Name: Protocollo per la sintesi in fase solida di oligomeri di RNA contenente un 2- O -thiophenylmethyl Modifica e caratterizzazione attraverso il Dicroroo circolare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Impara la sintesi in fase solida di oligomeri di RNA dodecamerici con modifiche 2'-O-tiofenilmetiliche. Questo protocollo dettagliato include purificazione e caratterizzazione mediante dicroroo circolare per la chimica degli acidi nucleici.

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La preparazione di questo manoscritto è stata sostenuta attraverso fondi di start-up dell&#39;Università del Colorado Denver (JMRE). AF desidera riconoscere il sostegno da un premio per la ricerca e la creazione di attività creative (RaCAS, CU Denver). Finanziamenti presso l&#39;Ufficio dei servizi di ricerca, University of Colorado Denver per coprire le spese di pubblicazione è riconosciuto. Vorremmo ringraziare i membri del laboratorio, Sig.ra Cassandra Herbert e Yannick K. Dzowo per i loro contributi nella porzione video.

1. Sintesi di fase solida di oligonucleotidi RNA <ol><li> Preparazione di soluzioni contenenti ciascuna fosforamidite (Tabella 1). <ol><li> Conte il numero di nucleotidi e rientrare nell&#39;equazione n + 1 (dove n = numero di nucleotidi) corrispondenti a ciascuna base e riempire la tabella con i valori mancanti. Volume = 0,15 mL per nucleotide ad una concentrazione di 0,1 M, disciolto in acetonitrile anidro. </li><li> Pesare ciascun fosforamidite in bottiglie ambrate da 10 ml essiccate a forno (Septum Top Amber 394 Amidite 13 mm ID x 20 mm OD Top) e posizionare immediatamente sotto vuoto usando un esiccatore contenente un agente essiccante. </li><li> Riempire l&#39;esiccatore con argon secco, rimuovere la bottiglia e diluire immediatamente con la corrispondente quantità di acetonitrile (anidra) prima di fissare lo strumento. NOTA: Assicurarsi di utilizzare siringhe a tenuta stagna e mantenere sempre un&#39;atmosfera anidra. </li><li> Rimuovere la septa dalla bottiglia e mettere sul mAchine, tramite una funzione di cambio di bottiglia. NOTA: Questo processo richiede ulteriori 0.15 mL (quindi il volume in eccesso nell&#39;equazione n + 1 sopra) di ciascuna soluzione per preparare la linea prima della sintesi. </li></ol></li><li> Impostazione della sintesi di sequenza e fase solida usando il software ( Figura 3 ). <ol><li> Fai clic sull&#39;icona del software ( ad esempio , OligoNet 1.0.1) e seleziona Nome strumento&gt; OK . Crea una nuova sintesi da File&gt; Nuova sintesi&gt; Ordine . </li><li> Riempimento: Data; RunID; Selezionare strumento; Nome della sequenza; Sequenza (fine 5&#39;-a-3 &#39;). Sotto | ciclo, assegnare il metodo creato in precedenza ( Figura 3 ). Scegli la procedura finale, ( lascia oligonucleotide legata alla resina CPG)&gt; manuale. </li><li> Selezionare DMT Off&gt; (trattamento TCA nell&#39;ultimo passaggio per ottenere un gruppo 5&#39;-OH alla fine della sintesi) ; Salvare File&gt; Salva comeE fornire un nome per l&#39;esperimento. </li><li> Inviare il file per iniziare la sintesi Ordine&gt; Invia ordine al sintetizzatore e selezionare colonna 1-4 . Apri la finestra del sintetizzatore e seleziona il monitor trityl | scegli la funzione | trity&gt; controlla ogni passo . </li><li> Ripetere i passaggi secondo necessità a seconda del numero di oligonucleotidi da sintetizzare contemporaneamente (notare che tutti gli ordini devono avere lo stesso metodo, cioè gli stessi tempi di accoppiamento e la sequenza di eventi). </li><li> Iniziare la sintesi Sintetizzatore&gt; Preparare per iniziare . Posizionare le colonne con il desiderato 3&#39;-end sulle posizioni indicate nello strumento. Sullo strumento fare clic su Start&gt; No (per la preparazione ABI). </li><li> Una volta completata la sintesi, rimuovere la colonna dallo strumento e posizionarla in una tazza di fondo rotonda seguita dall&#39;essiccamento a pressione ridotta