Name: Imaging multimodale gerarchica delle sezioni di serie per lindividuazione di specifici obiettivi cellulari allinterno di grandi volumi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Scopri l'imaging multimodale gerarchico per l'identificazione di target cellulari specifici all'interno di grandi volumi tissutali. Questo metodo combina microscopia a luce e SEM per visualizzare strutture ultrastrutturali con alta risoluzione.

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Questo lavoro è stato supportato da grant FKZ 13GW0044 dal Ministero federale per formazione e ricerca, progetto MorphiQuant-3D. Ringraziamo Carolin Bartels per il supporto tecnico.

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KIT ha ricevuto rimborsi da Boeckeler strumenti per la fornitura di un modello funzionale del proprietario del substrato. Marlene Thaler è dipendente della ZEISS microscopia GmbH, produttore di sistemi di microscopia citati in questo articolo. Inoltre, ZEISS offre alcune soluzioni come pacchetti di soluzione ZEISS Atlas per una vasta gamma di applicazioni a grande superficie, 3D imaging per strumenti SEM e FIB-SEM. Tutti gli altri autori non hanno nulla a rivelare.

Un flusso di lavoro per il targeting celle specifiche all'interno di un tessuto da multi-modale gerarchici AT è stata dimostrata: un campione di resina-incastonato è tagliata a fette in matrici di sezioni di serie, che sono collocate su un substrato conduttivo utilizzando un supporto di substrato personalizzati. Dopo etichettatura con un fluoroforo e imaging nella FLM, il volume ricostruito viene utilizzato per la selezione delle cellule bersaglio. Dopo ulteriori macchiatura turni con metalli pesanti per introdurre il contrasto, questi obiettivi sono immaginati durante cento diverse sezioni a risoluzione nanometrica in un SEM utilizzando una piattaforma software automatizzato.
Per la produzione di matrici densamente imballate con parecchi lunghi nastri, titolare di un substrato simile a quello qui descritto è necessario. Una persona abile e paziente può essere in grado di collegare diversi nastri ad un substrato di silicio, semi immerso nella barca coltello e recuperare la matrice abbassando gradualmente il livello dell'acqua fino a quando i nastri sono seduti sul substrato. Tuttavia, nella nostra esperienza, c'è una tendenza a formazione in frantumi quando il substrato è toccare qualsiasi parte della barca coltello (cfr nota in 1.3.2 nel protocollo). Inoltre, questa procedura è molto più difficile con substrati rivestiti ITO: (1) grazie alla trasparenza del vetro di ITO, è difficile vedere il bordo dell'acqua dove le estremità dei nastri devono essere allegati; e (2) perché la superficie rivestita con ITO è molto più ruvida rispetto il wafer di silicio altamente lucidato, i nastri tendono a rompersi durante il sollevamento e frammenti più piccoli, composto da alcune sezioni possono galleggiare, distruggendo così l'ordine delle sezioni.
L'intero flusso di lavoro è anche fattibile senza correlazione ai dati FLM. In questo caso, raccolta di dati nel SEM potrebbe essere necessario essere eseguita in diverse sessioni. Una ricostruzione 3D iniziale o almeno valutazione dei dati di bassa o media risoluzione può essere necessario identificare bersagli. Inoltre, macchie istologiche convenzionali per campo chiaro LM (non richiedendo FLM) possono essere applicate. Naturalmente, altre opzioni6,7,8 sono anticorpo etichettatura su matrici, come già dimostrato nel libro iniziale a18, o geneticamente codificato proteine fluorescenti (XFPs) o pre-embedding Etichettatura con conservazione della fluorescenza durante la preparazione del campione.
Una limitazione generale del metodo discusso è l'uso di sezioni di un certo spessore e il campionamento discreto risultante del volume 3D: risoluzione in Z può essere solo buono come lo spessore delle sezioni poiché il SEM raccoglie solo i dati dalla superficie sezione (d epending sull'energia primaria energia/atterraggio selezionato). Ciò significa che il volume 3D risultante ha anisotropo voxel, ad es., 5 x 5 x 100 nm3 se 100 nm sezioni e una dimensione di pixel di immagine di 5 nm sono utilizzati. Per entità molto piccole in un intervallo di grandezza inferiore a 1 µm, questo potrebbe non essere sufficiente per una vera Descrizione ultrastrutturale. Una limitazione più tecnica è l'accuratezza della fase utilizzata nel SEM per automatizzato di imaging. Per questo motivo, è necessario scegliere un ROI maggiore le specifiche di accuratezza fase per garantire che l'area di destinazione completo è ripreso.
Rispetto al SBF-SEM e FIB-SEM come metodi di formazione immagine del blocco-viso, correlativo AT ha lo svantaggio definitivo di voxel anisotropo, come descritto sopra. Con FIB-SEM, voxel isotropo di 5 x 5 x 5 nm3 può essere ottenuto quando una correzione adeguata drift è a posto.
Lacune nel volume ricostruito a causa della perdita delle sezioni durante la preparazione di matrici potrebbero anche essere una preoccupazione che non si è verificata con SBF-SEM o FIB-SEM. Con la stabilizzazione di buon nastro di colla, questo di solito è solo un problema per l'ultima sezione di un nastro: potrebbe essere danneggiato quando liberandola dal filo del rasoio usando le ciglia. Tuttavia, nella nostra esperienza, la perdita di una sezione in ogni 20 – 50 sezioni non influenza la registratura delle immagini.
