Valutazione della funzione microvascolare di tessuto adiposo umano mediante videomicroscopia

L'obiettivo generale di questa tecnica di videomicroscopia è quello di esaminare le proprietà funzionali di microvasi isolati in risposta a stimoli farmacologici e fisiologici, fornendo informazioni sulla fisiopatologia e sui meccanismi molecolari che contribuiscono alla disfunzione vascolare nell'uomo. Questo metodo è utile per comprendere i meccanismi molecolari che contribuiscono alla disfunzione della microvascolarizzazione locale all'interno del grasso, che è stata collegata a malattie sistemiche. I principali vantaggi di questa tecnica sono che i vasi sanguigni rimangono funzionali dopo la rimozione dal corpo umano per un periodo di tempo e sono facilmente esaminabili per le loro proprietà fisiologiche.

La rilevanza clinica di questo approccio sperimentale è che ci permette di identificare percorsi che sono alterati in modo differenziale in condizioni di malattia e di scoprire potenzialmente nuovi bersagli terapeutici. Sotto un microscopio da dissezione tissutale, utilizzare microforbici e micropinze per rimuovere con cura il grasso circostante e il tessuto connettivo dalle piccole arterie all'interno del campione adiposo. È essenziale distinguere le arterie dalle venule.

Le arterie hanno in genere un diametro più piccolo, dimostrano un tono maggiore e rispondono in modo più robusto rispetto alle venule. Quando l'arteria è stata isolata, utilizzare suture di nylon o seta per legare eventuali rami. Quindi, utilizzare una siringa da 10 millilitri per riempire lentamente il tubo con la soluzione fresca di Krebs.

Quindi, collegare i tubi di gomma ai serbatoi di pressione e alle pipette capillari di vetro all'interno della camera. Quindi, spostare l'arteria sezionata nella camera dell'organo e incannulare il vaso sulle pipette capillari di vetro. Fissare con cura entrambe le estremità dell'arteria sulle pipette con suture di nylon.

Una volta fissato il recipiente, rimuovere lentamente il tampone Krebs dalla camera e aggiungere due millilitri di soluzione fresca di Krebs alla camera. Quindi, fissare la camera dell'organo al tavolino di un microscopio invertito dotato di videocamera. Attivare il software di rilevamento dei bordi a una frequenza di campionamento di un kilohertz.

Collegare il tubo pressurizzato rimanente al secondo serbatoio di pressione riempito di soluzione Krebs, quindi collegare i serbatoi di pressione al trasduttore di pressione. Quando tutti i tubi sono stati collegati, impostare il blocco riscaldante a 37 gradi Celsius. Successivamente, utilizzare l'unità di controllo della pressione per aumentare gradualmente la pressione intraluminale a cinque millilitri di mercurio ogni cinque minuti per raggiungere la pressione sperimentale appropriata all'interno del lume del vaso sanguigno isolato.

Lasciare equilibrare il recipiente per 20-30 minuti una volta che la pressione raggiunge i 60 millilitri di mercurio e registrare il diametro dell'arteria adiposa a riposo. Al termine del periodo di equilibrio, pre-restringere il vaso sanguigno a circa il 55% del diametro basale a riposo aggiungendo un microlitro di endotelina 1 direttamente al bagno ogni cinque minuti fino a quando il diametro del vaso non è stato adeguatamente ristretto. Per la vasodilatazione endoteliale dipendente indotta dal flusso, indurre un flusso continuo nello spazio intraluminale dell'arteria in direzioni uguali e opposte in modo che una differenza di pressione possa svilupparsi attraverso il vaso senza alterare la pressione intraluminale media di 60 millimetri di mercurio.

Dopo tre-cinque minuti, misurare la dilatazione flusso-mediata. Aumentare ogni incremento del gradiente di pressione di 10 centimetri di ricambio d'acqua ogni cinque o sei minuti fino a un massimo di 100 centimetri d'acqua. Dopo aver valutato la dilatazione del vaso mediata dal flusso, riportare i serbatoi di pressione alla stessa altezza per arrestare l'induzione del flusso.

Quindi immediatamente, ma con attenzione, sostituire la soluzione della camera con una soluzione fresca di Krebs senza disturbare l'arteria sospesa e lasciare che il vaso inizi a tornare al diametro basale per 20-30 minuti. Una volta che l'arteria è tornata al diametro basale a riposo, è possibile valutare una sottile vasodilatazione endoteliale dipendente mediata dalla colina. Questo inizia pre-restringendo il vaso a circa il 55% del suo diametro di riposo con l'endotelina 1, come precedentemente dimostrato.

Una volta raggiunta la pre-costrizione, aggiungere due microlitri di dosi crescenti di acetilcolina direttamente nel bagno. Registrare la variazione del diametro arterioso cinque minuti dopo la somministrazione di ciascuna dose. Al termine della risposta alla dose di acetilcolina, valutare la vasodilatazione indipendente dall'endotelio e la vitalità dei vasi mediante la somministrazione sequenziale di papaverina e vasodilatatore indipendente dall'endotelio direttamente nel bagno.

Le risposte di vasodilatazione endotelio dipendenti all'aumento del flusso e allo stress puro o all'acetilcolina sono significativamente attenuate nelle arterie adipose viscerali rispetto a quelle sottocutanee nell'obesità umana. La vasodilatazione indipendente dall'endotelio in risposta alla papaverina, tuttavia, non è alterata in modo differenziale tra i due diposi, suggerendo che la disfunzione vascolare nei domini viscerali è in gran parte il risultato di una disfunzione a livello dell'endotelio, almeno nelle prime fasi della malattia. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in tre o cinque ore, se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di prendersi il proprio tempo ed essere diligenti, poiché anche piccoli danni ai vasi sanguigni possono distorcere i risultati. Seguendo questa procedura, altri metodi come la trasfezione dei vasi sanguigni con siRNA possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande sull'impatto di geni specifici sulla funzione vasomotoria nella malattia umana. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia del tessuto adiposo e della microcircolazione per esplorare l'impatto del microambiente del tessuto adiposo sulla salute vascolare locale nell'obesità umana.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sondare direttamente la fisiopatologia di interi segmenti intatti di vasi sanguigni umani, che vengono rimossi da soggetti viventi, un processo che non può essere replicato dall'imaging non invasivo.