per circa 0,5 h. NOTA: Si raccomanda di verificare che un colore arancione profondo sia osservato in randOm (punti 1.2.4 - 1.2.7) per evitare errori potenziali dalla funzione di monitoraggio trityl. </li></ol></li><li> Deprotezione e purificazione di oligonucleotidi RNA. <ol><li> Aprire la colonna torsione del tappo nero e trasferire tutto (o metà, a seconda della necessità o della finalità) della resina bianca in un tubo da centrifuga da 1,6 ml. Aggiungere 0,5 mL di una metilammina (40% in acqua) / ammoniaca (40% in acqua) a 1: 1. </li><li> Fissare il tappo della tubazione centrifuga con il parafilm e, usando un blocco termico, scaldare a 60 ° C per 1,5 ore. NOTA: un oggetto pesante può essere posto sulla parte superiore del tubo per assicurare che la concentrazione di ammoniaca rimanga costante all&#39;interno del tubo di reazione. </li><li> Rimuovere dal blocco termico e raffreddare lentamente fino a temperatura ambiente. Centrifugare brevemente il campione per far girare i contenuti, quindi trasferire il surnatante in un nuovo tubo di centrifuga. </li><li> Fermare i campioni sommersando tubi in azoto liquido (o ghiaccio a secco / bagno di etanolo) e concentrarsi a secchezza mentre spinnIn una centrifuga a pressione ridotta. </li><li> Riposizionare i solidi in 0,4 mL di una soluzione trietilammina / N-metilpirrolidinone / trietilammina-triidrofluoruro (rapporto 2: 2: 3). Scaldare a 60 ° C per 1,5 ore seguita da lento raffreddamento a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 0,04 ml di una soluzione NaOAc (3M, pH 5,5 - regolata con HCl) seguita da una miscelazione dolce con una punta di pipetta. Aggiungere etanolo (1 mL) e raffreddare a ca. -70 ° C (ghiaccio secco / bagno di etanolo) per 15 min. </li><li> Centrifugare a 15.000 giri / min e 4 ° C per 10 min. Utilizzare una pipetta per estrarre l&#39;aliquota e asciugare il pellet risultante sotto pressione ridotta. </li><li> Ricalassare il solido ottenuto nel tampone di caricamento (0,2 mL, formamide di 90%, 1 mM EDTA) e mescolare fino a quando la miscela è omogenea. </li><li> Sospendere la carica su un gel di poliacrilammide preparato in precedenza (denaturazione del 20%, dimensioni del pozzetto: 30 cm x 1 mm) 22 . </li><li> Applicare una corrente attraverso il gel fino a quando il marcatore blu bromofenolo si trova tra 1 / 2-2 / 3Giù il gel (dimensioni del gel: ~ 21,5 cm x 30 cm). </li><li> Togliere il gel dal supporto e trasferire il contenuto di gel dal vetro al involucro di plastica (coperto da entrambi i lati) e collocare su una lastra di cromatografia a strato sottile (TLC) ricoperta di silice (contenente colorante fluorescente a 254 nm) per visualizzare le bande Utilizzando una lampada UV (λ max = 254 nm). </li><li> Utilizzare un marcatore per delineare la posizione in cui si trova la fascia superiore e tagliarla usando una nuova lama del rasoio. Posizionare il gel contenente l&#39;RNA (senza involucro in plastica) in un tubo conico da 50 ml e schiacciare a piccoli pezzi utilizzando una barra di vetro. </li><li> Sospendere i residui di gel in un NaCl aq. (2 mM ed 1 mM EDTA) e agitano la sospensione a 37 ° C per 12 ore. Centrifugare il tubo conico per 10 min. </li><li> Desaltare usando una cartuccia C18 a inversione di fase. <ol><li> Preparare la cartuccia usando una siringa da 10 ml lavando con: Acetonitrile (10 mL) H 2 O (due volte, 10 mL) 5 mM NH4 Cl aq. Soluzione (3 mL) Soluzione contenente RNA, facendo attenzione a non versare alcun residuo di gel. </li><li> Lavare con H 2 O (tre volte, 10 mL). </li><li> Eluire dalla colonna usando un 60% aq. Soluzione metanolo (3 mL) </li></ol></li><li> Concentrare sotto pressione ridotta e ristabilire in acqua libera da RNasi (0,3 mL) </li><li> Preparare una soluzione diluita (10 μL) e depositare 1 μL sullo strumento UV ( ad es . Nanodrop) per misurare lo spettro UV-vis (200-450 nm). </li><li> Utilizzare la legge di Birra Lambert per determinare la