Name: Rapida acquisizione di immagini 3D utilizzando ad alta risoluzione Episcopica Microscopia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Impara a ottenere immagini 3D ad alta risoluzione di embrioni di topo utilizzando microscopia episcopica. Questo metodo facilita l'analisi morfometrica dettagliata in biologia dello sviluppo con attrezzatura standard.

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Ringraziamo i dottori Yichen Huang, Chunming Guo e Zhenfang Zhou per il loro supporto tecnico. Questa ricerca è stata finanziata da NIH/NIDDK (1R01DK091645-01A1, XL) e American Heart Association (AHA, 13GRNT16950006, XL).

Tutti gli usi animali sono approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale animali all&#39;ospedale dei bambini Boston. Preparazione 1. Esempio <ol><li> accoppiamento temporizzata <ol><li> Inserire un C57Bl6 tipo selvaggio maschio e una femmina insieme nella stessa gabbia. </li><li> Controllare per la formazione di una spina di accoppiamento mattina successiva. La spina di accoppiamento (aka, vaginale o la spina copula) è una deposizione gelatinosa indurito che blocca la vagina. </li><li> Impostare la data presa come giorno embrionale 0,5 (E0.5). </li></ol></li><li> Isolamento di embrioni di topo <ol><li> Eutanasia femmine gravide da CO 2 asfissia. </li><li> Mettere topi supina su un tampone assorbente e spruzzare regione addominale con il 70% di etanolo. </li><li> Sollevare la pelle e rendere una prima incisione 5 mm per la regione addominale caudale con le forbici chirurgiche. Tagliare e rimuovere la pelle addominale per esporre completamente gli organi interni </li><li> Tagliare vicino vagina per rimuovere l&#39;intero utero. </li><li> Tagliare tra i siti di impianto lungo il corno uterino. Ogni segmento o concepito dovrebbe avere un solo embrione dentro. </li><li> Mantenere i segmenti uterine a 1x fosfato ghiacciata salina tamponata (PBS). </li></ol></li><li> embrione dissezione <ol><li> Luogo ogni conceptus in un piatto a parte con PBS ghiacciato sotto uno stereoscopio. </li><li> Rimuovere i tessuti uterini, placenta e poi membrane fetali in modo sequenziale utilizzando dissettore sottili. </li><li> Trasferire l&#39;embrione sezionato ad un tubo da 50 ml con 1x freddo ghiaccio PBS utilizzando una pipetta di trasferimento di grandi dimensioni. Evitare di raccogliere embrione direttamente con una pinza per ridurre al minimo i danni ai tessuti. </li></ol></li><li> Fissazione <ol><li> Fissare gli embrioni sezionati a 10% soluzione neutra formalina tamponata a 4 ° C per più di 24 ore con almeno 10 volumi di campione di fissativo. </li></ol></li><li> Pretrattamento <ol><li> Preparare la Soluzione Clearing: 4M urea, 10% glicerolo, 4% di sodio dodecilsolfato (SDS) in acqua bidistillata. </li><li> Sostituire il fissativo con la soluzione Clearing. </li><li> Ruotare delicatamente il campione su un rocker a temperatura ambiente per 1 - 2 settimane. Sostituire la soluzione compensazione una volta al secondo e al terzo giorno. Il campione diventa lentamente chiaro e traslucido. </li><li> Sostituire la soluzione di compensazione con formalina al 10% e lasciare su una sedia a dondolo per 2 giorni. </li></ol></li><li> Disidratazione <ol><li> Lavare i campioni pretrattati con 1x PBS 3 volte per 5 minuti ciascuno. </li><li> Disidratare i campioni in una serie di etanolo ascendente a temperatura ambiente su una sedia a dondolo gentile. Per embrioni E15.5, utilizzare una serie ascendente di etanolo incluso il 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% e 100% etanolo, 2 hr ogni passo. Per embrioni più vecchi, il tempo di incubazione deve essere aumentata. </li></ol></li><li> colorazione <ol><li> Preparare la colorazione Soluzione: aggiungere 0.1375 grammi di eosina Y Disodium Salt e 0,0275 grammi di arancio di acridina emi (cloruro di zinco) sale a 50 ml di etanolo al 100%. Mescolare per 2 ore. Filtro con una carta da filtro. Conservare a temperatura ambiente ed evitare la luce coprendo con un foglio di alluminio. </li><li> Trasferire esemplare per la soluzione colorante per 1 ora. </li><li> Sostituire con soluzione colorante fresco e macchia durante la notte. </li></ol></li><li> Infiltrazione <ol><li> Preparare infiltrazione Soluzione: coniugare 100 ml di soluzione A di JB-4 kit di embedding, 1,25 g di catalizzatore C, 0,275 g di eosina Y Disodium Salt e 0,055 g di acridina arancio emi (cloruro di zinco) sale. Mescolare per mescolare (200 rpm) in un secchio di ghiaccio per 2 ore, e poi filtrare con la carta da filtro. </li><li> Conservare la soluzione di infiltrazione a 4 ° C per evitare la luce coprendo con un foglio di alluminio. </li><li> Trasferire gli embrioni per infiltrazione Soluzione: