Rapida acquisizione di immagini 3D utilizzando ad alta risoluzione Episcopica Microscopia
21 novembre 2016
Descriviamo un protocollo dettagliato utilizzando la microscopia episcopica ad alta risoluzione per acquisire immagini tridimensionali (3D) di embrioni di topo. Questo protocollo migliorato utilizza un metodo di preparazione dei tessuti modificato per migliorare la penetrazione del colorante fluorescente, consentendo così l'analisi morfometrica di campioni sia di piccole che di grandi dimensioni.
L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di acquisire rapidamente immagini digitali 3D ad alta risoluzione di campioni biologici utilizzando apparecchiature di laboratorio standard. Questo metodo può rispondere a domande chiave nel campo della biologia dello sviluppo attraverso la visualizzazione e la dinamica di caratteristiche morfologiche complesse. I principali vantaggi di questa tecnica sono che utilizza attrezzature di laboratorio standard e richiede un'esperienza preliminare minima.
A dimostrare la procedura sarà Jungang Huang, uno studente laureato del mio laboratorio. Dopo la dissezione e la fissazione dell'embrione come descritto nel protocollo di testo, sostituire il fissativo con una soluzione chiarificante e ruotare delicatamente il campione su un bilanciere a temperatura ambiente per una o due settimane. Al termine dell'incubazione, trasferire il campione al 10% di formalina e lasciarlo sul bilanciere per altri due giorni.
Il terzo giorno, lavare il campione in PBS per tre lavaggi di cinque minuti. Quindi disidratare i campioni in una serie ascendente di etanolo a temperatura ambiente, su un bilanciere delicato per due ore per ogni concentrazione. Dopo la disidratazione con etanolo al 100%, trasferire il campione in una soluzione colorante per un'ora, al riparo dalla luce.
Quindi, sostituire la soluzione con una soluzione colorante fresca per l'etichettatura notturna del campione. La mattina successiva, immergere il campione in una miscela da volume a volume di soluzioni di infiltrazione e coloranti appena preparate per almeno tre ore su un bilanciere a quattro gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, trasferire l'embrione in soluzione di infiltrazione per un'altra incubazione a dondolo di tre ore.
Quindi sostituire il surnatante con una soluzione di infiltrazione fresca per altri tre giorni di oscillazione a quattro gradi Celsius. Il quarto giorno, orientare l'embrione in uno stampo da inclusione e posizionare lo stampo sul ghiaccio. Mescolare la soluzione B con la soluzione di infiltrazione e quindi immergere delicatamente lo stampo in una soluzione di inclusione fredda a quattro gradi Celsius.
Dopo circa tre ore, utilizzare una punta per confermare che la soluzione si sia solidificata e spingere il campione fuori dallo stampo. Tagliare il materiale di inclusione in eccesso, quindi riorientare il blocco del campione in un nuovo stampo con orientamento a croce. Quindi, posiziona l'intera configurazione sul ghiaccio in una cappa aspirante.
Aggiungere delicatamente la soluzione di inclusione al nuovo stampo fino a quando lo stampo non è sommerso. Quindi, posizionare un portablocchi sopra lo stampo. Dopo tre o quattro ore, staccare lo stampo da inclusione e posizionare il blocco sotto uno stereomicroscopio con illuminazione obliqua per determinare la posizione del campione all'interno del blocco.
Sulla faccia del blocco, segnare le linee della griglia attorno al campione e utilizzare le linee come guide per tagliare il materiale di inclusione in eccesso. Per visualizzare il campione, prima bloccare il blocco su un microtomo e ottenere un nuovo taglio superficiale del campione. Quindi montare uno stereomicroscopio zoom orizzontalmente rivolto verso la faccia del blocco del campione e accendere il microscopio e il computer in dotazione.
Quindi, avviare il software di acquisizione delle immagini e utilizzare la modalità di visualizzazione in tempo reale nel software di imaging per mettere a fuoco l'ottica sulla faccia del blocco. Allineare il microscopio e il microtomo secondo necessità, in modo che la faccia del blocco si trovi al centro del mirino. Uno dei passaggi più critici di questa procedura è l'acquisizione di immagini nella posizione iniziale fissa del microtomo.