D'altra parte, la possibilità di post-macchia matrici conferisce buon segnale e contrasto per imaging di SEM, anche su campioni debolmente metallizzati come l'alta pressione congelato punte delle radici mostrati qui. Di conseguenza, non è necessario di compromettere la conservazione ottimale ultrastrutturale da numerosi fissazione chimica e passaggi di metallizzazione. Inoltre, routine campioni da laboratorio di patologia con gradi intermedi di metallizzazione consegnare dati eccellente10. Tale aumento di contrasto una Post-embedding non è in generale possibile per SBF-SEM e FIB-SEM. Inoltre, poiché questi metodi sono distruttivi, vale a dire, consumando il campione durante imaging, gerarchica imaging presso siti e diverse risoluzioni o formazione immagine ripetuta nei punti successivi nel tempo è impossibile. In linea di principio, volumi illimitati, composto da grande FOVs (ad es., fino a parecchi millimetri per cervelli di topo tutta in connectomics) creato da impunture mosaici, e un numero enorme di sezioni può essere acquistato da AT, mentre in FIB-SEM, FOVs oltre 100 µm x 100 µm sono difficili da raggiungere con strumenti di routine.
Ulteriore automazione del flusso di lavoro-AT descritto sarebbe un indubbio vantaggio, poiché i metodi suddetti SBF-SEM e FIB-SEM l'esecuzione sia di sezionamento e di imaging all'interno dello strumento stesso in modo completamente automatizzato. Esiste un tipo di automazione di sezionamento: The ATUMtome12 in grado di generare e raccogliere migliaia di sezioni, ma l'uso di nastro Kapton come un substrato rende tali matrici difficili all'immagine in un FLM. Il lamelle rivestite con ITO utilizzate qui, imaging anche super-risoluzione dovrebbe essere possibile. Un obiettivo ulteriore, molto desiderabile per automazione sarebbe la registrazione degli stack dei dati FLM. D'altra parte, automazione può essere costoso e fatta eccezione per il titolare di substrato, il flusso di lavoro qui presentato si basa (in termini di hardware) solo su strumentazione generalmente disponibile in una routine EM laboratorio o core struttura, rendendo il basso livello di accesso.

Per la ricostruzione di grandi volumi di tessuto alla risoluzione ultrastrutturale un numero di differenti approcci di imaging basata su SEM è stati usati1: recensioni complete sono disponibili ad es., per SBF-SEM2, FIB-SEM3e Array Tomografia (a)4. Mentre per il secondo metodo il materiale campione è conservato come una matrice di sezioni di serie su un substrato, SBF-SEM e FIB-SEM sono metodi distruttivi, lavorando sul blocco campione e consumarlo durante la formazione immagine. A causa della ricarica della resina nel SEM, dipendono anche fortemente metallizzato campione blocchi5.
D'altra parte, identificando determinate cellule o strutture di interesse all'interno di un campione di tessuto possa trarre profitto in particolare da correlativo luce e microscopia elettronica (CLEM)6,7,8. Utilizzando FLM per il targeting osti all'applicazione di grandi quantità di metalli pesanti, poiché ciò sarebbe spegnere il segnale di fluorescenza9. Per tali campioni solo leggermente metallizzati, AT è il metodo di scelta dato che le matrici possono facilmente essere post-macchiate con metallo pesante dopo formazione immagine LM. Inoltre, quasi ogni tipo di campione può essere utilizzato per AT, anche routine campiona il patologo tesoro petto10.
Un altro grande vantaggio di AT è il potenziale per gerarchica11 o multi-resolution imaging12: non è necessario tutto in alta risoluzione di immagine, come gli obiettivi possono essere selezionati in una modalità diversa (ad es., FLM) o in immagini a bassa risoluzione del SEM. Solo le regioni interessanti di una popolazione dei tessuti o cellule a ad alta risoluzione di imaging consente di risparmiare spazio di archiviazione di dati digitali e produce più piccoli insiemi di dati di immagine, che sono più facili da gestire. Qui, il flusso di lavoro AT è dimostrato utilizzando un campione piuttosto debolmente metallizzato: alta pressione congelato le radici delle piante (Arabidopsis thaliana) incorporato in resina idrofila.
Come le matrici sono preparate, macchiate e fotografate in entrambi FLM e SEM, e come la serie di immagini sono registrati sono spiegati. Inoltre, come la ricostruzione 3D del volume FLM può essere utilizzata per selezionare celle specifiche per formazione immagine nel SEM a risoluzione nanometrica è illustrata.