La colorazione Soluzione (1: 1), e incubare per almeno 3 ore su una sedia a dondolo a 4 ° C. </li><li> Trasferire gli embrioni per infiltrazione Solution e incubare per 3 orer su un bilanciere in una camera fredda. </li><li> Sostituire infiltrazione soluzione una volta al giorno, e lasciare in una stanza fredda su una sedia a dondolo dolce per altri tre giorni. </li></ol></li></ol> 2. Embedding <ol><li> Mantenere Soluzione B e l&#39;infiltrazione soluzione su ghiaccio. </li><li> Fare Embedding Solution (01:25 di soluzione B e infiltrazione Solution) immediatamente prima di incorporamento. </li><li> Orientare il campione in uno stampo embedding, poi versare freddo Solution Incorporare nello stampo embedding delicatamente. Ri-orientare con uno spillo, se necessario. </li><li> Utilizzare un perno per esaminare se la soluzione Embedding è solidificato. Spingere il blocco del campione, e tagliare, se necessario. </li><li> Riorientare il blocco del campione usando lo stampo separata per ottenere un orientamento trasversale. </li><li> Mettere un titolare di blocco sulla parte superiore dello stampo embedding. Delicatamente versare Integrazione Soluzione nello stampo fino a quando lo stampo e il titolare del blocco sono sommersi da Incorporare Solution. </li><li> Conservare il campione in un contenitore secondario e lasciarein ghiaccio per 3 - 4 ore in una cappa aspirante. </li><li> Conservare i campioni solidificati in un 4 ° C. </li><li> Sbucciare via lo stampo embedding. Mettere il blocco con lo stereomicroscopio con illuminazione obliqua per ispezionare la posizione del campione nel blocco. Sulla faccia del blocco, le linee della griglia marchio in tutto il campione. </li><li> Tagliare il blocco per rimuovere quantità accesso di incorporare materiale utilizzando le linee della griglia indicati come riferimenti. </li></ol> 3. Acquisizione di immagini <ol><li> Bloccare il blocco del campione al microtomo e ottenere una superficie di taglio fresco. Impostare lo spessore della sezione (ad esempio, e9.5-10.5, 1,5 micron; e11.5-12.5, 2,0 micron; e13.5-15.5, 2,5 micron; E16.5-anziani, 3 micron). Mantenere il campione / blocco alla posizione iniziale del microtomo. </li><li> Montare il stereo microscopio con zoom fronte orizzontalmente la superficie del blocco di campione. </li><li> Accendere il computer e il microscopio, e avviare il software di acquisizione delle immagini. </li><li> Visualizzare e mettere a fuoco l&#39;ottica al blocco facciain modalità &quot;live view&quot; del software di imaging. </li><li> Allineate microscopio e microtomo se necessario in modo che il blocco faccia è al centro del mirino. </li><li> Regolare zoom in modo che l&#39;intero blocco-faccia è nel mirino. </li><li> Selezionare verde filtro proteina fluorescente (GFP) (eccitazione 470 ± 20 nm, dicroiche 495 nm, emissione di 525 ± 25 nm) e riorientare, se necessario. </li><li> Misurare e impostare il tempo di esposizione manualmente (ad esempio, 80-400 mini sec). </li><li> Acquisire le immagini del blocco faccia dopo ogni taglio fresco e salvare automaticamente le immagini, se possibile. </li><li> Registra parametri importanti, tra cui la risoluzione, spessore della sezione e lo zoom. </li><li> Dopo aver terminato l&#39;intero campione, l&#39;esportazione e convertire tutti i file di immagine in formato JPEG, se necessario. </li><li> Invertire tutte le immagini originali che utilizzano un software di elaborazione delle immagini, e regolare la luminosità e il contrasto. </li><li> Salvare tutte le immagini elaborate in una cartella separata. </li></ol> 4. 3DVisualizzazione <ol><li> Carica tutte le immagini elaborate da un software di visualizzazione 3D seguendo le istruzioni. </li><li> Risoluzione e spessore della sezione per convertire tutte le immagini a dati volumetrici (ad esempio, le dimensioni voxel) e salvare il file 3D. </li><li> Allineare tutte le immagini utilizzando la modalità automatica. Regolare le singole immagini manualmente, se necessario. </li><li> Salvare l&#39;immagine allineata a un nuovo nome file. </li><li> Analizzare le caratteristiche morfometriche del campione utilizzando il software di visualizzazione 3D. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui, vi presentiamo un protocollo modificato utilizzando attrezzature di laboratorio di routine per acquisire immagini HREM seriali che sono compatibili per la visualizzazione 3D rapida e analisi morfometrica di strutture complesse. Perché le immagini ad alta risoluzione sono presi direttamente dalla faccia blocco, invece di singole sezioni, le caratteristiche morfologiche pregiati sono conservati e rapidamente ricostruito digitalmente in un programma di visualizzazione 3D. imaging 3D offre ...

