Microscopia episcopica ad alta risoluzione (HREM) - protocolli semplici e robusti per la lavorazione e la visualizzazione di materiali organici
7 luglio 2017
Forniamo protocolli semplici e robusti per la trasformazione di materiale bioptico di varie specie, embrioni di organismi del modello biomedico e campioni di altri tessuti organici per consentire la generazione di dati digitali di volume con il metodo di microscopia episcopica ad alta risoluzione.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare dati digitali sul volume di materiali organici. Esempi sono gli embrioni e i tessuti embrionali di organismi modello biomedici, i blocchi di tessuto raccolti da animali adulti e dall'uomo, comprese le biopsie cutanee o muscolari e materiali come carta non patinata e sostituti della pelle. HREM aiuta a rispondere a domande fondamentali nel campo della medicina e della ricerca biomedica.
Consente l'analisi tridimensionale e la visualizzazione di organi e tessuti, ad esempio, di embrioni di topo geneticamente modificati o embrioni di pulcini manipolati. Consente inoltre l'analisi di modelli tumorali e biopsie prelevate da tessuti umani o animali. Il vantaggio principale di HREM è che fornisce un modo semplice per generare pile di immagini di qualità quasi istologica.
Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla ricerca sulla guarigione delle ferite utilizzando modelli animali, nonché alla filatura e alla riparazione delle patologie tissutali negli esseri umani. A dimostrare la procedura saranno i BMR Marlene Rodler e Johannes Gunther. Entrambi dell'Università di Medicina di Vienna, Divisione di Anatomia.
Inizia con embrioni fissati o tessuto embrionale di non più grande di 5 x 5 x 5 millilitri cubi. Rimuovere il fissativo. E aggiungi PBS.
Lavare a quattro gradi Celsius con oscillazione costante per 24 ore. Aggiungere il 70% di etanolo alle provette contenenti il tessuto e posizionare i campioni su un rotatore a quattro gradi Celsius. Dopo due o tre ore, continuare a disidratare i campioni in soluzioni di etanolo a concentrazione crescente per due o tre ore ogni volta.
Mentre i campioni si disidratano, preparare la soluzione di infiltrazione aggiungendo 0,3125 grammi di perossido di benzoile e 0,1 grammi di ESN a 25 millilitri di soluzione A in un becher. Mescolare su una piastra magnetica a quattro gradi Celsius per due o tre ore fino a quando l'ESN e il catalizzatore non sono completamente disciolti. Mettere i campioni in una soluzione di infiltrazione.
E scuotere o ruotare i campioni per 12-24 ore a quattro gradi Celsius. Inizia preparando la soluzione di inclusione. Aggiungere un millilitro o la soluzione B a 25 millilitri di soluzione di infiltrazione fresca.
Dopo aver preparato i vassoi per tazze di stampaggio, riempire la cavità profonda degli stampi con soluzione di inclusione. Trasferire i campioni negli stampini utilizzando un cucchiaio. Assicurarsi che il campione sia completamente coperto con una soluzione di inclusione per evitare di intrappolare l'aria.
Orientare il campione all'interno dello stampo utilizzando aghi o pinze. È fondamentale ottimizzare l'orientamento del campione durante l'inclusione e contrassegnare la sua posizione precisa sulla superficie del blocco. In questo modo la regione di interesse può essere mantenuta piccola e l'obiettivo con il massimo ingrandimento possibile può essere utilizzato.
Non appena la soluzione di inclusione inizia a diventare viscosa, posizionare un portablocchi sopra lo stampo e aggiungere la soluzione di inclusione attraverso il foro centrale del supporto per blocchi fino a quando la soluzione di inclusione non si solleva da uno a due millimetri sopra la base del supporto per blocchi. Sigillare il vassoio della tazza di stampaggio coprendolo con cera di paraffina liquida e attendere che si sia indurito prima di spostarlo. Lasciare che i blocchi completino la polimerizzazione conservando i vassoi sigillati per uno o due giorni a temperatura ambiente.
Per il processo di post-polimerizzazione, posizionare i vassoi delle tazze di stampaggio con i blocchi polimerizzati in un forno da laboratorio standard e cuocere a 70-80 gradi Celsius per un minimo di uno o due giorni. Togliete i blocchi dagli stampi. Quindi identificare il campo visivo dirigendo la luce bianca obliquamente sulla superficie del blocco.
Traccia l'ombra del campione con il pennarello nero sulla superficie del blocco. Montare il blocco di resina con il campo visivo indicato sul microtomo e spostare il supporto del blocco nella posizione di arresto. Avvia la fotocamera digitale e il software di generazione dati e acquisisci un'immagine dal vivo.