<table><tbody><tr><td>Instrumentation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>RMC</td><td>PT-PC</td><td>Alternativa: Leica UC7</td></tr><tr><td>Supporto substrato</td><td>RMC</td><td>ASH-100</td><td>Alternativa:</td></tr><tr><td>pulitore al plasma</td> costruito in casa <td>Diener</td><td>Zepto 40kHz</td><td>Alternative: Ted Pella Pelco o altro pulitore al plasma da banco Parametri di esempio per Diener Zepto con generatore a 40kHz (0-100W); 0,5 mbar, 5 sccm (aria), 10% delle prestazioni&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscopio ottico a fluorescenza a campo largo</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer.Z1</td><td>Alternative: Leica, Nikon, Olympus</td></tr><tr><td>Set di filtri a fluorescenza</td><td>Zeiss</td><td>43 HE (Cy3/DsRed)</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss Neofluar 40x</td><td>&nbsp; 0.75 NA</td></tr><tr><td>Workstation decente in grado di gestire dati</td><td></td><td></td><td></td>di immagini di dimensioni GB</tr><tr><td>FESEM</td><td>Zeiss</td><td>Ultra 55</td><td>Alternative: FEI, Jeol, Hitachi, TESCAN</td></tr><<tr><td>strong>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Sectioning</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lamette</td><td>da barba Plano</td><td>T585-V</td><td></td></tr><tr><td>Coltello diamantato per rifilatura 45 gradi</td><td>Diatome</td><td>DTB45</td><td></td></tr><tr><td>Coltello diamantato per rifilatura 90&deg;</td><td>Diatome</td><td>DTB90</td><td></td></tr><tr><td>Jumbo coltello diamantato per sezionamento</td><td>Diatomee</td><td>DUJ3530</td><td></td></tr><tr><td>wafer di silicio (pezzi)</td><td>Si-Mat</td><td>Custom Made</td><td>Doping: P/Bor, orientamento: < 100>, spessore: 525 &plusmn; 25 &micro; m, resistività: 1-30 &Omega;-cm http://si-mat.com/silicon-wafers.html</td></tr><tr><td>vetrini coprioggetti rivestiti in ITO</td><td>Balzer Tipo</td><td>Z</td><td>22 &volte; 22 &volte; 0,17 mm https://www.opticsbalzers.com/de/produkte/deckglas-fenster/corrslide.html</td></tr><tr><td>Supporto in alluminio</td> Su <td>misura</td><td></td><td>76 & volte; 26 mm</td></tr><tr><td>Pinze per wafer</td><td>Ideal-tek</td><td>34A.SA</td><td></td></tr><tr><td>Tronchetti pinze</td><td>Dumont</td><td>0103-2E1/2-PO-1</td><td>Dumoxel-H 2E 1/2</td></tr><tr><td>Diamond scriber</td><td>Plano</td><td>T5448</td><td></td></tr><tr><td>Ciglia/pelo di gatto molto morbido</td> Alternativa <td>autocostruita</td><td></td><td>: Pennello Plano</td></tr><tr><td>Autoadesivo</td><td></td> a contatto Pattex Pattex Autofatto <td></td><td></td></tr><tr><td>Pattex</td><td></td><td>Classico</td><td>(quello giallastro)</td></tr><tr><td>Fixogum</td><td>Marabu</td><td>290110001</td><td>per il fissaggio del substrato al supporto</td></tr><tr><td>Nastro adesivo</td><td>3M</td><td>851</td><td>per il fissaggio del substrato al supporto</td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td>Bernd Kraft</td><td>07029.4000</td><td></td></tr><tr><td>Xilene</td><td>Carl Roth</td><td>4436</td><td>diluente per miscela di colla</td></tr><tr><td>Rotihistol</td><td>Carl Roth</td><td>6640</td><td>alternativa, diluente a base di limonene</td></tr><tr><td><forte>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elaborazione immagini</td><td>Open source</td><td>Fiji (http://fiji.sc/#download)</td>Acquisizione <td></td></tr><tr><td>immagini</td><td>Zeiss</td><td>Atlas 5 AT (modulo per Zeiss SEM)</td><td>Alternativa per l'acquisizione automatica delle immagini: WaferMapper: https://software.rc.fas.harvard.edu/lichtman/LGN/WaferMapper.html</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Staining</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propidiumiodide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>Soluzione madre: 1,5 mM in azoturo di sodio allo 0,1</td></tr>% <tr><td>Uranilacetato</td><td>Servizi scientifici</td><td>E22400</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato di piombo (II)</td><td>Merck</td><td>107398</td><td></td></tr><tr><td>Citrato di sodio tri diidrato</td><td>Merck</td><td>106448</td><td></td></tr><tr><td>pellet di NaOH</td><td>Merck</td><td>106469</td><td></td></tr><tr><td>1M Soluzione NaOH</td><td>Bernd Kraft</td><td>01030.3000</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri in vetro</td><td>Duran</td><td>23 755 56</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Mounting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stubs Plano</td><td></td><td>G301F</td><td></td></tr><tr><td>Pastiglie in carbonio</td><td>Plano</td><td>G3347</td><td></td></tr><tr><td>Nastro di rame</td><td>Plano</td><td>G3397</td><td>biadesivo, conduttivo</td></tr><tr><td>Vernice d'argento</td><td>Plano</td><td>G3692</td><td>Acheson Elektrodag 1415M</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Solutions/mixtures</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Miscela adesiva per blocchi</td><td></td><td></td> di rivestimento <td>Adesivo a contatto Pattex/xilene come diluente, rapporto 1:3, (Alternativa allo xilene: Rotihistol)</td></tr><tr><td>Citrato</td><td></td><td></td> di piombo Reynolds <td>50 mL: Sciogliere 1,33 g di nitrato di piombo (II) in 10 mL di dH2O. Sciogliere 1,76 g di citrato trisodico diidrato in 10 ml di dH2O. Miscela entrambi e aggiungere 1 M di idrossido di sodio fino a quando la soluzione è limpida. Riempire con dH2O fino a 50 mL.</td></tr><tr>Soluzione <td></td><td></td><td>colorante con ioduro di propidio</td><td>Preparare una diluizione 1:1500 da magazzino in dH2O. Vortex per un'adeguata miscelazione.</td></tr><tr>Acetato <td></td><td></td><td>acquoso di uranile</td><td>Sciogliere il 3 % di acetato di uranile in dH2O (mescolare accuratamente).</td></tr></tbody></table>