concentrazione della soluzione ottenuta: <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/56189/56189eq1.jpg" /> Dove A = assorbanza ottenuta; Ε = coefficiente di estinzione molare calcolato; C = concentrazione, e l = 0,1 per una lunghezza del percorso di 1 mm. </li><li> Calcolare i coefficienti di estinzione molari per gli oligonucleotidi; Calcolato qui con un calcolatore on-lineChe utilizza il software DINAMelt (http://unafold.ra.albany.edu/?q=dinamelt) 23 </li></ol></li><li> Determinazione e caratterizzazione della concentrazione tramite MALDI-TOF. <ol><li> Caricare i campioni su una piastra MALDI usando una punta pipetta caricata con una punta C18 per desaltare e individuare ogni oligonucleotide. <ol><li> Lavare la punta con acetonitrile al 50% (10 μL x 2). Equilibrare la punta con l&#39;acido trifluoroacetico 0,1% (TFA; 10 μL x 2). Caricare la punta con il campione (tipicamente 100-150 pmol). </li><li> Lavare la punta con 0,1% TFA (10 μL x 2) e poi con acqua (10 μL x 2). </li><li> Eluire il campione in una soluzione contenente la matrice desiderata; Abbiamo utilizzato una soluzione di: 10 μL di 25 mM-2,4,6-triidro-acetofenone monohidrato (THAP), 10 mM di ammonio citrato e 300 mM di ammonio fluoruro in acetonitrile al 50%. </li><li> Collocare direttamente sulla piastra MALDI depositare 0,9 μL (seguito da essiccazione ad aria) e ripetere la procedura se necessario. NOTA: Tutti gli spettri sono stati ottenuti sulla modalità positiva del riflettore. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. RNA Struttura Analisi via CD <ol><li> Preparazione di soluzioni per CD. <ol><li> Preparare 0,25 mL contenenti l&#39;RNA modificato [3 pM], NaCl [10 mM], tampone sodio fosfato [10 mM, pH 7,2], e MgCl 2 [5 mM]. Il campione è pronto per l&#39;analisi come è, in particolare se rappresenta una transizione unimolecolare. </li><li> Se l&#39;obiettivo è quello di analizzare le strutture duplex o le transizioni bimolecolari, aggiungere in questo momento il complemento (1 equivalente molare, se applicabile), oppure continuare con il passo successivo. </li><li> Posizionare il campione su un blocco termico, pre-riscaldato a 90 ° C, e spegnere il calore per controllare il raffreddamento lento a temperatura ambiente (tipicamente 2-4 h). </li></ol></li><li> Acquisizione Spectra <ol><li> Preparare una soluzione in bianco (NaCl 10 mM, fosfato di sodio 10 mM pH 7,3, MgCl 2 5 mM), trasferimento tUna micro-cuvetta (lunghezza del percorso di 1 cm, volume minimo di 250 μL) e posizionare su una posizione di supporto del cambiacampione all&#39;interno dello strumento. </li><li> Trasferire il campione contenente RNA in un&#39;altra micro-cuvetta e una posizione nel cambia- re del campione. Se si misura una transizione di denaturazione termica, aggiungere con attenzione un letto di olio senza interrompere lo strato acquoso e fissare il tappo di cuvetta utilizzando un nastro di teflon. </li><li> Aprire il serbatoio dell&#39;azoto per fornire un flusso che sposta il flottante dell&#39;aria situato nello strumento a ca. 40. Accendere il dispositivo di raffreddamento. </li><li> Accendere lo strumento e aprire l&#39;icona del software Spectra Manager , quindi aprire la finestra di acquisizione Spectra Measurement . </li><li> Spurgare lo strumento con azoto per 5 minuti prima dell&#39;acquisizione. </li><li> Acquisire gli spettri utilizzando i seguenti parametri Misura&gt; Parametri e regolare i parametri come segue: <ol><li> In Generale , selezionare: Scan 200-350 nm; Canali CD e HT: datiPitch a 0,1 nm; Velocità di scansione a 100 nm / min; Larghezza di banda a 1 nm; Numero di accumulazioni a 5. </li><li> Sotto l&#39;unità cellulare , scegliere 20 ° C. Sotto controllo , seleziona l&#39;otturatore viene aperto e chiuso automaticamente. Sotto le informazioni , scegliere il nome, la concentrazione, l&#39;operatore. </li><li> Sotto i dati , accedere alla cartella desiderata. Fare clic su OK . </li></ol></li><li> Acquisire lo spettro Misura&gt; Misura campione , individuare le posizioni delle cuvette nel cambia- mento del campione 1-6 , quindi fare clic su OK . </li></ol></li><li> Se prende una transizione di denaturazione termica: <ol><li> Chiudi File software di acquisizione &gt; Chiudere e aprire un nuovo programma Misurazione della temperatura variabile&gt; Misura&gt; Parametri . </li><li> Applicare i seguenti parametri per registrare una transizione termica, che può essere regolata come desiderato: <ol><li> Sotto Temperatura , selezionare temperatura di avvio: 4 ° C; Intervallo: 0,2; taR: 90 ° C; Gradiente: 1 ° C / min; Attendere 0 s. In Start / End , selezionare Avvia condizione e condizioni finali come desiderato. </li><li> In Generale , selezionare 3 canali, CD / HT / Abs; Larghezza di banda: 1 nm; Lunghezza d&#39;onda: 270 nm (o come desiderato). In Controllo , seleziona nessuno. In Informazioni , selezionare nome, concentrazione, operatore. </li><li> Sotto i dati , accedere alla cartella desiderata. Fare clic su OK . </li></ol></li><li> Far raffreddare i campioni a 4 ° C e aspettare 5 min a questa temperatura prima di ottenere una misurazione dello spettro. </li></ol></li><li> Elaborazione dei dati per gli spettri. <ol><li> Utilizzando la funzione del software, sottrarre lo spettro vuoto dall&#39;acquisizione di target per tenere conto dei segnali di sfondo derivanti dal sistema di buffer in uso: Spectra Analysis&gt; File&gt; Open . </li><li> Una volta aperti un file vuoto e un file di spettri, trascinate View 2 sotto View 1 (sul lato sinistro della schermata). </li><li> Fare clic su PrOcessing&gt; sottrazione&gt; OK o scambia dati&gt; OK . </li><li> Estrarre i dati come un file ASCII: File&gt; Esporta e selezionare ASCII . </li><li> Utilizzare il software per tracciare lo spettro corrispondente. Lo smorzamento dei dati è opzionale nei casi in cui il rapporto segnale / rumore è inferiore a quello previsto. Questa trasformazione può essere applicata applicando l&#39;opzione di regolazione dei dati. </li></ol></li><li> Elaborazione dei dati per le transizioni di denaturazione termica. <ol><li> Estrarre i dati dal file JASCO come file ASCII. </li><li> Tracciare i punti di ellitticità in funzione della temperatura. In genere, è necessario uniformare i dati a seconda della lunghezza d&#39;onda in esame. In alcuni casi, l&#39;utilizzo della lunghezza d&#39;onda a 210 nm ha mostrato variazioni più grandi tra le tracce che richiedevano lo smorzamento. Tuttavia, a seconda del campione e delle concentrazioni, sono stati eseguiti diversi calcoli utilizzando i dati grezzi. </li><li> Per calcolare la tana termicaTransizioni di atura (T m ), ottenere un primo derivato della curva. I valori massimi o minimi erano un&#39;indicazione di questo parametro. Come nel passaggio precedente, alcuni casi hanno richiesto lo snellimento dei dati per ottenere il valore più accurato. NOTA: Gli esperimenti sono stati tipicamente eseguiti in triplice copia, che hanno determinato la corrispondente deviazione media e standard per la misurazione. </li></ol></li></ol>

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<li>AbouHaidar, M. G., Ivanov, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-enzymatic+RNA+promoted+by+the+combined+catalytic+activity+of+buffers+and+magnesium+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Z+Naturforsch+C%22%5BJournal%5D)">Non-enzymatic RNA promoted by the combined catalytic activity of buffers and magnesium ions.</a> Z Naturforsch C. 54 (7-8), 542-548 (1999).</li>
<li>Farrell, R. E. <a target="_blank" href="http://blogsdelagente.com/cefimijegyte/rna-methodologies-fourth-edition-laboratory-guide-for-isolation-and-characterization-ebook-download/">RNA Methodologies (4th Ed): A laboratory guide for isolation and characterization</a>. 2, Academic Press. San Diego, California. 45-80 (2010).</li>
</ol>

Gli autori non hanno niente da rivelare.