L'avvento delle tecnologie di imaging 3D ha aperto la possibilità di analisi sistemica di caratteristiche morfologiche dettagliate durante lo sviluppo fetale. È ora disponibile una varietà di modalità di imaging 3D, tra cui la risonanza micromagnetica (micro-MRI), la micro tomografia computerizzata, l'ecografia ad alta frequenza, la tomografia a coerenza ottica, la tomografia ottica a progetto e la microscopia episcopica1-4. Ogni modalità ha le sue caratteristiche uniche in termini di risoluzione, contrasto, velocità, costo, capacità in utero e disponibilità.
L'acquisizione di immagini a fluorescenza episcopica (EFIC) e la microscopia episcopica ad alta risoluzione (HREM) sono metodi di imaging per microscopia episcopica4. In questo caso, le immagini seriali ad alta risoluzione vengono acquisite in modo continuo dalla faccia del blocco anziché dalle sezioni di tessuto. Le immagini risultanti riflettono fedelmente le caratteristiche morfologiche dettagliate con una distorsione tissutale minima o nulla. I dati volumetrici acquisiti vengono prontamente convertiti in immagini 3D ad alta risoluzione adatte per un'accurata analisi morfometrica. A causa del costo relativamente basso e dell'alta risoluzione, HREM ed EPIC sono diventate le alternative superiori per la valutazione sistemica di modelli murini di difetti congeniti umani2,4-8.
Sia il metodo EFIC che quello HREM richiedono che i campioni siano incorporati nel mezzo adatto. EFIC rileva l'autofluorescenza emessa dal tessuto incorporato. Per questo motivo, è limitato ai campioni che emettono alti livelli di autofluorescenza, ma non a quelli con autofluorescenza relativamente debole come gli embrioni in fase iniziale9. Per superare la dipendenza dall'autofluorescenza, i campioni vengono colorati con un colorante fluorescente come l'eosina per l'imaging HREM. La scelta dei coloranti e dei metodi di colorazione rende anche HREM più compatibile per rilevare i segnali molecolari nel contesto dell'architettura e della morfologia dei tessuti4,10.
In questo articolo, presentiamo un protocollo HREM migliorato adatto per la valutazione di tutto il corpo degli embrioni di topo in fase avanzata. Per facilitare la colorazione, includiamo una fase di pretrattamento per aumentare la penetrazione nei tessuti, consentendo così l'imaging HREM di embrioni di topo più vecchi.

