Imaging multimodale gerarchica delle sezioni di serie per l'individuazione di specifici obiettivi cellulari all'interno di grandi volumi

L'obiettivo generale di questo flusso di lavoro è identificare determinati target per l'imaging ultrastrutturale all'interno di un tessuto utilizzando la microscopia ottica seguita dall'imaging 3D in un SEM ad altissima risoluzione. Il flusso di lavoro di imaging qui introdotto può aiutare a rispondere a domande chiave sull'ultrastruttura cellulare o tissutale in una serie di campi, come la biologia cellulare, la biologia dello sviluppo, le neuroscienze o persino la patologia. Il vantaggio principale della tecnica, che in realtà si basa sulla tomografia array, è che il suddivisione del tessuto in array di sezioni seriali facilita l'identificazione delle strutture target, anche quando inizialmente sono sepolte all'interno del volume del campione originale.

La tomografia array è stata originariamente introdotta in un contesto di neuroscienze, ma può anche essere applicata a un'ampia gamma di altri sistemi, tra cui batteri, piante, animali e persino campioni di pazienti in un contesto patologico. Le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché raccogliere molte sezioni seriali è molto difficile. Lavorare senza supporto aggiuntivo può causare la perdita di sezioni o la disorganizzazione dei nastri.

Utilizzando un minuscolo pennello formato da alcuni peli fissati a uno stuzzicadenti, rivestire accuratamente i lati anteriore e posteriore di un blocco pre-tagliato con una miscela adesiva. Eseguire questo passaggio rapidamente perché il solvente di questa miscela evapora in pochi secondi. Mentre i campioni si asciugano, taglia i pezzi di wafer di silicone a una dimensione che si adatti alla barca del coltello e contrassegnali con un pennarello a diamante.

Quindi, pulire manualmente il wafer di silicone con isopropanolo e un panno privo di lanugine. Fissare il substrato a un'estremità della piastra di supporto utilizzando un adesivo rimovibile. Una volta indurito, il plasma attiva il substrato utilizzando la scarica a bagliore con l'aria per ottenere una superficie idrofila.

Con il supporto montato più vicino al bordo del coltello, inserire il supporto nel morsetto del supporto del supporto. Quindi, inserire un coltello diamantato jumbo nel portacoltelli e impostare l'angolo di spoglia su zero gradi. Quindi, riempi la barca a coltello con acqua distillata.

Avvicinati al coltello in modo che si trovi a uno o due millimetri dal campione. Quindi, immergere il substrato nell'acqua utilizzando le viti da uno a tre del supporto del substrato. Verificare che la linea di galleggiamento si trovi nel terzo superiore del substrato.

Poiché è difficile vedere l'altezza da terra quando si utilizza un wafer di silicone, abbassare il substrato finché non si sente toccare il pavimento. Quindi, sollevare leggermente il substrato. Assicurarsi che né il substrato né il supporto tocchino la barca del coltello durante il taglio.

Quindi, usa una siringa o una pipetta per regolare il livello dell'acqua nella barca. Mentre guardi attraverso il binocolo, aggiungi o rimuovi l'acqua fino a quando l'intera area della superficie dell'acqua mostra un riflesso omogeneo dell'illuminazione della luce superiore dell'ultramicrotomo. Una volta completata la configurazione, iniziare a sezionare il campione.

Quando sono state tagliate più sezioni, interrompere il processo di sezionamento e rilasciare il nastro dal bordo del coltello accarezzando delicatamente il bordo del coltello con una ciglia o un pelo di gatto molto morbido. Manipolare il nastro verso il substrato e spingere delicatamente la prima sezione del nastro per fissarlo alla parte asciutta del substrato. Continuare a sezionare il campione e attaccare i nastri al substrato.

Inizia da un lato del substrato e spostati gradualmente verso l'altro con ogni nuovo nastro. Quando il substrato è completamente ricoperto di nastri, sollevare delicatamente il substrato dalla barca del coltello utilizzando le viti del micromanipolatore del supporto del substrato. Lasciare asciugare la matrice di nastri e poi conservarla in un ambiente privo di polvere.

Dopo l'asciugatura, rimuovere il supporto montato sull'adesivo il prima possibile dal supporto. Quindi, colorare il campione per la microscopia ottica come descritto nel protocollo di testo allegato ed eseguire l'imaging. Quindi, colorare il campione per la microscopia elettronica e montarlo su tronchetti di alluminio con un cuscinetto di carbonio appiccicoso.

Ora immaginate questi array nel microscopio elettronico a scansione a emissione di campo. Per evitare la carica, utilizzare energie degli elettroni primari di tre kV o inferiori e una corrente del fascio compresa tra 50 e 800 picoampere. Quando si utilizzano vetrini di copertura in vetro rivestiti ITO, collegare la superficie conduttiva al supporto del microscopio con nastro di rame e vernice argentata.

Il primo passo nella cascata di imaging gerarchico consiste nel generare una panoramica dell'array in modo tale che le singole sezioni possano essere riconosciute. Per prima cosa definisci i quattro angoli del tuo array rappresentando graficamente un'immagine di ogni angolo a basso ingrandimento, circa 100x, quindi crea un ROI che racchiuda l'intero array. Assegna un protocollo di imaging a questo ROI con i seguenti parametri.

Utilizza il rivelatore di elettroni secondario per l'imaging ad alta velocità utilizzando un breve tempo di permanenza di circa 0,2 microsecondi. Scegli una dimensione in pixel dell'immagine grande e una dimensione del riquadro di 2000 x 2000 pixel. Il risultato è un'immagine molto rumorosa, ma anche qui il tessuto all'interno della sezione è visibile.