Regolare lo zoom per assicurarsi che l'intera faccia del blocco si trovi all'interno del mirino. Quindi seleziona il filtro proteico fluorescente verde. Procedere con il pre-taglio del blocco fino a quando non appare il tessuto del campione e rimettere a fuoco l'immagine secondo necessità.
Dopo aver misurato e impostato manualmente il tempo di esposizione, acquisire e salvare le immagini della faccia del blocco dopo ogni nuovo taglio e registrare i parametri di acquisizione delle immagini importanti. Al termine della sessione di imaging, esportare e convertire tutti i file di immagine in formato JPEG e utilizzare il software di elaborazione delle immagini appropriato per invertire tutte le immagini originali, regolando la luminosità e il contrasto delle immagini secondo necessità. Carica tutte le immagini elaborate su un software di visualizzazione 3D, seguendo le istruzioni.
Allinea tutte le immagini utilizzando la modalità automatica e mostra i risultati 3D e 2D. In questa immagine rappresentativa di una vista dell'intera superficie di un embrione embrionale al giorno 15,5 di topo preparato e ripreso come appena dimostrato. Si possono osservare le caratteristiche morfologiche dettagliate della pelle, compresi i cuscinetti dei baffi e i follicoli piliferi in via di sviluppo.
È importante sottolineare che la risoluzione della vista della sezione virtuale di un campione embrionale del giorno 15,5 ripreso con questo metodo è simile a una sezione istologica standard. Una volta padroneggiata, l'intera procedura dopo il pretrattamento con la soluzione di chiarificazione può essere completata in una settimana, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere la soluzione colorante protetta dalla luce a quattro gradi durante la fase di infiltrazione e inclusione.
Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la colorazione su scala, per rispondere a ulteriori domande sui modelli di distribuzione specifici dei tipi di cellule. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare le apparecchiature di laboratorio per acquisire immagini 3D ad alta risoluzione di campioni biologici per la loro analisi morfometrica. Non dimenticare che lavorare con una soluzione di fissaggio, colorazione e infiltrazione può essere estremamente pericoloso e che è necessario prendere sempre precauzioni come operare in una cappa aspirante e indossare guanti durante l'esecuzione di questa procedura.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per acquisire immagini tridimensionali ad alta risoluzione di embrioni di topo mediante microscopia episcopica. La tecnica migliora la penetrazione del colorante per un'analisi morfometrica dettagliata dei campioni.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia dello sviluppo
- Tecniche di imaging
- Morfologia embrionale
Sfondo
- Le immagini ad alta risoluzione sono fondamentali per lo studio di strutture biologiche complesse.
- È possibile utilizzare apparecchiature di laboratorio standard per questa tecnica di imaging.
- È richiesta un'esperienza minima pregressa per eseguire il protocollo.
- Questo metodo consente la visualizzazione di caratteristiche morfologiche intricate.
Scopo dello studio
- Acquisire rapidamente immagini tridimensionali dettagliate di campioni biologici.
- Facilitare l'analisi morfometrica in biologia dello sviluppo.
- Migliorare la visualizzazione delle strutture embrionali.
Metodi Utilizzati
- Dissezione ed fissazione dell'embrione, seguite da un trattamento con soluzione trasparentizzante.
- Procedimenti di colorazione e infiltrazione per migliorare la qualità dell'immagine.
- Acquisizione delle immagini mediante microscopio stereoscopico con zoom e microtomo.
- Elaborazione delle immagini e software di visualizzazione 3D per l'analisi.
Risultati principali
- Acquisizione con successo di immagini ad alta risoluzione di embrioni di topo.
- Visualizzazione dettagliata di caratteristiche della pelle come i cuscinetti dei vibrisse e i follicoli piliferi.
- Risoluzione paragonabile a quella delle sezioni istologiche standard.
- La procedura può essere completata in una settimana con un'esecuzione corretta.