<table><tbody><tr><td>Topi</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>C57BL6</td><td></td></tr><tr><td>Alcool etilico</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>111000200</td><td>200 Proof, Absolute, ACS / USP / Kosher Grade</td></tr><tr><td>Formalina</td><td>Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma</td><td>U5128</td><td>Soluzione di chiarificazione</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Glycerol Fisher scientific G33-4Sodio Dodecil Solfato</td><td>Invitrogen</td><td>15525-017</td><td>Soluzione di pulizia</td></tr><tr><td>Eosina Y Sale disodico</td><td>Fisher scientific</td><td>BP241925</td><td>Soluzione di infiltrazione</td></tr><tr><td>Acridina Orange hemi (cloruro di zinco) sale</td><td>Sigma</td><td>A6014</td><td>Soluzione di infiltrazione</td></tr><tr><td>Whatman carta</td><td>GE</td><td>3030-153</td><td></td></tr><tr><td>JB-4 Kit di inclusione - Soluzione A</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>0226A-800</td><td>Soluzione di infiltrazione</td></tr><tr><td>JB-4 Kit di inclusione - Soluzione B</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>0226B-30</td><td>Soluzione di inclusione</td></tr><tr><td>JB-4&nbsp; Kit di inclusione - Catalyst</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>02618-12</td><td>Soluzione di infiltrazione</td></tr><tr><td>Stampi per incorporamento</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23185-1</td><td>16 x 8 mm</td></tr><tr><td>Peel-A-Way Sharp Embedding Stampi</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18986-1</td><td>22 mm x 22 mm quadrato, troncato a 12 mm x 12 mm</td></tr><tr><td>JB-4&nbsp; Supporti per blocchi in plastica</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>15899</td><td></td></tr><tr><td>Tubi di trasferimento graduati monouso</td><td>VWR</td><td>414004-014</td><td></td></tr><tr><td>Piatto Petrl</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td>Pinze per dissezione embrionale</td></tr><tr><td>Punta in acciaio</td> inox <td> ROBOZ</td><td>RS-5015</td><td>Dissezione embrionale</td></tr><tr><td>Graefe Pinza tissutale</td><td> ROBOZ</td><td>RS-5153</td><td>Dissezione embrionale</td></tr><tr><td>Forbice operativa delicata</td><td>&nbsp; ROBOZ</td><td>RS-6700</td><td>Dissezione embrionale</td></tr><tr><td>14 ml Polipropilene Provette a fondo tondo</td><td>Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Provette coniche</td><td>in polipropilene Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Secchiello per il ghiaccio</td><td>Magic Touch Iceware International Corp.</td><td>R19-343</td><td></td></tr><tr><td>100 ml (3.4 once) Pese in polistirene antistatico Barche</td><td>VWR</td><td>89106-766</td><td></td></tr><tr><td>330 ml (11.2 oz.) Pesa Polistirene Antistatico VWR</td><td></td><td>89106-770</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di Sodio</td><td>MP Biomedicals</td><td>102892</td><td>Soluzione PBS</td></tr><tr><td>Cloruro di Potassio</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td>Soluzione PBS</td></tr><tr><td>Fosfato di Potassio monobasico</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Fosfato di sodio eptaidrato Bibasico</td> Soluzione <td>Sigma-Aldrich</td><td>S9390</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Fotocamera digitale</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C11440-10C</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo</td><td>Leica</td><td>RM2265</td><td></td></tr><tr><td>Illuminatore</td><td>Carl Zeiss</td><td>HXP 200C</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio stereo zoom a fluorescenza</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axio Zoom.V16</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>Sorgente luminosa in fibra ottica</td><td>Leica</td><td>KL 1500 LCD</td><td></td></tr><tr><td>monouso microtomo lama</td><td>VWR</td><td>95057-832</td><td></td></tr> singolo <tr><td>bordo</td><td>dispenser Personna</td><td>62-0330-0000</td><td></td></tr><tr><td>ZEN</td><td>Carl Zeiss</td><td>pro 2012</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop</td><td>Adobe</td><td>CS6 v13.0</td><td></td></tr><tr><td>Amira 3D Software</td><td>Visage Imaging</td><td>5.4</td><td></td></tr><tr><td>Computer</td><td>Dell T7600, 2 dischi rigidi SAS da 900 GB e 64 GB di memoria</td><td></td><td></td>DDR3 RDIMM</tr><tr><td>Agitatori a piattaforma oscillante</td><td>VWR</td><td>40000-304</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore con piastra riscaldante standard</td><td>VWR</td><td>12365-382</td><td></td></tr><tr><td>Bilancia analitica</td><td>Mettler Toledo</td><td>AB54-S</td><td></td></tr></tbody></table>

rapida acquisizione di immagini 3d utilizzando ad alta risoluzione episcopica microscopia