imaging multimodale gerarchica delle sezioni di serie per l'individuazione di specifici obiettivi cellulari all'interno di grandi volumi

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Targeting per celle specifiche ultrastrutturali risoluzione all'interno di una popolazione mista delle cellule o un tessuto può essere ottenuto gerarchica imaging utilizzando una combinazione di luce e microscopia elettronica. Campioni incorporati in resina sono sezionati in matrici costituito da nastri di centinaia di sezioni ultrasottili e depositati su pezzi di wafer di silicio o vetrini coprioggetti conduttivamente rivestiti. Le matrici sono imaging a bassa risoluzione utilizzando un consumatore digitale come smartphone fotocamera microscopio ottico (LM) per una panoramica rapida grande area o un microscopio a fluorescenza campo largo (luce microscopia di fluorescenza (FLM)) dopo l'etichettatura con fluorofori. Dopo post-colorazione con metalli pesanti, le matrici sono imaging in un microscopio elettronico a scansione (SEM). Selezione del target è possibile da ricostruzioni 3D generati da FLM o da ricostruzioni 3D fatti dagli stack di immagine di SEM a risoluzione intermedia se non marcatori fluorescenti sono disponibili. Per l'analisi ultrastrutturale, target selezionati sono infine registrato nel SEM presso ad alta risoluzione (pixel immagine di pochi nanometri). È dimostrato uno strumento di gestione nastro che possa essere adattato a qualsiasi ultramicrotomo. Aiuta con la produzione di matrice e rimozione del substrato dalla barca coltello taglio. Una piattaforma software che permette l'imaging automatici di matrici nel SEM è discussa. Rispetto ad altri metodi di generazione di dati di grande volume EM, come seriale blocco-viso SEM (SBF-SEM) o fascio ionico focalizzato (FIB-SEM), SEM questo approccio ha due vantaggi principali: (1) il campione di resina-incastonato è conservato, sia pure in una versione tagliata. Può essere tinto in modi diversi e ripreso con differenti risoluzioni. (2) come le sezioni possono essere post-macchiate, non è necessario utilizzare campioni fortemente macchiato di blocco con metalli pesanti per introdurre di contrasto per imaging di SEM o blocchi di rendering del tessuto conduttivo. Ciò rende il metodo applicabile a una vasta gamma di materiali e domande biologiche. Materiali particolarmente con prefisso ad es., da banche di biopsia e laboratori di patologia, può direttamente essere incorporato e ricostruito in 3D.

Il flusso di lavoro descritto qui (Figura 1) inizia con un campione incorporato in un blocco di resina. Durante la preparazione del campione, alcuni metalli pesanti dovrebbe essere introdotto nel tessuto, ma non è necessario l'utilizzo di protocolli ottimizzati per metallizzazione piuttosto forte. Figura 1A Mostra una radice di pianta (crescione) blocco tinto convenzionalmente con 1% OsO4 e 1% acetato di uranile, mentre la radice di Arabidopsis in Figura 1B è solo debolmente metallizzato con acetato di uranile 0,5%. Il tipo di campione di quest'ultimo è più adatto per correlativi approcci come alcuni metalli pesanti tendono a placare la fluorescenza. Con un supporto dedicato di substrato (Figura 2), le matrici di parecchie centinaia di sezioni possono essere prodotte (Figura 1). Dopo l'etichettatura fluorescente, tali matrici sono fotografate in un FLM grandangolari standard (Figura 1), poi tinto con soluzioni di metalli pesanti e fotografate in un SEM a diverse risoluzioni (Figura 1E–G).
Importanti strumenti per la generazione riproducibile di matrici, particolarmente quando immissione diversi nastri da barca lama del microtomo su un substrato, sono titolare del substrato (Figura 2A, progettata in laboratorio degli autori) e un diamante di Jumbo coltello con una barca abbastanza grande da ospitare vetrini da microscopio (Figura 2B). Un menisco piatto, permettendo la buona osservazione dei nastri, è necessario e può essere realizzato dalla pulizia al plasma del substrato: una piccola goccia di acqua distillata non deve formare una struttura lente sul substrato come in Figura 2 (substrato non trattato), ma un film sottile (Figura 2D, substrato del plasma attivato). In queste condizioni, nastri attaccate alla parte secca di un vetrino coprioggetti rivestite con ITO sono facilmente visibili (Figura 2E) e può essere osservato e controllato durante l'alza-fuori del substrato dall'acqua.
