Quantificare i microrganismi alle concentrazioni basse usando microscopia digitale oleografica (DHM)

L'obiettivo generale di questo esperimento è dimostrare la rilevazione di microrganismi a livelli molto bassi utilizzando la microscopia olografica digitale. Questa tecnica è più sensibile della microscopia ottica tradizionale e fornisce informazioni in tempo reale sui comportamenti batterici. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in campo biologico e cosmologico, come la ricerca di organismi patogeni nell'acqua o nella vita all'interno del nostro sistema solare sulle lune ghiacciate.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che il DHM è una tecnica volumetrica, il che significa che possiamo catturare istantaneamente informazioni tridimensionali sul nostro campione senza alcuna necessità di rifocalizzazione fisica. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla diagnosi di infezioni del flusso sanguigno o del liquido cerebrospinale a causa della capacità di rilevare basse concentrazioni batteriche. Per iniziare questa procedura, il giorno dell'esperimento, effettuare una lettura spettrofotometrica della coltura batterica master che dovrebbe essere compresa tra 0,6 e 0,7.

Quindi prelevare un campione della coltura master e contare le cellule direttamente utilizzando una camera di conteggio Petroff-Hausser per enumerare sia le cellule vive che quelle morte. Trasferire un campione da 10 microlitri della coltura non diluita con una micropipetta nella camera. Visualizzalo con un microscopio con obiettivo ad alta secchezza utilizzando il contrasto di fase.

Successivamente, conta i batteri in almeno 20 quadrati e fai la media. Calcola la concentrazione come la media di 20 quadrati per il fattore di diluizione. Per enumerare solo le cellule vive, effettuare una diluizione seriale di ciascuno dei campioni batterici selezionati con una soluzione salina sterile allo 0,9% trasferendo 20 microlitri della soluzione batterica in un altro pozzetto e diluendola con 180 microlitri di soluzione fisiologica.

Ripetere la procedura fino a quando la concentrazione più bassa è di circa 10 per tre cellule per millilitro. Quindi, prelevare 100 microlitri di campioni da almeno due diluizioni e piastrirli sulle apposite piastre di terreno solido. Stenderli con uno spandiconcime sterile ed eseguire almeno tre repliche di ogni diluizione.

Dopodiché, incubali a una temperatura appropriata durante la notte o fino a quando le colonie non crescono. Poi contate le colonie. Calcola le unità formanti colonie e fai la media delle repliche.

In questa procedura, effettuare diluizioni seriali della coltura master per DHM e conteggio post-DHM di CFU su piastre di terreno di brodo di lisogenia. Diluire i batteri in 25 millilitri di un mezzo minimo che favorisca la motilità ma inibisca la divisione cellulare in modo che la concentrazione delle cellule non cambi in modo apprezzabile durante l'esperimento. Per registrare i video DHM, utilizzando una siringa sterile, aspirare circa 10 millilitri della diluizione di interesse.

Quindi collegare la siringa alla camera del campione DHM utilizzando raccordi e tubi sterili. Far fluire continuamente il campione dalla siringa attraverso la camera del campione utilizzando una pompa a siringa. Mentre il campione scorre attraverso la camera del campione, acquisire ologrammi consecutivamente a una frequenza di fotogrammi appropriata.

Lasciare che tutti i 10 millilitri di campione fluiscano attraverso il DHM. Per garantire che i batteri non crescano o muoiano durante gli esperimenti, inoculare le piastre di terreno arricchito con 100 microlitri del terreno esaurito dopo l'acquisizione dell'immagine DHM diffondendolo con uno spandiconcime sterile. Quindi incubarli alla temperatura appropriata per 24 ore prima di contare le colonie.

Avere una conta cellulare accurata è essenziale per determinare quantitativamente i limiti di rilevamento. È importante eseguire tutte le diluizioni con grande cura utilizzando micropipette calibrate e confermare tutti i conteggi mediante densità ottica, piastratura e conteggio diretto nella camera Petroff-Hausser. Per analizzare i dati per la presenza di batteri nei video dell'ologramma acquisiti, eseguire il filtraggio sottratto del mezzo convertendo prima le immagini in un formato a 32 bit.

Quindi calcola il valore mediano dei pixel. Infine, sottrarre questo valore mediano da ogni rispettivo pixel per eliminare gli artefatti fissi nell'ologramma. Successivamente, conta manualmente il numero di anelli dell'area visibile e le celle a fuoco.

Ogni serie di ologrammi sarà accompagnata da un file di timestamp. Utilizzare il file di timestamp per calcolare la quantità totale di campione pompato al momento dell'acquisizione dell'immagine. Successivamente, calcolare la densità cellulare dividendo il numero totale di cellule rilevate per il volume totale del campione visualizzato.

Media da cinque a 10 fotogrammi per statistiche accurate. Questo grafico mostra le celle previste per campo visivo sulla base di un volume di campione di 365 micrometri per 365 micrometri per un millimetro. Per le concentrazioni in cui il numero di cellule per campo visivo scende al di sotto di uno, sono necessarie più immagini per ottenere il rilevamento.

Questa è una sequenza olografica DHM di una coltura di Serratia marcescens a 2.100 cellule per millilitro misurata dalla conta su piastra. La sequenza mostra una cella all'incirca ogni uno o due secondi, il che si adatta perfettamente alla previsione. E questa è un'altra sequenza olografica DHM di una coltura di Serratia marcescens a 620 cellule per millilitro misurata dalla conta su piastra.

Questa sequenza mostra una cella all'incirca ogni sei o sette secondi. Quando si utilizza la microscopia olografica digitale per l'imaging delle cellule, ricordarsi di utilizzare tecniche di sterilizzazione con filtro nella preparazione di tutte le soluzioni. In questo modo si eviterà l'introduzione di particolato nello strumento.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di preparare colture cellulari sane e di avere a portata di mano un terreno di crescita, piastre e terreno di motilità extra. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la colorazione fluorescente per rispondere a ulteriori domande, come la percentuale di cellule vive rispetto a quelle morte. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della microbiologia per esplorare la motilità tridimensionale nelle cellule coltivate e nei campioni ambientali.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come enumerare i batteri utilizzando la microscopia olografica e convalidare i risultati utilizzando altre tecniche di conteggio. Non dimenticare che lavorare con le colture batteriche può essere estremamente pericoloso. Devono essere sempre prese adeguate precauzioni di biosicurezza durante la coltivazione e la manipolazione di organismi vivi.