L&#39;intento di questo manoscritto è quello di servire da guida ai ricercatori del campo, principianti o esperti, per raggiungere o migliorare la sintesi di oligonucleotidi di DNA o RNA. La metodologia descritta mette a fuoco sull&#39;utilizzo di sintesi a fase solida utilizzando un sintetizzatore automatizzato DNA / RNA tramite la chimica standard di fosforamidite. Il rapporto descrive una rappresentazione passo-passo della sintesi, della purificazione e della caratterizzazione di dodecameri RNA. Inoltre, l&#39;uso de...

La sintesi in fase solida per ottenere gli oligonucleotidi del DNA / RNA è un potente strumento che ha servito parecchie applicazioni in vari campi sin dagli anni &#39;70 1 , 2 , 3 usando i blocchi di costruzione di fosforamidite 4 . Esempi della sua vasta influenza includono: il suo impatto sull&#39;etichettatura ( tramite reazioni di chimica clicca) 5 , la sonda strutturale 6 e le tecnologie antisenso 7 , nonché la sua spiegazione dei meccanismi biologici 8 , 9 , fonte di materiale genetico 10 e lo studio di Varie modificazioni naturali e / o chimiche 11 , 12 , tra molti altri. La modifica che usiamo qui rappresenta il primo passo nei nostri sforzi per ottenere oligonucleotidi RNA che contengonoSonde fotoattive per consentire il controllo temporale della struttura e della funzione di questo importante biopolimero. La sintesi di RNA con sequenze dodecameri: 5 &#39;- [CUA CG G A AU CAU] -3&#39; / 5 &#39;- [agosto AUU CCG UAG] -3&#39; (posizioni sottolineate rappresentano l&#39;incorporazione di una modifica -thiophenylmethyl C2&#39;- O ) Costituisce l&#39;oggetto di questo studio. Le sequenze sono state scelte per consentire la quantificazione e la misurazione dei fili RNA come singoli fili, o come corrispondenti strutture duplex (nessuna altra struttura secondaria è stata predetta come stabile termodinamica). CD è stato utilizzato per stabilire i parametri strutturali, cioè la formazione di duplex e le transizioni di denaturazione termica. Sintesi La procedura complessiva per ottenere questi oligonucleotidi è illustrata nella figura 1 e segue il processo stepwise: Sintesi solida automatica → DeprOzione → purificazione → quantificazione → caratterizzazione. La Figura 2 mostra le unità monomeriche necessarie in questa procedura. La sintesi in fase solida di RNA è simile a quella del DNA che si basa su fosforammidito chimica (Figura 2, sinistra) e l&#39;uso di gruppi protettivi di base-labile per le ammine esociclici nucleofile in G, A e C, ad esempio, Acetil, benzoile, fenossiacetil, t- butile o N , N- dimetilformamide ( figura 2 , a destra). Un altro aspetto da considerare in RNA, dovuto alla presenza del gruppo C2&#39;-OH (che non presenta i biopolimeri deoxyoligonucleotidi), è la fase supplementare che deve essere incorporata per la protezione e la successiva deprotezione di questa posizione nucleofila. A questo proposito, i gruppi di protezione a base di silicio sono diventati una strategia attraente per il loro potenziale come parti biortogonali (specificamenteSi è deprotected in presenza di fluoruro), con gruppi di terz- butilidimetilsilil (TBDMS) e triisopropilsililossimetil (TOM) come scelte popolari ( Figura 2 , in basso a sinistra). In questo lavoro, la sintesi automatizzata è stata effettuata su un sintetizzatore DNA / RNA che utilizza la chimica standard di fosforamidite. Le impostazioni del produttore sullo strumento includono una fase di diluizione automatica quando si utilizzano le versioni commerciali dei fosforamiditi per il DNA o l&#39;opzione di diluire a volumi impostati dall&#39;utente. Tuttavia, abbiamo deciso di pesare l&#39;fosforamidite di RNA e diluire