Protocollo per la sintesi in fase solida di oligomeri di RNA contenente un 2'- O -thiophenylmethyl Modifica e caratterizzazione attraverso il Dicroroo circolare

L'obiettivo generale di questo rapporto è illustrare la procedura per ottenere oligonucleotidi di RNA tramite sintesi in fase solida. I dodecameri di RNA saranno sintetizzati come modelli e sarà dimostrata anche la loro purificazione e caratterizzazione. Attraverso la sua componente visiva, questa pubblicazione amplierà la portata delle metodologie e delle strutture utilizzate dai ricercatori in vari campi.

Fornire un aiuto visivo, insieme a un piccolo protocollo, consentirà ai ricercatori di utilizzare queste tecniche. Un vantaggio di questa tecnica è la sua adattabilità a un'ampia gamma di modifiche. Poiché le applicazioni odierne diventano più esigenti, è importante disporre di un protocollo standard.

La chimica della fosforamidite sta vivendo una rinascita a causa della robustezza del metodo e del suo potenziale per ottenere oligonucleotidi per applicazioni terapeutiche. Sebbene l'acquisto di oligonucleotidi sia interessante, il prezzo e la disponibilità di modifiche spostano l'interesse verso la preparazione di questi oligomeri internamente, rendendo così questa procedura della massima importanza. Per iniziare questa procedura, pesare ogni fosforamidite in bottiglie d'ambra da 10 millilitri essiccate in forno e tappare ogni bottiglia con un setto precedentemente perforato con un ago da 20 gauge.

Mettere le bottiglie immediatamente sotto vuoto utilizzando un essiccatore contenente un agente essiccante. Dopo aver riempito l'essiccatore con argon secco, rimuovere ogni flacone e aggiungere immediatamente acetonitrile anidro prima di fissarlo su un sintetizzatore peptidico in fase solida. Quindi, rimuovi i setti da ogni bottiglia e posizionali sul sintetizzatore tramite una funzione di cambio bottiglia.

Per impostare la sintesi in fase solida, selezionare l'icona del software. Seleziona il nome del sintetizzatore e fai clic su OK. Quindi, creare una nuova sintesi selezionando File e Nuovo ordine di sintesi. Successivamente, utilizzare la finestra di richiesta per immettere la data di esecuzione, il cliente e l'ID di esecuzione.Selezionare lo strumento, il nome della sequenza e la sequenza.

Nella scheda Ciclo, assegnare il metodo creato in precedenza. Quindi, scegli il manuale Termina procedura, che lascia l'oligonucleotide legato alla resina CPG. Selezionare DMT Off.

Salvare il file selezionando File e Salva con nome.Quindi, fornire un nome per l'esperimento e fare clic su Salva. Quindi, invia il file per iniziare la sintesi selezionando Ordina e Invia ordine al sintetizzatore. Nella finestra di prompt, selezionare una posizione di colonna e fare clic su OK. Nella finestra Sintetizzatore, selezionare Monitor Trityl.

Fare clic su Scegli funzione e Trityl Monitor ogni passaggio digitando 1. Inizia la sintesi selezionando Sintetizzatore e Preparati per iniziare. Posizionare le colonne con l'estremità a tre numeri primi desiderata nelle posizioni indicate sullo strumento.

Quindi, fare clic su Start e No sullo strumento. Una volta completata la sintesi, rimuovere la colonna dallo strumento e riporla in un pallone a fondo tondo. Asciugare la colonna a pressione ridotta per circa 0,5 ore.

Trasferire la resina bianca dalla colonna in una provetta da centrifuga da 1,6 millilitri e aggiungere 0,5 millilitri di una soluzione acquosa di metilammina e ammoniaca. Fissare il tappo della provetta da centrifuga con parafilm e riscaldare il contenuto a 60 gradi Celsius per un'ora e mezza. Posizionare un oggetto pesante sopra le provette per garantire che la concentrazione sia mantenuta costante.

Dopo il raffreddamento a temperatura ambiente, centrifugare brevemente il campione per far girare il contenuto. Quindi, trasferire il surnatante in una nuova provetta da centrifuga. Raffreddare il tubo a 70 gradi Celsius mettendolo in un bagno di etanolo con ghiaccio secco per cinque minuti, quindi concentrarsi fino a quando non si asciuga utilizzando un concentratore speed vac.

Ora, risospendere i solidi in 0,4 millilitri di una soluzione di triidrafluoruro di ammina, quindi fissare il tappo con una pellicola da laboratorio. Riscaldare la soluzione a 60 gradi Celsius per un'ora e mezza. Posizionare un oggetto pesante sopra i tubi per garantire una concentrazione costante.

Dopo aver raffreddato la soluzione a temperatura ambiente, aggiungere 0,04 millilitri di una soluzione di acetato di sodio seguita da una delicata miscelazione con un puntale di pipetta. Aggiungere un millilitro di etanolo e raffreddare la soluzione a circa 70 gradi Celsius con un bagno di etanolo con ghiaccio secco per 15 minuti. Successivamente, centrifugare la soluzione a 15.000 giri/min a quattro gradi Celsius per dieci minuti.

Utilizzare una pipetta per estrarre il surnatante ed essiccare il pellet risultante a pressione ridotta. Dopo l'essiccazione, risospendere il solido ottenuto e il tampone di carico e mescolare fino a ottenere una soluzione omogenea. Quindi, caricare la sospensione su un gel di poliacrilammide precedentemente preparato.