Conclusioni
- Questo protocollo fornisce un metodo affidabile per l'acquisizione di immagini tridimensionali di campioni biologici.
- Consente un'analisi morfometrica dettagliata dello sviluppo embrionale.
- Le precauzioni di sicurezza sono essenziali durante la manipolazione di materiali pericolosi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'imaging 3D ad alta risoluzione di campioni biologici supporta la validazione precoce delle target grazie alla possibilità di effettuare fenotipizzazioni morfologiche dettagliate in modelli preclinici. Questa capacità aumenta la fiducia predittiva nella ricerca in biologia dello sviluppo e facilita la riduzione del rischio meccanicistica delle ipotesi terapeutiche. La dipendenza del metodo da attrezzature di laboratorio standard ne promuove l'accessibilità e la scalabilità all'interno dei flussi di scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Prima Fase di Scoperta e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante la visualizzazione ad alta risoluzione di complesse caratteristiche morfologiche in modelli embrionali.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico fornendo dati morfometrici quantitativi in 3D per la valutazione funzionale delle target.
- Valore predittivo: Facilita la selezione del portafoglio progettuale fornendo output di imaging riproducibili che chiariscono le relazioni struttura-funzione.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per analisi successive generando set di dati immagine 3D standardizzati e ad alta fedeltà.
- Valore operativo: Migliora la prontezza dei saggi grazie a protocolli riproducibili di chiarificazione, colorazione e inclusione dei tessuti, compatibili con apparecchiature di laboratorio comuni.
- Scalabilità: Consente il riutilizzo della piattaforma su campioni di diverse dimensioni grazie a una migliore penetrazione dei coloranti ottenuta con un pretrattamento a base di urea e SDS.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Supporta l'analisi di sistemi rilevanti per le malattie riproducendo fedelmente le caratteristiche morfologiche dettagliate degli organi interni.
- Allineamento Preclinico: Permette decisioni di avanzamento corrette per il rischio attraverso l'analisi morfometrica che collega la scoperta alla validazione preclinica.
- De-risking Meccanicistico: Migliora l'affidabilità predittiva consentendo la visualizzazione di cambiamenti fenotipici cruciali per la validazione del bersaglio.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla biologia iniziale all'identificazione del composto attivo, fornendo letture quantitative di tipo morfologico che guidano la selezione e la validazione del bersaglio.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante la visualizzazione tridimensionale della dinamica strutturale degli embrioni.
- Screening: Fornisce campioni pronti per i saggi con output di imaging standardizzati, adatti alla valutazione degli effetti dei composti.
- Analisi: Permette misurazioni morfometriche e confronti statistici tra diverse condizioni attraverso dati volumetrici digitali.
- Ricerca traslazionale: Si collega al lavoro preclinico fornendo dati strutturali rilevanti per le malattie, che supportano l'allineamento dei biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come capacità di imaging riutilizzabile grazie alla dipendenza da sistemi di microtomo e microscopio stereoscopico ampiamente disponibili.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione dell'obiettivo riducendo l'ambiguità meccanicistica mediante una fenotipizzazione 3D dettagliata.
- Valore operativo: Favorisce la standardizzazione e la riproducibilità attraverso un protocollo semplificato che utilizza reagenti ed attrezzature di routine.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione del progetto consentendo un rilevamento precoce di fenotipi morfologici che informano sul rischio biologico.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sul rischio grazie a dati di imaging quantificabili che aumentano la fiducia nell'identificazione dei candidati principali.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in istologia, microscopia a fluorescenza ed elaborazione di immagini 3D.
- È subordinato all'accesso a un microtomo, a un microscopio stereoscopico con zoom e a reagenti istologici standard.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per i tempi di colorazione, chiarificazione e inclusione, al fine di ottenere risultati riproducibili.
- Comporta considerazioni di adattamento legate a dimensioni e densità variabili del campione, affrontate mediante un pretrattamento con urea-SDS.
- Comprende limitazioni pratiche, come la sensibilità alla luce delle soluzioni di colorazione, che richiedono protezione durante l'infiltrazione e l'inclusione.