Ad esempio, le matrici colorate con ioduro di propidio per etichettare le pareti cellulari della pianta erano imaged con un ampio campo standard FLM (Figura 3A). Poiché le sezioni sono solo 100 nm di spessore, anche over-macchiatura come illustrato di seguito introduce little sfocatura. Dopo la registrazione, sono state selezionate le due celle completamente racchiuse nel volume ricostruito dallo stack di immagine (Figura 3B) per imaging ad alta risoluzione in 3D (veda inoltre Supplementare film S1). A seguito di ulteriori macchiatura con acetato e piombo citrato di uranile, le matrici erano imaged in SEM. Figura 3 C Mostra una panoramica, registrata con 60 pixel di immagine nm; il quadrato scuro al centro dell'immagine indica la posizione dove sono state eseguite le funzioni di messa a fuoco automatica, e la dose aggiuntiva ha portato alla contaminazione leggera. ROIs in quelle sezioni seriali (fette 51-248 di 435 fette in totale) del caso contenente le celle di due destinazione selezionate nello stack di FLM sono state poi registrate con una dimensione di pixel di immagine nm 5 (Figura 3D; veda inoltre Supplementare film S2).
Imaging automatici gerarchica delle matrici nel SEM descritto qui è stato fatto con la soluzione di piattaforma hardware/software ZEISS Atlas 5. In primo luogo, una panoramica di tutto l'array è stata creata utilizzando il rivelatore di SE, con molto grande (1.000 nm) immagine pixel e tempo di permanenza molto basso (Figura 4A). Un ROI che delinea solo il tessuto viene posizionato sulla prima sezione e propagato a tutte le altre sezioni della matrice. Questo set di sezione è stato poi registrato con 60 pixel di immagine nm utilizzando un più lungo tempo di sosta (Figura 4B). Infine, un insieme di sito, che contiene le cellule due bersaglio più uno "strato" di che circonda le cellule per tenere conto per l'inesattezza di fase, è stato istituito con i seguenti parametri: rilevatore di ESB (energia Backscatter selettiva), immagine di nm 5 pixel, molto lungo (40 µs) abitare ( del tempo Figura 4). Zoomando a tale immagine Mostra dettaglio subcellulare (Figura 4) quali vacuoli (V), mitocondri (M), nucleo (N) e del reticolo endoplasmatico (frecce). Veda inoltre il Supplemental film S3 per lo zoom in da una panoramica di tutto l'array al dettaglio subcellulare di una cella di destinazione.
La matrice mostrata qui (200 sezioni) più un ulteriore uno dei 250 sezioni ha preso circa 8 h per produrre, una notte a macchiare per LM e un giorno registrare (manualmente) presso il FLM. Post-colorazione dura circa 1-2 h in totale, a seconda del numero di singole matrici. Per la registrazione di SEM, poche ore sono necessarie per impostare l'esecuzione di Atlas e registrazione automatizzata era 3 – 4 h per il set di sezione (dimensione dei pixel 60 nm) intermedio ad alta risoluzione (200 sezioni, 450 x 200 µm2) e circa 5 giorni per l'alta risoluzione (5 nm dimensioni in pixel) ROI contenente le celle di due destinazione (200 sezioni, 55 x 30 µm2). Si noti che a causa del basso contenuto di metallo dell'esempio mostrato qui, una velocità di scansione molto lenta dovuto essere utilizzato per raggiungere una buona rilevazione di segnale-rumore, che implicita (per il rilevatore attualmente disponibile) un tempo di sosta di 40 µs per il ROI ad alta risoluzione.
Ci sono diversi passaggi del flusso di lavoro intera incline ai trabocchetti: idealmente nastri dovrebbero essere più o meno dritto e collocato nel giusto ordine (Figura 5A). Tuttavia, sono spesso prodotti piegato (figura 5B), curve (Figura 5) o nastri anche rotti. Ciò può provocare a causa di errato taglio (leader e bordi d'uscita non esattamente paralleli) o adesivo non uniformemente applicato, ma anche da un campione asimmetrico o irregolarmente infiltrato. Particolarmente problematici sono i campioni che contengono componenti sia morbidi e molto difficile. I componenti di quest'ultimi possono essere difficili per infiltrarsi come la parete cellulare delle radici della pianta mostrato qui (Figura 5). In tal caso, pieghe (frecce) facilmente possono essere causati da compressione variabile e rilassamento durante il sezionamento. Per automatizzato di imaging nel SEM, curvi nastri non sono un grande problema, poiché il ROIs può essere ruotato per ospitare la curvatura della barra multifunzione.