Rapid Acquisition of 3D Images Using High-resolution Episcopic Microscopy

La tecnologia di microscopia episcopica ad alta risoluzione (HREM) consente l'acquisizione rapida di dati morfometrici digitali volumetrici e tridimensionali (3D) ad alta risoluzione. Qui, descriviamo il protocollo dettagliato per visualizzare l'intero embrione di topo. Il protocollo è composto da quattro sezioni principali: preparazione del campione, inclusione, acquisizione di immagini e, infine, visualizzazione 3D. La tecnologia richiede che i campioni siano colorati con un colorante fluorescente, che può essere problematico per campioni grandi o densi. Per superare questa limitazione, abbiamo migliorato il protocollo esistente per migliorare la penetrazione tissutale del colorante pretrattando il campione con una soluzione contenente urea e dodecil solfato di sodio. Il protocollo utilizza solo apparecchiature di laboratorio e reagenti di routine per un facile adattamento in ambienti di laboratorio standard. Dimostriamo che le immagini 3D ad alta risoluzione risultanti riassumono fedelmente le caratteristiche morfologiche dettagliate degli organi interni degli embrioni di topo, consentendo così analisi morfometriche. Insieme, presentiamo un protocollo dettagliato e migliorato utilizzando apparecchiature di laboratorio standard per acquisire immagini 3D ad alta risoluzione di campioni di piccole e grandi dimensioni.

Abbiamo riportato le immagini HREM di alta qualità di embrioni di topo tra E9.5 e E13.5 8. La qualità dell&#39;immagine degli embrioni fine scena, tuttavia, è notevolmente compromessa a causa della penetrazione tissutale limitata del eosina colorante fluorescente. Per aumentare l&#39;efficienza di colorazione, abbiamo testato diversi metodi di pretrattamento che sono compatibili all&#39;imaging fluorescente 11. In particolare, gli embrioni di topo E15.5 sono stati t...

Descriviamo un protocollo dettagliato utilizzando la microscopia episcopica ad alta risoluzione per acquisire immagini tridimensionali (3D) di embrioni di topo. Questo protocollo migliorato utilizza un metodo di preparazione dei tessuti modificato per migliorare la penetrazione del colorante fluorescente, consentendo così l'analisi morfometrica di campioni sia di piccole che di grandi dimensioni.

Rapida acquisizione di immagini 3D utilizzando ad alta risoluzione Episcopica Microscopia