manualmente in quanto: 1) il prezzo delle fosforamiditi canoniche dell&#39;RNA è maggiore (in alcuni casi fino a 50 volte più costoso); 2) i fosforamiditi modificati vengono spesso ottenuti in piccole quantità; E 3) la quantità di materiale sprecato dopo l&#39;utilizzo di una fase di diluizione automatica (impostata dal produttore) è grande. Inoltre, abbiamo usato: 1) supporti solidi disponibili in commercio(Ad esempio , CPG) contenente una nucleobase protetta per funzionare come 3&#39;-end; E 2) fosforamiditi commerciali (nucleobasi canonici) protetti con un gruppo TBDMS alla posizione C2&#39;- O . L&#39;elenco dettagliato delle fasi di sintesi è fornito in Figura 3 e Tabella 1 , insieme ad ulteriori descrizioni e commenti per i passi che sono stati regolati per la sintesi di RNA. Inoltre, la Figura 4 illustra le rese graduali osservate per ogni passo dopo aver selezionato l&#39;opzione &#39;Trityl Monitor&#39;, che quantifica il tritio cation rilasciato da ogni fase di detritilazione. Vale la pena notare che tipicamente, nella nostra esperienza, il fattore limitante stava ottenendo il fosforamidite contenente la modifica desiderata. Cioè lo sviluppo di una metodologia sintetica che consente l&#39;inserimento di modifiche in siti selezionati. In questa relazione, ci concentriamo sulIncorporazione di un nucleotide modificato per il quale abbiamo stabilito la corrispondente metodologia sintetica, il gruppo C2&#39;- O- tiofenilmetile. Questo gruppo è di taglia piccola e non influenza la sintesi a fase solida in alcun modo. Dal momento che è stata riportata l&#39;incorporazione di questo gruppo in oligonucleotidi di RNA, insieme ai parametri strutturali e termodinamici 4 , non saranno descritti aspetti della sintesi organica che conduce alle modificate fosforamidite. Deprotezione, depurazione e caratterizzazione La deprotezione delle amine esociclici e dei gruppi ß-cianoetil si verifica nello stesso passo di quello della scissione della resina CPG. Abbiamo applicato le condizioni comunemente utilizzate per riscaldare la resina ottenuta in presenza di una soluzione acquosa di AMA, seguita dalla scissione dei gruppi C2&#39;- O- sililici in presenza di ioni di fluoruro e quindi di purificazione mediante gelelettroforesi. Mentre questi sono diventati condizioni standard in molti casi, modifiche che sono labili a condizioni di base o ioni fluoruro può richiedere condizioni più blande 13, 14, ad esempio, carbonato di metanolo / potassio (MeOH / K 2 CO 3), o butilammina. Pertanto, è necessario un diverso insieme di gruppi protettivi sui corrispondenti fosforamiditi. Inoltre, abbiamo scelto l&#39;elettroforesi come alternativa preferita per purificare gli oligomeri deprotected dato la nostra precedente esperienza con questo metodo e la mancanza di altre strumentazioni. Tuttavia, la HPLC può essere utilizzata alternativamente come un metodo efficace 15 . La caratterizzazione degli oligonucleotidi purificati è stata effettuata mediante spettrometria di massa, desorbimento / ionizzazione-tempo di volo (MALDI-TOF) assistita dalla matrice, utilizzando una procedura riportata dal nostro gruppo 16 . Caratterizzazione strutturale e ther<html> La stabilità stabile dei duplex ottenuti è stata effettuata tramite CD. In particolare, facciamo uso di CD per determinare le transizioni di denaturazione termica di oligonucleotidi modificati e non modificati di RNA seguendo la diminuzione dell&#39;elettricità della banda a ca. 270 nm, come pure la scomparsa della banda (con ellitticità negativa) con un λ max a 210 nm. Un confronto di spettri prima e dopo l&#39;ibridazione viene fornito per illustrare le loro differenze e