Scegliere un obiettivo con ingrandimento appropriato per coprire la regione di interesse. Muovi l'ottica su e giù e il microtomo lateralmente fino a quando la regione di interesse non corrisponde al campo visivo visualizzato sullo schermo del computer. Sezionare il blocco fino a quando le prime strutture del campione diventano visibili.
Spostare il microtomo per disporre la superficie del blocco nel piano focale dell'ottica. Scegli uno spessore della sezione compreso tra 0,5 e cinque micron. Quindi, dopo aver configurato il software secondo le istruzioni del produttore, avviare il software e iniziare l'acquisizione dei dati.
Questa immagine della sezione HREM mostra una sezione sagittale attraverso un embrione di topo raccolto al giorno embrionale 9.5. Questo modello 3D renderizzato in volume mostra la superficie di questo embrione. Questa immagine mostra una sezione sagittale virtuale attraverso un modello di volume renderizzato del collo dell'embrione di topo raccolto al giorno embrionale 15.5.
Il modello di superficie evidenzia la lumina del sistema cardiovascolare in un rendering del volume di tutti i tessuti di un embrione di pollo, uno stadio di sviluppo Hamburger Hamilton Hamilton 18. Questa immagine mostra una sezione HREM attraverso un nervo umano. L'intarsio ingrandisce la sezione di questa immagine.
Questa immagine mostra parte di un'immagine di sezione HREM attraverso il fegato suino. Questa immagine mostra un modello 3D con rendering volumetrico di una biopsia prelevata da un polpastrello umano. Questa immagine mostra i modelli renderizzati in superficie di arterie, vene e nervi dermici di fronte a una resezione virtuale attraverso i dati HREM.
Questa animazione mostra un modello con rendering volumetrico della pelle spessa di un polpastrellino umano. Soglie diverse e quindi strutture dermiche diverse, come i vasi sanguigni, le fibre nervose, le ghiandole sudoripare e i dotti delle ghiandole sudoripare. HREM consente una rapida visualizzazione dell'architettura del materiale fibroso.
Questa immagine mostra un modello di volume renderizzato di materiale sostitutivo dermico nativo. Questa animazione mostra il modello con rendering del volume del materiale sostitutivo dermico. Da notare la diversa forma e il calibro delle fibre.
I campioni devono essere disidratati, infiltrati e incorporati nella resina, in modo che l'intera procedura possa richiedere fino a diversi giorni, ma includa solo due o tre ore di lavoro operativo per la preparazione delle soluzioni, la sostituzione delle soluzioni e così via. La generazione dei dati è completamente automatizzata sull'apparato HREM e 1000 immagini possono essere prodotte in due o tre ore. Dopo il suo sviluppo, HREM ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia dello sviluppo per valutare con precisione il fenotipo degli embrioni di topo mutanti.
Un esempio è il progetto di decifrazione dei disturbi dello sviluppo o DMDD in cui HREM viene utilizzato per fenotipizzare, embrionalmente letali embrioni di topo in dettagli ancora sconosciuti. Si è scoperto che HREM è anche un'eccellente alternativa alla microscopia ottica posizionale per esaminare i vasi sanguigni, i nervi o l'architettura delle fibre in campioni di tessuto umano.
Panoramica
Questo articolo presenta protocolli per l'elaborazione di materiali bioptici e tessuti organici al fine di generare dati volumetrici digitali mediante microscopia episcopica ad alta risoluzione (HREM). Il metodo consente la visualizzazione e l'analisi tridimensionale di vari campioni biologici, inclusi embrioni e biopsie.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Ricerca biomedica
- Storia
- Tecniche di microscopia
Contesto
- L'HREM fornisce immagini di qualità quasi istologica.
- È applicabile a diversi materiali organici, inclusi tessuti umani e animali.
- La tecnica aiuta a comprendere questioni mediche fondamentali.
- Supporta la ricerca in ambiti come la guarigione delle ferite e i modelli di cancro.
Scopo dello studio
- Sviluppare protocolli robusti per l'elaborazione dei tessuti.
- Facilitare la generazione di dati volumetrici digitali ad alta risoluzione.
- Potenziare l'analisi tridimensionale dei campioni biologici.
Metodi Utilizzati
- Disidratazione e infiltrazione dei campioni di tessuto.
- Inclusione dei campioni in resina per la sezionatura.
- Utilizzo di un microtomo per la sezionatura precisa.
- Acquisizione automatica dei dati per la generazione di serie di immagini.
Risultati principali
- Generazione con successo di modelli 3D da vari tipi di tessuto.
- Visualizzazione di strutture complesse come vasi sanguigni e nervi.