Un altro passo fondamentale nel protocollo sta macchiando: lavaggio inadeguato può portare a residui sulla sezione (Figura 5E, F) e nel peggiore dei casi, coprire la zona più interessante (cerchio su una delle celle di due destinazione in Figura 5F). Inoltre, polvere (Figura 5, particelle fortemente light scattering) introdotto in barca il coltello, per esempio, con un vettore di substrato sporco, può causare seri problemi: nel FLM, la polvere può essere altamente fluorescente (cfr alcune fette in film supplementare S1) a tal punto che alcuni algoritmi di registrazione non funzionano. Tuttavia, la funzione di "allineare" in TrakEM17 in grado di gestire tali pile come dimostrato nel Supplementare film S1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig1.jpg"> Figura 1: flusso di lavoro per l'imaging gerarchica correlativo. A partire da un campione incorporato in un blocco di resina (A, fortemente metallizzato campione), il campione è il primo profilato (B, campione debolmente metallizzato) e poi matrici composto da diversi nastri delle sezioni di serie (C), qui collocato su un Rivestite con ITO vetrino coprioggetti, sono prodotte con un ultramicrotomo. Dopo colorazione con un colorante fluorescente, pile di immagini vengono registrate in un grande campo FLM (D). Dopo ulteriore colorazione giri con metalli pesanti sali, gli stack sono imaging in un SEM (E–G) a diverse risoluzioni (dimensioni di pixel di immagine). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig2.jpg"> Figura 2: strumenti per la preparazione di matrici. Titolare del substrato assemblati da micromanipolatori con sette assi di movimento collegato a un ultramicrotomo standard (A): le viti, evidenziate con i cerchi, sono per il movimento orizzontale (2) e verticale (1) e per l'inclinazione (3) del vettore substrato . Il coltello di diamante jumbo con una barca oversize per ospitare grandi substrati (freccia), qui con un pezzo di wafer di silicio attivato al plasma montato su un supporto di alluminio dimensioni diapositiva (B). 20 gocce di µ l di acqua distillata collocato su un substrato di wafer di silicio non trattati (C) o su un substrato di plasma-attivato (D). Quattro nastri galleggianti sulla barca di coltello, collegato a un vetrino coprioggetti ITO-rivestito dalle loro estremità inferiore. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig3.jpg"> Figura 3: correlazione dei dati LM con i dati SEM. Panoramiche (A, C) e cellule bersaglio (B, D) registrarono con FLM (A, B) e SEM (C, D). (B) è uno zoom di software, e i dati originali sono stati registrati con una lente dell'obiettivo X 40 su un chip di 1.388 x 1.040 pixel fotocamera, mentre (C) viene registrato con 60 nm immagine dimensioni in pixel e (D) con 5 dimensioni di immagine pixel nm, che illustrano il vero aumento della risoluzione nel SEM. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig4.jpg"> Figura 4: gerarchico di formazione immagine nel SEM utilizzando ZEISS Atlas 5 at Panoramica di una matrice registrata con 1.000 pixel di immagine nm utilizzando il rivelatore di SE (A). Sezione imposta con il ROI sul tessuto in ogni sezione e registrato con i pixel di immagine 60 nm (B). Sito imposta con un ROI seriale posizionato sulle cellule bersaglio e registrata con 5 pixel di immagine nm (C). Quando lo zoom in tali immagini ad alta risoluzione (D), compartimenti intracellulari membrana quali vacuoli (V), nucleo (N), mitocondri (M) e del reticolo endoplasmatico (frecce) diventano visibili. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig5.jpg"> Figura 5: problemi tipici. 1. derivanti dal processo di sezionamento: nastri immessi sul lamelle rivestite con ITO sono idealmente dritto (A), ma irregolare compressione durante il sezionamento possono causare piegato (B) o nastri curvi (D) o anche pieghe (C). 2. causati da manipolazione substrato e nastri in acqua, per esempio, durante il sezionamento e la macchiatura: Light scattering di particelle sul substrato (D), cerchio di goccioline sulla sezione (cerchio in E), o sporcizia spalmato fuori del tessuto a causa di inadeguata lavaggio dopo la colorazione (F). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Supplementare film S1: serie di immagini FLM. 435 immagini allineate in Fiji16 utilizzando TrakEM17 e salvato come file di filmato (. avi). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS1.avi">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
Supplementare film S2: serie di immagini di SEM. 210 immagini allineate in Fiji16 utilizzando TrakEM17. La pila originale (300 immagini) di questo set di dati è stato 15 GB. Per ridurre le dimensioni dello stack da 3.3 GB (dopo l'allineamento e il ritaglio per solo due cellule bersaglio), che è stata ridimensionata in x e y di un fattore pari a 0.2 utilizzando Fiji e poi salvato come. avi film. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS2.avi">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
Supplementare film S3: zoom con livelli di risoluzione diversa nel SEM. Film creato ed esportato dal software Atlas 5 in formato. MP4. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS3.mp4">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>

Questo protocollo mira alle cellule specifiche nel tessuto per immagini a risoluzione nanometrica usando un microscopio elettronico a scansione (SEM). Un numero elevato di sezioni di serie da materiale biologico resina-incastonato prima è imaged in un microscopio chiaro per identificare la destinazione e quindi in modo gerarchico in SEM.

