Valutazione della funzione microvascolare di tessuto adiposo umano mediante videomicroscopia

L'obiettivo generale di questa tecnica di videomicroscopia è esaminare le proprietà funzionali dei microvasi isolati in risposta a stimoli farmacologici e fisiologici, fornendo informazioni sui meccanismi fisiopatologici e molecolari che contribuiscono alla disfunzione vascolare nell'uomo. Questo metodo è utile per comprendere i meccanismi molecolari che portano alla disfunzione della microvascolatura locale nel tessuto adiposo, la quale è stata associata a malattie sistemiche. I principali vantaggi di questa tecnica consistono nel fatto che i vasi sanguigni rimangono funzionali per un certo periodo di tempo dopo il prelievo dal corpo umano e possono essere facilmente esaminati per le loro proprietà fisiologiche.

La rilevanza clinica di questo approccio sperimentale è che consente di identificare i percorsi biologici alterati in modo differenziale nelle condizioni patologiche e di potenzialmente scoprire nuovi bersagli terapeutici. Sotto un microscopio per dissezione dei tessuti, utilizzare microbisturi e micropinze per rimuovere con cura il grasso e il tessuto connettivo circostante dalle piccole arteriole all'interno del campione adiposo. È essenziale distinguere le arteriole dalle venule.

Le arteriole sono tipicamente più piccole in diametro, mostrano un tono maggiore e rispondono in modo più robusto rispetto alle venule. Dopo aver isolato l'arteria, utilizzare suture di nylon o seta per legare eventuali rami collaterali. Successivamente, utilizzare una siringa da 10 millilitri per riempire lentamente il tubo con soluzione di Krebs fresca.

Successivamente, collegare i tubi di gomma ai serbatoi della pressione e alle pipette capillari di vetro all'interno della camera. Poi, trasferire l'arteria dissezionata nella camera dell'organo e cannullare il vaso sulle pipette capillari di vetro. Fissare con attenzione entrambe le estremità dell'arteria alle pipette utilizzando suture di nylon.

Una volta che il vaso è stabile, rimuovere lentamente il tampone di Krebs dalla camera e aggiungere due millilitri di soluzione fresca di Krebs alla camera. Successivamente, collegare la camera dell'organo alla piastra di un microscopio invertito dotato di videocamera. Accendere il software di rilevamento dei bordi con una frequenza di campionamento di un chilohertz.

Collegare il tubo pressurizzato rimanente al secondo serbatoio di pressione riempito con soluzione di Krebs, quindi collegare i serbatoi di pressione al trasduttore di pressione. Una volta collegati tutti i tubi, impostare il blocco riscaldante a 37 gradi Celsius. Successivamente, utilizzare l'unità di controllo della pressione per aumentare gradualmente la pressione intraluminale di cinque millimetri di mercurio ogni cinque minuti, fino a raggiungere la pressione sperimentale appropriata all'interno del lume del vaso sanguigno isolato.

Lasciare che il vaso raggiunga l'equilibrio per 20-30 minuti una volta che la pressione ha raggiunto 60 millimetri di mercurio e registrare il diametro dell'arteria adiposa a riposo. Al termine del periodo di equilibrazione, indurre una pre-costrizione del vaso sanguigno al valore di circa il 55% del diametro di base a riposo aggiungendo un microlitro di endotelina 1 direttamente nel bagno ogni cinque minuti finché il diametro del vaso non risulti adeguatamente ridotto. Per la vasodilatazione endotelio-dipendente indotta dal flusso, indurre un flusso continuo nello spazio intraluminale dell'arteria in direzioni uguali e opposte in modo da generare una differenza di pressione lungo il vaso senza alterare la pressione intraluminale media di 60 millimetri di mercurio.

Dopo tre a cinque minuti, misurare la dilatazione mediata dal flusso. Aumentare ogni incremento di gradiente di pressione di 10 centimetri di colonna d'acqua ogni cinque-sei minuti, fino a un massimo di 100 centimetri di colonna d'acqua. Dopo aver valutato la dilatazione vascolare mediata dal flusso, riportare i serbatoi di pressione alla stessa altezza per interrompere l'induzione del flusso.

Quindi, immediatamente ma con attenzione, sostituire la soluzione nella camera con soluzione di Krebs fresca senza disturbare l'arteria sospesa e lasciare che il vaso inizi a ritornare al diametro di base per 20-30 minuti. Una volta che l'arteria ha raggiunto il diametro di base a riposo, è possibile valutare una lieve vasodilatazione endotelio-dipendente mediata dalla colina. Questo processo inizia pre-restringendo il vaso a circa il 55% del suo diametro di riposo mediante endotelina 1, come dimostrato in precedenza.

Una volta raggiunta la pre-costrizione, aggiungere due microlitri di dosi crescenti di acetilcolina direttamente nel bagno. Registrare la variazione del diametro arterioso cinque minuti dopo l'amministrazione di ciascuna dose. Al termine della risposta dose-effetto all'acetilcolina, valutare la vasodilatazione indipendente dall'endotelio e la vitalità del vaso mediante l'amministrazione sequenziale di papaverina, un vasodilatatore indipendente dall'endotelio, direttamente nel bagno.

Le risposte di vasodilatazione dipendente dall'endotelio a flusso aumentato e stress di taglio o ad acetilcolina sono significativamente ridotte nelle arteriole adipose viscerali rispetto a quelle sottocutanee nell'obesità umana. La vasodilatazione indipendente dall'endotelio in risposta alla papaverina, tuttavia, non mostra alterazioni differenziali tra i due tipi di tessuto adiposo, suggerendo che la disfunzione vascolare nei distretti viscerali sia in gran parte il risultato di un'alterazione a livello endoteliale, almeno nelle fasi iniziali della malattia. Una volta acquisita, questa tecnica può essere completata in tre-cinque ore, se eseguita correttamente.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di procedere con calma ed essere diligenti, poiché anche danni minori ai vasi sanguigni potrebbero alterare i risultati. Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come la trasfezione con siRNA dei vasi sanguigni, per rispondere ad ulteriori domande sull'impatto di geni specifici sulla funzione vasomotoria nelle malattie umane. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia del tessuto adiposo e della microcircolazione per esplorare l'impatto del microambiente del tessuto adiposo sulla salute vascolare locale nell'obesità umana.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come esaminare direttamente la patofisiologia di interi segmenti intatti di vasi sanguigni umani, rimossi da soggetti viventi, un processo che non può essere replicato mediante imaging non invasivo.