia che il cervello si raffreddi uniformemente per circa un minuto.Ora, usa una spatola grande per trasferire il cervello dal becher sulla capsula di Petri ricoperta di carta da filtro. Taglia e monta il cervello in base all'angolo di taglio preferito e alla regione cerebrale di interesse desiderata. Lavorare rapidamente per evitare una prolungata privazione di ossigeno durante la manipolazione.Successivamente, fissare il blocco cerebrale al supporto del campione utilizzando la colla adesiva. Ritrarre la parte interna del portacampioni per estrarre completamente il blocco cerebrale all'interno. Quindi versare l'agarosio fuso direttamente nel supporto fino a quando il blocco cerebrale non è completamente ricoperto di agarosio.Successivamente, bloccare il blocco di raffreddamento accessorio pre-raffreddato attorno al portacampioni per dieci secondi fino a quando l'agarosio non si è solidificato. Inserire il portacampioni nell'apposito recipiente dell'affettatrice e verificare il corretto allineamento. Successivamente, riempire il serbatoio con il rimanente NMDG HEPES aCSF ossigenato pre-raffreddato dal becher da 250 millilitri e posizionare la pietra a bolle nel serbatoio per tutta la durata dell'affettatura, per garantire un'adeguata ossigenazione.Quindi, regolare il micrometro per iniziare a far avanzare il campione cerebrale incorporato nell'agarosio. Avviare l'affettatrice e regolare empiricamente la velocità di avanzamento e la frequenza di oscillazione al livello desiderato. Continuare ad avanzare e affettare il tessuto con incrementi di 300 micrometri fino a quando la regione cerebrale di interesse non è completamente sezionata.Il tempo totale per la procedura di affettatura dovrebbe essere inferiore a 15 minuti. Per il recupero iniziale di NMDG. Al termine della procedura di sezionamento, raccogliere tutte le fette utilizzando una pipetta da pascolo in plastica tagliata e trasferirle in una camera di recupero a 34 gradi Celsius riempita con 150 millilitri di NMDG HEPES aCSF.La tempistica della fase di recupero acuto della fetta cerebrale è molto importante per poter trovare un equilibrio tra la conservazione morfologica e il recupero funzionale delle proprietà elettrofisiologiche di ciascun neurone. Dopo aver determinato il programma ottimale di spike-in di sodio, in base all'età del topo, eseguire la procedura di spike-in di sodio della fase Y aggiungendo i volumi indicati di soluzione di sodio spike-in ai tempi indicati. Aggiungere la soluzione di sodio spike-in direttamente nel camino del gorgogliatore della camera di recupero iniziale per facilitare una rapida miscelazione.Il programma di picco di sodio che è stato fornito con una varietà di diverse fasce d'età è davvero un buon punto di partenza. Ma dovrebbe essere ottimizzato e utilizzato per il tuo specifico progetto sperimentale. Successivamente, trasferire tutte le fette nella camera di mantenimento a lungo termine HEPES aCSF mantenuta a temperatura ambiente.Lasciare che le fette si riprendano per un'altra ora nella camera di contenimento HEPES prima di procedere agli esperimenti di registrazione con patch clamp. Qui sono mostrate le immagini IR DIC rappresentative che sono state acquisite da diverse regioni del cervello e fette acute da un topo di tre mesi per la valutazione della conservazione morfologica dei neuroni. I risultati qui mostrati derivano dall'uso del metodo di taglio protettivo NMDG di controllo senza una fase di recupero protettiva.Mentre questi risultati provengono dal metodo di recupero protettivo NMDG ottimizzato. Nel complesso, si osserva una migliore conservazione neuronale con il metodo di recupero protettivo NMDG ottimizzato. Il metodo di recupero protettivo NMDG ottimizzato con una procedura di spike-in graduale del sodio è stato confrontato con il metodo di recupero protettivo NMDG originale.Il tempo medio per la formazione della tenuta GigaOhm e la registrazione del patch clamp è stato drasticamente e significativamente ridotto quando è stata applicata la procedura di spike-in graduale del sodio insieme alla fase di recupero protettivo NMDG. La migliore conservazione dei neuroni ottenuta con questo metodo di fetta cerebrale facilita applicazioni sperimentali impegnative, tra cui, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, l'elettrofisiologia del patch clamp multi-elettrodo per sondare la connettività sinaptica locale. Come dimostrato qui, utilizzando fette di cervello neocorticale umano adulto derivate dalla neurochirurgia.Guardando questo video, gli scienziati dovrebbero avere una buona comprensione di come implementare il nostro metodo di recupero protettivo NMDG ottimizzato, inclusa la nuova procedura di spike-in di sodio che abbiamo descritto, per preparare fette di cervello adatte per le registrazioni di patch clamp. Quindi, dopo aver padroneggiato questo protocollo, dovrebbe essere possibile completare la procedura di fetta del cervello in meno di un'ora al giorno. E dovrebbe produrre fette di cervello riproducibili di alta qualità e funzionerà per animali di praticamente qualsiasi età.Quindi questa procedura, questo metodo può aiutare a preparare fette di cervello adatte ad affrontare domande sulla funzione cerebrale utilizzando tecniche come l'elettrofisiologia, l'imaging ottico dal vivo e l'optogenetica, i saggi di traffico dei recettori e altri tipi di saggi funzionali per esplorare la funzione dei tipi di cellule cerebrali. Quindi questa tecnica è utile anche perché aiuterà i ricercatori a sondare funzionalmente diverse regioni del cervello, comprese le regioni del cervello che non sono tradizionalmente suscettibili per la registrazione del patch clamp da animali adulti in fette di cervello.