Imaging multimodale gerarchica delle sezioni di serie per l'individuazione di specifici obiettivi cellulari all'interno di grandi volumi

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

L'obiettivo generale di questo flusso di lavoro è identificare determinati target per l'imaging ultrastrutturale all'interno di un tessuto utilizzando la microscopia ottica seguita dall'imaging 3D in un SEM ad altissima risoluzione. Il flusso di lavoro di imaging qui introdotto può aiutare a rispondere a domande chiave sull'ultrastruttura cellulare o tissutale in una serie di campi, come la biologia cellulare, la biologia dello sviluppo, le neuroscienze o persino la patologia. Il vantaggio principale della tecnica, che in realtà si basa sulla tomografia array, è che il suddivisione del tessuto in array di sezioni seriali facilita l'identificazione delle strutture target, anche quando inizialmente sono sepolte all'interno del volume del campione originale.La tomografia array è stata originariamente introdotta in un contesto di neuroscienze, ma può anche essere applicata a un'ampia gamma di altri sistemi, tra cui batteri, piante, animali e persino campioni di pazienti in un contesto patologico. Le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché raccogliere molte sezioni seriali è molto difficile. Lavorare senza supporto aggiuntivo può causare la perdita di sezioni o la disorganizzazione dei nastri.Utilizzando un minuscolo pennello formato da alcuni peli fissati a uno stuzzicadenti, rivestire accuratamente i lati anteriore e posteriore di un blocco pre-tagliato con una miscela adesiva. Eseguire questo passaggio rapidamente perché il solvente di questa miscela evapora in pochi secondi. Mentre i campioni si asciugano, taglia i pezzi di wafer di silicone a una dimensione che si adatti alla barca del coltello e contrassegnali con un pennarello a diamante.Quindi, pulire manualmente il wafer di silicone con isopropanolo e un panno privo di lanugine. Fissare il substrato a un'estremità della piastra di supporto utilizzando un adesivo rimovibile. Una volta indurito, il plasma attiva il substrato utilizzando la scarica a bagliore con l'aria per ottenere una superficie idrofila.Con il supporto montato più vicino al bordo del coltello, inserire il supporto nel morsetto del supporto del supporto. Quindi, inserire un coltello diamantato jumbo nel portacoltelli e impostare l'angolo di spoglia su zero gradi. Quindi, riempi la barca a coltello con acqua distillata.Avvicinati al coltello in modo che si trovi a uno o due millimetri dal campione. Quindi, immergere il substrato nell'acqua utilizzando le viti da uno a tre del supporto del substrato. Verificare che la linea di galleggiamento si trovi nel terzo superiore del substrato.Poiché è difficile vedere l'altezza da terra quando si utilizza un wafer di silicone, abbassare il substrato finché non si sente toccare il pavimento. Quindi, sollevare leggermente il substrato. Assicurarsi che né il substrato né il supporto tocchino la barca del coltello durante il taglio.Quindi, usa una siringa o una pipetta per regolare il livello dell'acqua nella barca. Mentre guardi attraverso il binocolo, aggiungi o rimuovi l'acqua fino a quando l'intera area della superficie dell'acqua mostra un riflesso omogeneo dell'illuminazione della luce superiore dell'ultramicrotomo. Una volta completata la configurazione, iniziare a sezionare il campione.Quando sono state tagliate più sezioni, interrompere il processo di sezionamento e rilasciare il nastro dal bordo del coltello accarezzando delicatamente il bordo del coltello con una ciglia o un pelo di gatto molto morbido. Manipolare il nastro verso il substrato e spingere delicatamente la prima sezione del nastro per fissarlo alla parte asciutta del substrato. Continuare a sezionare il campione e attaccare i nastri al substrato.Inizia da un lato del substrato e spostati gradualmente verso l'altro con ogni nuovo nastro. Quando il substrato è completamente ricoperto di nastri, sollevare delicatamente il substrato dalla barca del coltello utilizzando le viti del micromanipolatore del supporto del substrato. Lasciare asciugare la matrice di nastri e poi conservarla in un ambiente privo di polvere.Dopo l'asciugatura, rimuovere il supporto montato sull'adesivo il prima possibile dal supporto. Quindi, colorare il campione per la microscopia ottica come descritto nel protocollo di testo allegato ed eseguire l'imaging. Quindi, colorare il campione per la microscopia elettronica e montarlo su tronchetti di alluminio con un cuscinetto di carbonio appiccicoso.Ora immaginate questi array nel microscopio elettronico a scansione a emissione di campo. Per evitare la carica, utilizzare energie degli elettroni primari di tre kV o inferiori e una corrente del fascio compresa tra 50 e 800 picoampere. Quando si utilizzano vetrini di copertura in vetro rivestiti ITO, collegare la superficie conduttiva al supporto del microscopio con nastro di rame e vernice argentata.Il primo passo nella cascata di imaging gerarchico consiste nel generare una panoramica dell'array in modo tale che le singole sezioni possano essere riconosciute. Per prima cosa definisci i quattro angoli del tuo array rappresentando graficamente un'immagine di ogni angolo a basso ingrandimento, circa 100x, quindi crea un ROI che racchiuda l'intero array. Assegna un protocollo di imaging a questo ROI con i seguenti parametri.Utilizza il rivelatore di elettroni secondario per l'imaging ad alta velocità utilizzando un breve tempo di permanenza di circa 0,2 microsecondi. Scegli una dimensione in pixel dell'immagine grande e una dimensione del riquadro di 2000 x 2000 pixel. Il risultato è un'immagine molto rumorosa, ma anche qui il tessuto all'interno della sezione è visibile.Quindi, generare un set di sezioni creando un'area di interesse, delineando solo il tessuto nella prima