Rapida acquisizione di immagini 3D utilizzando ad alta risoluzione Episcopica Microscopia

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di acquisire rapidamente immagini digitali 3D ad alta risoluzione di campioni biologici utilizzando apparecchiature di laboratorio standard. Questo metodo può rispondere a domande chiave nel campo della biologia dello sviluppo attraverso la visualizzazione e la dinamica di caratteristiche morfologiche complesse. I principali vantaggi di questa tecnica sono che utilizza attrezzature di laboratorio standard e richiede un'esperienza preliminare minima.

A dimostrare la procedura sarà Jungang Huang, uno studente laureato del mio laboratorio. Dopo la dissezione e la fissazione dell'embrione come descritto nel protocollo di testo, sostituire il fissativo con una soluzione chiarificante e ruotare delicatamente il campione su un bilanciere a temperatura ambiente per una o due settimane. Al termine dell'incubazione, trasferire il campione al 10% di formalina e lasciarlo sul bilanciere per altri due giorni.

Il terzo giorno, lavare il campione in PBS per tre lavaggi di cinque minuti. Quindi disidratare i campioni in una serie ascendente di etanolo a temperatura ambiente, su un bilanciere delicato per due ore per ogni concentrazione. Dopo la disidratazione con etanolo al 100%, trasferire il campione in una soluzione colorante per un'ora, al riparo dalla luce.

Quindi, sostituire la soluzione con una soluzione colorante fresca per l'etichettatura notturna del campione. La mattina successiva, immergere il campione in una miscela da volume a volume di soluzioni di infiltrazione e coloranti appena preparate per almeno tre ore su un bilanciere a quattro gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, trasferire l'embrione in soluzione di infiltrazione per un'altra incubazione a dondolo di tre ore.

Quindi sostituire il surnatante con una soluzione di infiltrazione fresca per altri tre giorni di oscillazione a quattro gradi Celsius. Il quarto giorno, orientare l'embrione in uno stampo da inclusione e posizionare lo stampo sul ghiaccio. Mescolare la soluzione B con la soluzione di infiltrazione e quindi immergere delicatamente lo stampo in una soluzione di inclusione fredda a quattro gradi Celsius.

Dopo circa tre ore, utilizzare una punta per confermare che la soluzione si sia solidificata e spingere il campione fuori dallo stampo. Tagliare il materiale di inclusione in eccesso, quindi riorientare il blocco del campione in un nuovo stampo con orientamento a croce. Quindi, posiziona l'intera configurazione sul ghiaccio in una cappa aspirante.

Aggiungere delicatamente la soluzione di inclusione al nuovo stampo fino a quando lo stampo non è sommerso. Quindi, posizionare un portablocchi sopra lo stampo. Dopo tre o quattro ore, staccare lo stampo da inclusione e posizionare il blocco sotto uno stereomicroscopio con illuminazione obliqua per determinare la posizione del campione all'interno del blocco.

Sulla faccia del blocco, segnare le linee della griglia attorno al campione e utilizzare le linee come guide per tagliare il materiale di inclusione in eccesso. Per visualizzare il campione, prima bloccare il blocco su un microtomo e ottenere un nuovo taglio superficiale del campione. Quindi montare uno stereomicroscopio zoom orizzontalmente rivolto verso la faccia del blocco del campione e accendere il microscopio e il computer in dotazione.

Quindi, avviare il software di acquisizione delle immagini e utilizzare la modalità di visualizzazione in tempo reale nel software di imaging per mettere a fuoco l'ottica sulla faccia del blocco. Allineare il microscopio e il microtomo secondo necessità, in modo che la faccia del blocco si trovi al centro del mirino. Uno dei passaggi più critici di questa procedura è l'acquisizione di immagini nella posizione iniziale fissa del microtomo.

Regolare lo zoom per assicurarsi che l'intera faccia del blocco si trovi all'interno del mirino. Quindi seleziona il filtro proteico fluorescente verde. Procedere con il pre-taglio del blocco fino a quando non appare il tessuto del campione e rimettere a fuoco l'immagine secondo necessità.

Dopo aver misurato e impostato manualmente il tempo di esposizione, acquisire e salvare le immagini della faccia del blocco dopo ogni nuovo taglio e registrare i parametri di acquisizione delle immagini importanti. Al termine della sessione di imaging, esportare e convertire tutti i file di immagine in formato JPEG e utilizzare il software di elaborazione delle immagini appropriato per invertire tutte le immagini originali, regolando la luminosità e il contrasto delle immagini secondo necessità. Carica tutte le immagini elaborate su un software di visualizzazione 3D, seguendo le istruzioni.

Allinea tutte le immagini utilizzando la modalità automatica e mostra i risultati 3D e 2D. In questa immagine rappresentativa di una vista dell'intera superficie di un embrione embrionale al giorno 15,5 di topo preparato e ripreso come appena dimostrato. Si possono osservare le caratteristiche morfologiche dettagliate della pelle, compresi i cuscinetti dei baffi e i follicoli piliferi in via di sviluppo.

È importante sottolineare che la risoluzione della vista della sezione virtuale di un campione embrionale del giorno 15,5 ripreso con questo metodo è simile a una sezione istologica standard. Una volta padroneggiata, l'intera procedura dopo il pretrattamento con la soluzione di chiarificazione può essere completata in una settimana, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere la soluzione colorante protetta dalla luce a quattro gradi durante la fase di infiltrazione e inclusione.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la colorazione su scala, per rispondere a ulteriori domande sui modelli di distribuzione specifici dei tipi di cellule. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare le apparecchiature di laboratorio per acquisire immagini 3D ad alta risoluzione di campioni biologici per la loro analisi morfometrica. Non dimenticare che lavorare con una soluzione di fissaggio, colorazione e infiltrazione può essere estremamente pericoloso e che è necessario prendere sempre precauzioni come operare in una cappa aspirante e indossare guanti durante l'esecuzione di questa procedura.