- Dimostrazione della tecnica su tessuti di topo e umani.
- Acquisizione rapida delle immagini con output di alta qualità.
Conclusioni
- L'HREM è uno strumento prezioso per la ricerca biomedica.
- I protocolli stabiliti sono semplici ed efficaci.
- Questo metodo migliora la comprensione dell'architettura tissutale.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
La microscopia episcopica ad alta risoluzione (HREM) consente ai team di ricerca e sviluppo biofarmaceutici di generare dati tridimensionali di volume di qualità prossima a quella istologica a partire da campioni organici, supportando la riduzione del rischio meccanicistica nella fase iniziale della scoperta. Il metodo fornisce un'elevata affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi attraverso la visualizzazione di architetture tissutali complesse, come la vascolarizzazione e l'innervazione, in modelli pertinenti alla malattia. Questa capacità facilita la selezione del portafoglio riducendo l'ambiguità biologica nella scelta dei candidati preclinici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante la visualizzazione tridimensionale di strutture organotipiche in embrioni geneticamente modificati e biopsie umane.
- Valore operativo: Supporta la validazione funzionale degli obiettivi chiarificando le relazioni spaziali nei modelli di patologia tissutale.
- Valore predittivo: Aumenta la sicurezza nell'identificazione dei composti promettenti mediante fenotipizzazione dettagliata a livello subcellulare di modelli letali nell'embrione.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Produce dati digitali standardizzati e riproducibili del volume, consentendo confronti quantitativi tra diverse condizioni sperimentali.
- Valore operativo: Facilita la predisposizione del saggio mediante acquisizione automatica delle immagini, ottenendo oltre 1000 sezioni allineate in 2–3 ore.
- Scalabilità: Permette il riutilizzo della piattaforma su diversi materiali organici, inclusi embrioni, biopsie e biomateriali fibrosi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Collega le fasi di scoperta e preclinica consentendo la sezione virtuale e la modellizzazione 3D di biopsie di tessuti umani e modelli animali di malattia.
- Allineamento dei Biomarcatori: Favorisce lo sviluppo di biomarcatori traslazionali attraverso la visualizzazione di fenotipi strutturali nei modelli di guarigione delle ferite e nei modelli tumorali.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Guida le decisioni di proseguimento o interruzione fornendo dati architettonici ad alta fedeltà per la riduzione del rischio meccanicistico.
Integrazione della Pipeline e del Flusso di Lavoro
L'HREM si integra nel percorso della scoperta, dalla biologia iniziale all'identificazione del composto attivo fino alla validazione preclinica, fornendo letture quantitative in 3D che supportano la verifica delle ipotesi e l'analisi dei percorsi biologici.
- Biologia della scoperta: Consente la verifica di ipotesi e la riduzione del rischio biologico mediante fenotipizzazione 3D di embrioni mutanti e modelli di malattia.
- Screening: Fornisce pile di immagini pronte per saggi, riproducibili e di qualità prossima a quella istologica, per una valutazione affidabile dei composti.
- Analisi: Produce output quantitativi volumetrici e con rendering della superficie che permettono ai team di confrontare fenotipi strutturali in diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica attraverso la visualizzazione 3D di biopsie umane e architetture tessutali animali.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come piattaforma di imaging riutilizzabile, applicabile a diversi tipi di campioni organici e aree terapeutiche.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce una previsione affidabile nella validazione degli obiettivi attraverso una visualizzazione tridimensionale ad alta risoluzione della microstruttura dei tessuti.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità grazie all'acquisizione automatizzata dei dati e all'allineamento intrinseco delle immagini.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale riducendo il rischio biologico in fase avanzata mediante una riduzione precoce del rischio meccanicistico.
- Impatto sul portafoglio: Consente una priorizzazione basata sul rischio fornendo letture strutturali chiare per decisioni di avanzamento o interruzione del progetto.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specialistiche in istologia, elaborazione dei tessuti e microscopia per una preparazione e orientamento ottimali del campione.
- È dipendente dall'infrastruttura comprendente microtomo, videocamera digitale e software di visualizzazione 3D per la generazione dei dati.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro riguardo all'orientamento nell'inclusione e alla marcatura delle regioni di interesse, al fine di ottenere risultati coerenti.
- Richiede considerazioni di adattamento tra diversi sistemi modello a causa delle variazioni nelle dimensioni, densità e proprietà di colorazione dei tessuti.
- È limitato dalle dimensioni del campione (fino a 5x5x7 mm) e dall'intervallo di spessore delle sezioni (0,5–5 μm), che possono limitare l'applicazione a organi più grandi.
