Preparazione di fettine di cervello acuto utilizzando un' ottimizzata N-metilico-D-metodo di ripristino protettivo glucamine

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di preparare fette di cervello sane da animali adulti maturi che siano adatte per esperimenti di elettrofisiologia con patch clamp. Quindi questo metodo di recupero protettivo NMDG ottimizzato per la preparazione di fette di cervello consente ai ricercatori di esplorare le proprietà intrinseche e sinaptiche dei tipi di cellule cerebrali in molte regioni cerebrali diverse e per animali di praticamente qualsiasi età. Quindi il vantaggio principale di questa particolare tecnica è che permette di preparare fette di cervello che hanno un grado di conservazione neuronale più elevato rispetto alle metodologie precedenti.

E anche che queste fette di cervello sono più adatte per la registrazione con patch clamp. Questo metodo è stato ottimizzato per il tessuto cerebrale di topo adulto. Può essere utilizzato per una varietà di altre specie, tra cui il tessuto cerebrale umano resecato neurochirurgicamente.

Per iniziare questa procedura, impostare la stazione di affettatura con l'affettatrice per tessuti e gli strumenti chirurgici. Fissare una lama dell'iniettore in zirconio-ceramica al braccio della lama utilizzando la colla adesiva rapida. Quindi inserire il portacampioni e allineare il bordo anteriore della lama al bordo del portacampioni.

Lasciando un piccolo spazio per garantire che la lama non raschi il metallo. Riempire un becher da 250 millilitri con 200 millilitri di NMDG HEPES aCSF. E pre-raffreddarlo su ghiaccio con una carbogenazione costante per più di 10 minuti.

Quindi impostare la camera di recupero iniziale della fetta cerebrale riempiendola con 150 millilitri di NMDG HEPES aCSF. E posizionare la camera in un bagno d'acqua a 32-34 gradi Celsius. Per allestire una camera di contenimento della fetta cerebrale, riempire il serbatoio con 450 millilitri di HEPES aCSF e lasciarlo riscaldare a temperatura ambiente sotto costante carbogenazione fino all'uso.

Successivamente, preparare l'agarosio fuso per l'inclusione dei tessuti ritagliando un blocco di agarosio al 2% dal piatto precedentemente preparato utilizzando l'estremità aperta di una fiala conica da 50 millilitri. Tappare la fiala conica, quindi cuocerla nel microonde per 10-30 secondi fino a quando l'agarosio inizia a sciogliersi. Non surriscaldare.

Versare l'agarosio fuso in tubi da 1,5 millilitri. Mantenere l'agarosio allo stato fuso utilizzando un termomiscelatore impostato a 42 gradi Celsius con una vigorosa agitazione. E assicurarsi attentamente che l'agarosio fuso non si solidifichi prematuramente.

Pre-raffreddare il blocco di raffreddamento accessorio per l'affettatrice su ghiaccio in questo momento. In questa procedura, fai un taglio sulla pelle della testa per esporre la calotta cranica. Quindi, usa le forbici da taglio super fine per tagliare via la pelle sopra la calotta cranica.

E fai piccole incisioni lateralmente su entrambi i lati della base ventrale caudale del cranio. Eseguire ulteriori tagli superficiali a partire dalla faccia dorsale caudale del cranio muovendosi in direzione rostrale lungo la linea mediana dorsale. Facendo attenzione a non danneggiare il cervello sottostante.

Successivamente, eseguire un taglio a T finale perpendicolare alla linea mediana a livello dei bulbi olfattivi. Successivamente, utilizzare la pinza a punta tonda per afferrare il cranio partendo dall'aspetto rostrale mediale e sbucciare verso la direzione laterale caudale da un lato. Ripetere questa procedura per aprire l'altro lato.

E rimuovere le metà dorsali della calotta cranica per esporre il cervello. Estrarre delicatamente il cervello intatto nel becher di NMDG HEPES aCSF pre-raffreddato. E lascia che il cervello si raffreddi uniformemente per circa un minuto.

Ora, usa una spatola grande per trasferire il cervello dal becher sulla capsula di Petri ricoperta di carta da filtro. Taglia e monta il cervello in base all'angolo di taglio preferito e alla regione cerebrale di interesse desiderata. Lavorare rapidamente per evitare una prolungata privazione di ossigeno durante la manipolazione.

Successivamente, fissare il blocco cerebrale al supporto del campione utilizzando la colla adesiva. Ritrarre la parte interna del portacampioni per estrarre completamente il blocco cerebrale all'interno. Quindi versare l'agarosio fuso direttamente nel supporto fino a quando il blocco cerebrale non è completamente ricoperto di agarosio.