sezione. Clonalo in tutte le sezioni successive utilizzando lo strumento timbro. Ruotare le regioni di interesse quando necessario per adattarsi ai nastri piegati.Assegnare un protocollo alla sezione che meglio mostra la sottostruttura del tessuto. Qui, è stata utilizzata una dimensione intermedia dei pixel di 60 nanometri, una dimensione delle tessere di 12000 per 12000 pixel e un tempo di permanenza di 3,2 microsecondi. A causa della scarsa qualità, è stata creata una seconda sezione che delinea alcune celle selezionate utilizzando una dimensione dei pixel più piccola e un rivelatore più sensibile.Ora è possibile riconoscere molto bene le due cellule bersaglio. Creare un set di siti all'interno del set di sezioni contenente la struttura di destinazione per l'imaging SEM a risoluzione più elevata. Rendere l'area di interesse sufficientemente grande da tenere conto della precisione della fase di staging.Controllare e regolare le posizioni dei siti. La sintonizzazione automatica è necessaria quando vengono riprodotte molte sezioni. È importante posizionare le regioni di interesse in modo che il centro non si trovi su materiale vuoto senza dettagli strutturali, ad esempio vacuoli.Successivamente, definire le impostazioni di messa a fuoco automatica e controllare le prestazioni di imaging sulla lunghezza di un nastro su una piccola area di interesse vicina al sito di cui verrà creata l'immagine. Quindi, definire un protocollo di imaging per l'acquisizione SEM ad alta risoluzione. Per vedere gli scomparti della membrana, scegli una dimensione dei pixel dell'immagine compresa tra tre e cinque nanometri.Selezionare un tempo di permanenza a seconda del rilevatore in modo che l'immagine non sia troppo rumorosa. Poiché la fase deve percorrere una distanza considerevole tra la registrazione di questa e questa sezione, definire i valori di messa a fuoco almeno sulla prima sezione di ciascun nastro utilizzando l'opzione di controllo del protocollo. Quindi avvia l'imaging SEM automatizzato su tutta la serie di regioni target di interesse.Al termine, esportare i dati acquisiti come serie di immagini, preferibilmente in formato TIF. Importa serie di immagini nelle Fiji come stack virtuale. Successivamente, ritaglia la pila per un'ulteriore elaborazione tagliando l'area il più vicino possibile alla struttura di interesse.Inoltre, regola la luminosità e il contrasto e salva la pila. Una volta ritagliato e ottimizzato, apri un nuovo TrakEM dal menu File. Fare clic con il pulsante destro del mouse nel campo dell'immagine e importare la pila in TrakEM come una sezione per livello.Facendo clic con il pulsante destro del mouse, scegli Allinea livelli. Scegli i minimi quadrati come modalità, imposta l'intervallo dal primo all'ultimo e scegli nessuno come riferimento. Quindi, selezionate i valori di impostazione predefiniti e scegliete Rigido (Rigid) come trasformazione desiderata.Quando la registrazione è completata e soddisfacente, salvare il set di dati allineati facendo clic con il pulsante destro del mouse e scegliendo Esporta. Crea un'immagine piatta, imposta l'intervallo dalla prima all'ultima immagine e lascia che il software mostri la pila risultante. Al termine, salva la pila in formato TIF.Dopo la preparazione, l'array di sezioni viene visualizzato come un array costituito da diversi nastri di sezioni seriali. Questa sezione mostra una panoramica di una punta di radice di arabidopsis, colorata con ioduro di propidio. Le sezioni sequenziali di questo campione sono state allineate come descritto nel protocollo e combinate per mostrare il campione in 3D come un singolo file di filmato.Qui si possono vedere le due cellule bersaglio che verranno successivamente riprodotte con una risoluzione nanometrica nel SEM. Dopo un'ulteriore colorazione con acetato di uranile e citrato ematico, gli array sono stati ripresi al microscopio elettronico. Questa immagine statica mostra la sezione del campione prima ripresa con una risoluzione di 20 nanometri e nel secondo ciclo di imaging, con una risoluzione di cinque nanometri.Qui, 210 immagini sequenziali dal microscopio elettronico sono state allineate e ritagliate come descritto nel protocollo. Il video si rivolge a due sole cellule e mostra come i vacuoli all'interno delle cellule sono disposti e talvolta collegati in 3D. L'imaging gerarchico automatizzato degli array nel SEM mostrato qui può fornire una mappatura senza soluzione di continuità a diversi livelli di risoluzione, da una panoramica dell'intero array ai dettagli subcellulari.Al massimo ingrandimento, sono riconoscibili i vacuoli, i mitocondri, il nucleo e il reticolo endoplasmatico. Una volta padroneggiato, il posizionamento dei nastri di sezione uno accanto all'altro su un substrato tipico può essere eseguito in poche ore se eseguito correttamente. Questo può fornire centinaia di sezioni su un substrato per l'imaging.Il tempo di imaging per un numero così elevato di sezioni può variare da un microscopio all'altro, ancora di più se i tuoi strumenti di imaging preferiti hanno diversi livelli di automazione. È interessante notare che il flusso di lavoro generale può essere facilmente combinato con altre tecniche di imaging, come la colorazione istoscopica standard o anche la candoluminescenza, oppure può semplicemente essere utilizzato come strumento autonomo per l'imaging arthostrutturale di grandi volumi. Un altro aspetto di questo flusso di lavoro è la facile accessibilità.Gli studi iniziali sono fattibili senza strumenti aggiuntivi o automazione, il che significa senza grandi investimenti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona idea del flusso di lavoro e di come l'imaging multimodale e gerarchico possa essere utilizzato per indirizzare e visualizzare strutture interessanti in un grande volume 3D a diversi livelli di risoluzione.

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