High-resolution episcopic microscopic (HREM) technology enables rapid acquisition of high-resolution digital volumetric and three-dimensional (3D) ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è acquisire rapidamente immagini digitali tridimensionali ad alta risoluzione di campioni biologici utilizzando apparecchiature di laboratorio standard. Questo metodo può rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia dello sviluppo attraverso la visualizzazione e lo studio della dinamica di complesse caratteristiche morfologiche. I principali vantaggi di questa tecnica sono l'utilizzo di attrezzature di laboratorio comuni e la necessità di un'esperienza pregressa minima.La procedura sarà dimostrata da Jungang Huang, uno studente laureato del mio laboratorio. Dopo la dissezione e la fissazione dell'embrione come descritto nel protocollo, sostituire il fissativo con la soluzione di chiarificazione e ruotare delicatamente il campione su un agitatore a temperatura ambiente per una o due settimane. Al termine dell'incubazione, trasferire il campione in formalina al 10% e lasciarlo sull'agitatore per altri due giorni.Nel terzo giorno, lavare il campione in PBS con tre lavaggi di cinque minuti ciascuno. Successivamente, disidratare i campioni in una serie ascendente di etanolo a temperatura ambiente, su un agitatore delicato per due ore per ogni concentrazione. Dopo la disidratazione con etanolo al 100%, trasferire il campione nella soluzione di colorazione per un'ora, proteggendo dalla luce.Quindi, sostituire la soluzione con una soluzione di colorazione fresca per l'etichettatura del campione durante la notte. La mattina successiva, immergere il campione in una miscela in rapporto uno a uno di volume a volume di soluzioni di infiltrazione e di colorazione appena preparate, per almeno tre ore su un agitatore a quattro gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, trasferire l'embrione nella soluzione di infiltrazione per un'ulteriore incubazione di tre ore con agitazione.Sostituire quindi il soprannatante con una soluzione di infiltrazione fresca per altri tre giorni di agitazione a quattro gradi Celsius. Nel quarto giorno, orientare l'embrione in uno stampo per inclusione e posizionare lo stampo sul ghiaccio. Mescolare la soluzione B con la soluzione di infiltrazione e quindi immergere delicatamente lo stampo in una soluzione di inclusione fredda a quattro gradi Celsius.Dopo circa tre ore, utilizzare una punta per verificare che la soluzione si sia solidificata, quindi spingere il campione fuori dallo stampo. Rimuovere ogni eccesso di materiale di inclusione, quindi riorientare il blocco del campione in un nuovo stampo in orientamento trasversale. Successivamente, posizionare l'intero apparato su ghiaccio all'interno di una cappa aspirante.Aggiungere delicatamente la soluzione di inclusione nel nuovo stampo fino a quando lo stampo non è completamente immerso. Successivamente, posizionare un portablocco sopra lo stampo. Dopo tre o quattro ore, rimuovere con cura lo stampo di inclusione e posizionare il blocco sotto un microscopio stereoscopico con illuminazione obliqua per determinare la posizione del campione all'interno del blocco.Sulla superficie del blocco, tracciare linee della griglia intorno al campione e utilizzarle come guida per tagliare l'eccesso di materiale di inclusione. Per acquisire un'immagine del campione, fissare innanzitutto il blocco a un microtomo ed eseguire un taglio fresco della superficie del campione. Quindi montare un microscopio stereoscopico a zoom in posizione orizzontale rivolto verso la superficie del blocco del campione, e accendere il microscopio e il computer collegato.Successivamente, avviare il software di acquisizione delle immagini e utilizzare la modalità di visualizzazione in tempo reale per mettere a fuoco l'obiettivo sulla superficie del blocco. Allineare il microscopio e il microtomo secondo necessità, in modo che la superficie del blocco sia al centro del mirino. Uno dei passaggi più critici di questa procedura consiste nell'acquisire le immagini nella posizione fissa di riposo del microtomo.Regolare lo zoom per assicurarsi che l'intera superficie del blocco sia all'interno del mirino. Quindi selezionare il filtro per la proteina verde fluorescente. Procedere con il taglio preliminare del blocco finché non appare il tessuto del campione, e rifocalizzare l'immagine secondo necessità.Dopo aver misurato e impostato manualmente il tempo di esposizione, acquisire e salvare le immagini della superficie del blocco dopo ogni taglio fresco, e registrare i parametri importanti di acquisizione delle immagini. Al termine della sessione di acquisizione, esportare e convertire tutti i file delle immagini in formato JPEG, e utilizzare un software di elaborazione delle immagini appropriato per invertire tutte le immagini originali, regolando la luminosità e il contrasto delle immagini secondo necessità. Caricare tutte le immagini elaborate su un software di visualizzazione 3D, seguendo le istruzioni.Allineare tutte le immagini utilizzando la modalità automatica e mostrare i risultati in 3D e 2D. In questa immagine rappresentativa di una vista superficiale in preparazione whole-mount di un embrione di topo al giorno embrionale 15,5, preparato e acquisito come appena dimostrato. È possibile osservare le caratteristiche morfologiche dettagliate della pelle, inclusi i cuscinetti dei vibrisse e i follicoli piliferi in via di sviluppo.È importante notare che la risoluzione della vista in sezione virtuale di un campione di giorno embrionale 15,5 ottenuta con questo metodo è simile a quella di una sezione istologica standard. Una volta acquisita padronanza dell'intero procedimento, dopo il pretrattamento con la soluzione trasparentizzante può essere completato in una settimana, se eseguito correttamente. Durante l'esecuzione di questo procedimento, è fondamentale ricordare di proteggere la soluzione di colorazione dalla luce a quattro gradi durante le fasi di infiltrazione e inclusione.Seguendo questa procedura, altri metodi, come la colorazione su scala, possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande riguardo ai modelli specifici di distribuzione dei tipi cellulari. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare l'equipaggiamento di laboratorio per acquisire immagini tridimensionali ad alta risoluzione di campioni biologici per la loro analisi morfometrica. Non dimenticare che lavorare con soluzioni di fissazione, colorazione e infiltrazione può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come operare sotto cappa chimica e indossare guanti devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

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Biologia dello sviluppo

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L'autofagia è un processo onnipresente che permette alle cellule di degradare e riciclare le proteine ​​e organelli. Applichiamo la microscopia a fluorescenza avanzata per visualizzare e quantificare il piccolo, ma, cambiamenti fisici essenziali connessi con l'induzione di autofagia, tra cui la formazione e la distribuzione di autophagosomes e lisosomi, e la loro fusione in autolysosomes.

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Le informazioni spazio-temporali sulle proteine dinamiche all'interno delle cellule vive sono fondamentali per comprendere la biologia. Un tipo di microscopia a super-risoluzione chiamata microscopia ad illuminazione strutturata in 3D veloce (f3D-SIM) rivela informazioni uniche sull'anello Z citocinetico nei batteri: sia il suo aspetto simile a una perlina che la rapida dinamica di FtsZ all'interno dell'anello.

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