Quindi, generare un set di sezioni creando un'area di interesse, delineando solo il tessuto nella prima sezione. Clonalo in tutte le sezioni successive utilizzando lo strumento timbro. Ruotare le regioni di interesse quando necessario per adattarsi ai nastri piegati.

Assegnare un protocollo alla sezione che meglio mostra la sottostruttura del tessuto. Qui, è stata utilizzata una dimensione intermedia dei pixel di 60 nanometri, una dimensione delle tessere di 12000 per 12000 pixel e un tempo di permanenza di 3,2 microsecondi. A causa della scarsa qualità, è stata creata una seconda sezione che delinea alcune celle selezionate utilizzando una dimensione dei pixel più piccola e un rivelatore più sensibile.

Ora è possibile riconoscere molto bene le due cellule bersaglio. Creare un set di siti all'interno del set di sezioni contenente la struttura di destinazione per l'imaging SEM a risoluzione più elevata. Rendere l'area di interesse sufficientemente grande da tenere conto della precisione della fase di staging.

Controllare e regolare le posizioni dei siti. La sintonizzazione automatica è necessaria quando vengono riprodotte molte sezioni. È importante posizionare le regioni di interesse in modo che il centro non si trovi su materiale vuoto senza dettagli strutturali, ad esempio vacuoli.

Successivamente, definire le impostazioni di messa a fuoco automatica e controllare le prestazioni di imaging sulla lunghezza di un nastro su una piccola area di interesse vicina al sito di cui verrà creata l'immagine. Quindi, definire un protocollo di imaging per l'acquisizione SEM ad alta risoluzione. Per vedere gli scomparti della membrana, scegli una dimensione dei pixel dell'immagine compresa tra tre e cinque nanometri.

Selezionare un tempo di permanenza a seconda del rilevatore in modo che l'immagine non sia troppo rumorosa. Poiché la fase deve percorrere una distanza considerevole tra la registrazione di questa e questa sezione, definire i valori di messa a fuoco almeno sulla prima sezione di ciascun nastro utilizzando l'opzione di controllo del protocollo. Quindi avvia l'imaging SEM automatizzato su tutta la serie di regioni target di interesse.

Al termine, esportare i dati acquisiti come serie di immagini, preferibilmente in formato TIF. Importa serie di immagini nelle Fiji come stack virtuale. Successivamente, ritaglia la pila per un'ulteriore elaborazione tagliando l'area il più vicino possibile alla struttura di interesse.

Inoltre, regola la luminosità e il contrasto e salva la pila. Una volta ritagliato e ottimizzato, apri un nuovo TrakEM dal menu File. Fare clic con il pulsante destro del mouse nel campo dell'immagine e importare la pila in TrakEM come una sezione per livello.

Facendo clic con il pulsante destro del mouse, scegli Allinea livelli. Scegli i minimi quadrati come modalità, imposta l'intervallo dal primo all'ultimo e scegli nessuno come riferimento. Quindi, selezionate i valori di impostazione predefiniti e scegliete Rigido (Rigid) come trasformazione desiderata.

Quando la registrazione è completata e soddisfacente, salvare il set di dati allineati facendo clic con il pulsante destro del mouse e scegliendo Esporta. Crea un'immagine piatta, imposta l'intervallo dalla prima all'ultima immagine e lascia che il software mostri la pila risultante. Al termine, salva la pila in formato TIF.

Dopo la preparazione, l'array di sezioni viene visualizzato come un array costituito da diversi nastri di sezioni seriali. Questa sezione mostra una panoramica di una punta di radice di arabidopsis, colorata con ioduro di propidio. Le sezioni sequenziali di questo campione sono state allineate come descritto nel protocollo e combinate per mostrare il campione in 3D come un singolo file di filmato.

Qui si possono vedere le due cellule bersaglio che verranno successivamente riprodotte con una risoluzione nanometrica nel SEM. Dopo un'ulteriore colorazione con acetato di uranile e citrato ematico, gli array sono stati ripresi al microscopio elettronico. Questa immagine statica mostra la sezione del campione prima ripresa con una risoluzione di 20 nanometri e nel secondo ciclo di imaging, con una risoluzione di cinque nanometri.

Qui, 210 immagini sequenziali dal microscopio elettronico sono state allineate e ritagliate come descritto nel protocollo. Il video si rivolge a due sole cellule e mostra come i vacuoli all'interno delle cellule sono disposti e talvolta collegati in 3D. L'imaging gerarchico automatizzato degli array nel SEM mostrato qui può fornire una mappatura senza soluzione di continuità a diversi livelli di risoluzione, da una panoramica dell'intero array ai dettagli subcellulari.

Al massimo ingrandimento, sono riconoscibili i vacuoli, i mitocondri, il nucleo e il reticolo endoplasmatico. Una volta padroneggiato, il posizionamento dei nastri di sezione uno accanto all'altro su un substrato tipico può essere eseguito in poche ore se eseguito correttamente. Questo può fornire centinaia di sezioni su un substrato per l'imaging.

Il tempo di imaging per un numero così elevato di sezioni può variare da un microscopio all'altro, ancora di più se i tuoi strumenti di imaging preferiti hanno diversi livelli di automazione. È interessante notare che il flusso di lavoro generale può essere facilmente combinato con altre tecniche di imaging, come la colorazione istoscopica standard o anche la candoluminescenza, oppure può semplicemente essere utilizzato come strumento autonomo per l'imaging arthostrutturale di grandi volumi. Un altro aspetto di questo flusso di lavoro è la facile accessibilità.

Gli studi iniziali sono fattibili senza strumenti aggiuntivi o automazione, il che significa senza grandi investimenti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona idea del flusso di lavoro e di come l'imaging multimodale e gerarchico possa essere utilizzato per indirizzare e visualizzare strutture interessanti in un grande volume 3D a diversi livelli di risoluzione.