Applicare una corrente attraverso il gel fino a quando il pennarello blu di bromettimolo si trova tra metà e due terzi del gel. Dopo aver rimosso il gel dal supporto, trasferire il contenuto del gel dal bicchiere all'involucro di plastica e posizionarlo su una lastra cromatografica a strato sottile ricoperta di silice, per visualizzare le bande utilizzando una lampada UV. Usa un pennarello per delineare la posizione in cui si trova la fascia superiore e tagliala usando una lama di rasoio.

Metti il gel contenente l'RNA in un tubo conico da 50 millilitri e schiaccialo in piccoli pezzi usando una bacchetta di vetro. Ora, sospendere i residui di gel in una soluzione acquosa di cloruro di sodio e agitare la sospensione a 37 gradi Celsius per 12 ore. Trasferire la sospensione in una provetta da 15 millilitri, quindi centrifugare a 3400 giri/min per dieci minuti.

Per desalinizzare il campione utilizzando una cartuccia C18 a fase inversa, lavare prima la cartuccia con acetonitrile, acqua, cloruro acquoso di ammonio e la soluzione di RNA, lasciando dietro di sé i residui di gel. Dopo il lavaggio con acqua, eluire l'RNA dalla colonna utilizzando tre millilitri di soluzione acquosa di metanolo al 60% in tre diverse provette. Raffreddare i tubi a 70 gradi Celsius in un bagno di ghiaccio secco per cinque minuti, quindi concentrare il contenuto fino a farlo asciugare utilizzando un concentratore di aspirapolvere.

Dopo aver concentrato l'eluente a pressione ridotta, risciogliere il residuo in 0,3 millilitri di acqua priva di RNasi. Dopo aver diluito la soluzione, depositare un microlitro sullo strumento UV vis per misurare lo spettro UV vis tra 200 e 450 nanometri. Per l'analisi MALDI-TOF, lavare prima un puntale per pipetta C18 con acetonitrile al 50%.

Equilibrare il puntale della pipetta con acido trifluoroacetico allo 0,1%. Quindi, caricare il puntale della pipetta con una soluzione contenente da 100 a 150 picomoli di campione. Dopo aver lavato il puntale della pipetta con TFA allo 0,1% e acqua, eluire il campione in una soluzione contenente la matrice desiderata.

Depositare 0,9 microlitri di soluzione su una piastra MALDI e lasciare asciugare il campione. Per l'analisi della struttura dell'RNA, trasferire il campione contenente RNA in una microcuvetta e posizionarlo nello scambiatore di campioni di uno strumento per dicroismo circolare. Aprire il serbatoio dell'azoto per fornire un flusso che sposti il galleggiante d'aria situato sullo strumento a circa 40.

Quindi, accendi il frigorifero. Ora accendi lo strumento. Aprire il software facendo clic sull'icona Spectrum Manager, quindi aprire la finestra di acquisizione facendo clic su Spectrum Measurement.

Dopo aver spurgato lo strumento con azoto, acquisire gli spettri del dicroismo circolare selezionando Misura e Parametri. Nella scheda Generale, selezionare 200-350 nanometri per la scansione, CD e HT per i canali, 0,1 nanometri per il passo dei dati, 100 nanometri al minuto per la velocità di scansione, un nanometro per la larghezza di banda e cinque per il numero di accumuli. Nella scheda Unità cella, scegli 20 gradi Celsius.

Nella scheda Controllo, seleziona L'otturatore si apre e si chiude automaticamente. Nella scheda Informazioni, immettere il nome del campione, l'operatore, la concentrazione e il solvente. Nella scheda Dati, individuare la cartella desiderata e fare clic su OK. Acquisisci gli spettri facendo clic su Misura e Misura campione.

Infine, identificare le posizioni delle cuvette nello scambiatore di campioni da uno a sei e fare clic su OK. I quattro filamenti di RNA sono stati ottenuti tramite sintesi in fase solida e, dopo la purificazione, hanno prodotto tra 300 e 700 nanomoli di ciascun oligonucleotide. I cromatogrammi MALDI-TOF degli oligonucleotidi sono mostrati qui. Non si osserva alcuna differenza importante negli spettri UV-vis normalizzati dal confronto della banda a 260 nanometri e degli oligonucleotidi canonici e modificati, sia che si confrontino campioni a filamento singolo che strutture duplex.

Tuttavia, si osservano cambiamenti minori dopo la misurazione dei loro spettri di dicroismo circolare. Inoltre, le misurazioni Tm delle tre strutture duplex hanno mostrato un valore distinto che era indicativo della destabilizzazione indotta dall'incorporazione delle due prime modificazioni ottio-fenilmetiliche su uno dei filamenti. È importante ricordare che la resa della sintesi in fase solida dipende dalla purezza del reagente.

L'umidità avrà un impatto negativo su ogni fase, poiché la quantità di acqua presente deve essere sempre reagente. La metodologia riportata è destinata a fungere da risorsa generale per gli scienziati. La tecnica può variare a seconda della modifica desiderata, della strumentazione disponibile o dei vincoli di tempo.

Il tipo di chimica qui impiegato rappresenta una metodologia molto robusta che è stata utilizzata dagli anni '80 ed è ancora ampiamente utilizzata in ambito accademico e industriale. Dopo aver visto questo video, dovresti essere in grado di eseguire la sintesi, la purificazione e la caratterizzazione dei tuoi oligonucleotidi modificati o canonici di RNA o DNA. Non dimenticare che lavorare con i reagenti necessari può essere pericoloso e che i dispositivi di protezione come occhiali di sicurezza, guanti e camici da laboratorio devono essere indossati in ogni momento.

Tutti i reagenti devono essere maneggiati con cura e, se necessario, all'interno di una cappa aspirante.