Successivamente, bloccare il blocco di raffreddamento accessorio pre-raffreddato attorno al portacampioni per dieci secondi fino a quando l'agarosio non si è solidificato. Inserire il portacampioni nell'apposito recipiente dell'affettatrice e verificare il corretto allineamento. Successivamente, riempire il serbatoio con il rimanente NMDG HEPES aCSF ossigenato pre-raffreddato dal becher da 250 millilitri e posizionare la pietra a bolle nel serbatoio per tutta la durata dell'affettatura, per garantire un'adeguata ossigenazione.

Quindi, regolare il micrometro per iniziare a far avanzare il campione cerebrale incorporato nell'agarosio. Avviare l'affettatrice e regolare empiricamente la velocità di avanzamento e la frequenza di oscillazione al livello desiderato. Continuare ad avanzare e affettare il tessuto con incrementi di 300 micrometri fino a quando la regione cerebrale di interesse non è completamente sezionata.

Il tempo totale per la procedura di affettatura dovrebbe essere inferiore a 15 minuti. Per il recupero iniziale di NMDG. Al termine della procedura di sezionamento, raccogliere tutte le fette utilizzando una pipetta da pascolo in plastica tagliata e trasferirle in una camera di recupero a 34 gradi Celsius riempita con 150 millilitri di NMDG HEPES aCSF.

La tempistica della fase di recupero acuto della fetta cerebrale è molto importante per poter trovare un equilibrio tra la conservazione morfologica e il recupero funzionale delle proprietà elettrofisiologiche di ciascun neurone. Dopo aver determinato il programma ottimale di spike-in di sodio, in base all'età del topo, eseguire la procedura di spike-in di sodio della fase Y aggiungendo i volumi indicati di soluzione di sodio spike-in ai tempi indicati. Aggiungere la soluzione di sodio spike-in direttamente nel camino del gorgogliatore della camera di recupero iniziale per facilitare una rapida miscelazione.

Il programma di picco di sodio che è stato fornito con una varietà di diverse fasce d'età è davvero un buon punto di partenza. Ma dovrebbe essere ottimizzato e utilizzato per il tuo specifico progetto sperimentale. Successivamente, trasferire tutte le fette nella camera di mantenimento a lungo termine HEPES aCSF mantenuta a temperatura ambiente.

Lasciare che le fette si riprendano per un'altra ora nella camera di contenimento HEPES prima di procedere agli esperimenti di registrazione con patch clamp. Qui sono mostrate le immagini IR DIC rappresentative che sono state acquisite da diverse regioni del cervello e fette acute da un topo di tre mesi per la valutazione della conservazione morfologica dei neuroni. I risultati qui mostrati derivano dall'uso del metodo di taglio protettivo NMDG di controllo senza una fase di recupero protettiva.

Mentre questi risultati provengono dal metodo di recupero protettivo NMDG ottimizzato. Nel complesso, si osserva una migliore conservazione neuronale con il metodo di recupero protettivo NMDG ottimizzato. Il metodo di recupero protettivo NMDG ottimizzato con una procedura di spike-in graduale del sodio è stato confrontato con il metodo di recupero protettivo NMDG originale.

Il tempo medio per la formazione della tenuta GigaOhm e la registrazione del patch clamp è stato drasticamente e significativamente ridotto quando è stata applicata la procedura di spike-in graduale del sodio insieme alla fase di recupero protettivo NMDG. La migliore conservazione dei neuroni ottenuta con questo metodo di fetta cerebrale facilita applicazioni sperimentali impegnative, tra cui, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, l'elettrofisiologia del patch clamp multi-elettrodo per sondare la connettività sinaptica locale. Come dimostrato qui, utilizzando fette di cervello neocorticale umano adulto derivate dalla neurochirurgia.

Guardando questo video, gli scienziati dovrebbero avere una buona comprensione di come implementare il nostro metodo di recupero protettivo NMDG ottimizzato, inclusa la nuova procedura di spike-in di sodio che abbiamo descritto, per preparare fette di cervello adatte per le registrazioni di patch clamp. Quindi, dopo aver padroneggiato questo protocollo, dovrebbe essere possibile completare la procedura di fetta del cervello in meno di un'ora al giorno. E dovrebbe produrre fette di cervello riproducibili di alta qualità e funzionerà per animali di praticamente qualsiasi età.

Quindi questa procedura, questo metodo può aiutare a preparare fette di cervello adatte ad affrontare domande sulla funzione cerebrale utilizzando tecniche come l'elettrofisiologia, l'imaging ottico dal vivo e l'optogenetica, i saggi di traffico dei recettori e altri tipi di saggi funzionali per esplorare la funzione dei tipi di cellule cerebrali. Quindi questa tecnica è utile anche perché aiuterà i ricercatori a sondare funzionalmente diverse regioni del cervello, comprese le regioni del cervello che non sono tradizionalmente suscettibili per la registrazione del patch clamp da animali adulti in fette di cervello.