preparation-acute-brain-slices-using-an-optimized-n-methyl-d

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Questo video descrive un protocollo per ottenere fette di cervello utilizzando un metodo di recupero protettivo basato su N-metil-D-glucamina (NMDG). Un cervello sezionato viene incubato in un aCSF con NMDG e HEPES per ridurre al minimo la morte e il danno delle cellule neuronali durante il sezionamento. La sezione può essere recuperata nell'aCSF per ripristinare le attività...

Preparazione di sezioni cerebrali utilizzando un metodo di recupero protettivo basato su NMDG

Descriviamo due metodi per la visualizzazione e la quantificazione dell'arborizzazione dendritica nell'ippocampo di modelli murini: imaging in tempo reale e con profondità di campo estesa. Mentre il primo metodo consente un sofisticato tracciamento topografico e la quantificazione dell'estensione della ramificazione, il secondo consente una rapida visualizzazione dell'albero dendritico.

Valutazione della dendritiche arborizzazione nel giro dentato della Regione ippocampale nei topi

Questo protocollo descrive la stabilizzazione del livello di ossigeno in un piccolo volume di tampone riciclato e aspetti metodologici della plasticità sinaptica attività-dipendente di registrazione in fettine ippocampali acute sommersi.

Registrazione di plasticità sinaptica in fettine ippocampali Acute mantenuti in un piccolo volume riciclaggio - aspersione- e sistema di immersione-tipo camera

Microglia, le cellule immunitarie residente del cervello, di rispondere rapidamente con i cambiamenti morfologici a modificazioni del loro ambiente. Questo protocollo viene descritto come utilizzare microscopia del due-fotone per studiare l'attrazione dei processi microglial verso la serotonina o ATP nelle fette acuta del cervello dei topi.

Imaging del due-fotone di attrazione dei processi Microglial verso ATP o serotonina nelle fette del cervello acuto

Questo è un protocollo per la preparazione a slice acuta da ippocampo di topi adulti e invecchiamento che sfrutta la perfusione transcardiale e il taglio delle fette con NMDG-aCSF ghiacciato per ridurre i danni ipossici al tessuto. Le fette risultanti rimangono sane per molte ore e sono adatte per le registrazioni di patch e field a lungo termine.

Ridurre al minimo l'ipossia nelle fette di ippocampale da topi adulti e anziani

Questo articolo ha lo scopo di descrivere un protocollo sistematico per ottenere fette orizzontali del cervello ippocampale nei topi. L'obiettivo di questa metodologia è preservare l'integrità delle vie della fibra ippocampale, come il percorso perforante e il tratto di fibra muschiata per valutare i processi neurologici correlati al giro dentato.

Fette ippocampali orizzontali del cervello del topo

Presentiamo un protocollo per preparare fette acute dall'ippocampo dorsale-intermedio dei topi. Confrontiamo questa preparazione trasversale con l'affezione coronale in termini di qualità delle registrazioni e conservazione delle caratteristiche morfologiche dei neuroni registrati.

Preparazione di fette acute dall'ippocampo dorsale per la registrazione a cellule intere e la ricostruzione neuronale nel giro dentato di topi adulti

La microscopia elettronica a scansione a blocchi seriali (SBEM) viene applicata per l'immagine e l'analisi delle spine dendritiche nell'ippocampo murino.

Microscopia elettronica a scansione a blocchi seriali (SBEM) per lo studio delle spine dendritiche

Qui, è dimostrato come un modello di lesione a testa chiusa sveglia può essere utilizzato per esaminare gli effetti della lesione cerebrale traumatica lieve ripetuta (r-mTBI) sulla plasticità sinaptica nell'ippocampo. Il modello replica importanti caratteristiche di r-mTBI nei pazienti e viene utilizzato in combinazione con l'elettrofisiologia in vitro .

Valutazione dei cambiamenti nella plasticità sinaptica utilizzando un modello di trauma cranico chiuso sveglio di lieve lesione cerebrale traumatica

Questo studio presenta un protocollo per stabilire un modello animale altamente riproducibile di trasformazione emorragica (HT) utilizzando l'occlusione/riperfusione dell'arteria cerebrale media (MCAO/R) in topi C57BL/6 con iperglicemia acuta.

Un modello murino di trasformazione emorragica indotta da iperglicemia acuta combinata con ischemia focale transitoria

Impara il metodo di recupero protettivo NMDG per preparare fette cerebrali acute da animali adulti. Questa tecnica ottimizzata migliora la conservazione neuronale per registrazioni patch clamp in elettrofisiologia.

Preparazione di fettine di cervello acuto utilizzando un' ottimizzata N-metilico-D-metodo di ripristino protettivo glucamine

Esplora altri video