fornire la convalida della metodologia impiegata. L&#39;uso del CD è ampiamente accettato nella determinazione di motivi strutturali negli acidi nucleici e negli aminoacidi 17 e può quindi essere impiegato come strumento per determinare diversi parametri strutturali e termodinamici 18 ; Tuttavia, non esistono molti esempi in cui la tecnica viene utilizzata per valutare le transizioni di denaturazione termica. Alcuni casi includono la determinazione di stabilità termica su DNA contenente G-quadruplexesAss = &quot;xref&quot;&gt; 19 , 20 o in duplex e hairpins di RNA 21 . Questo rapporto intende fornire al lettore o al visualizzatore non esperti un insieme di strumenti che consentono un inizio regolare di questo tipo di ricerca. Sarà utile migliorare e confrontare con metodologie e tecniche in altri laboratori di ricerca che sono coinvolti in questo eccitante ramo della scienza. Il contenuto di questa relazione aggiunge i protocolli esistenti di questa tecnologia da varie fonti e arricchisce e facilita l&#39;esperienza con un aiuto visivo per ogni passaggio.

<table><tbody><tr><td>AbsolveTM</td><td>PerkinElmer</td><td>6NE9711</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile 99,9%, HPLC Grade Fisher</td><td>Scientific</td><td>75-05-8</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile 99,9%, anidro per il sequenziamento del DNA</td><td>Fisher BioReagents</td><td>75-05-8</td><td></td></tr><tr><td>Acrilammide, 99+%</td><td>ACROS Organics</td><td>164850025</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di ammonio 98+%</td><td>Alfa Aesar</td><td>12125-02-9</td><td></td></tr><tr><td>Citrato di ammonio, bibasico 98%</td>Fluoruro di ammonio <td>Sigma Aldrich</td><td>3012-65-5</td><td></td></tr><tr><td>98,0%, grado ACS Alfa</td><td>Aesar</td><td>12125-01-8</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di ammonio 28 - 30% in acqua, ACS Plus</td><td>Fisher Chemical</td><td>1336-21-6</td><td></td></tr><tr><td>Persolfato di ammonio</td><td>ACROS Organics</td><td>1444</td><td></td></tr><tr><td>Argon-ultra purezza</td><td>&nbsp; Airgas</td><td>7440-37-1</td><td></td></tr><tr><td>Bis-acrilammide Acido</td> borico <td>VWR-Amresco</td><td>172</td><td></td>ultra puro</tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>A73-1</td><td></td></tr><tr><td>Pirocarbonato di dietile, 97%</td> <td>ACROS Organics</td><td>A0368487</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo, anidro, grado istologico</td><td>Fisher Chemical</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamminico tetraacetico, sale disodico disidratare 100,2%</td> <td>Fisher Chemical</td><td>6381-92-6</td><td></td></tr><tr><td>formammide&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>75-12-7</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico, 36,5 - 38,0%, Certificato ACS Plus</td><td>Fisher Chemical</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio esaidrato, 99%</td><td>Fisher Scientific</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo, 99,9%,&nbsp; Grado HPLC</td><td>Fisher Chemical</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Metilammina 40% in acqua</td><td>Sigma Aldrich</td><td>74-89-5</td><td></td></tr><tr><td>1-Metil-2-pirrolidinone, e idro, 99,5%</td><td>Aldrich</td><td>872-50-4</td><td></td></tr><tr><td>Opti-TOFTM 96 Well Insert (123 x 81 mm)&nbsp;</td><td>MDS SCIEX</td><td>1020157</td><td></td></tr><tr><td>RNase Away</td><td>Molecular BioProducts</td><td>7005-11</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di sodio, anidro 99,2%, certificato ACS</td><td>Fisher Chemical</td><td>127-09-3</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio, 100,5%, certificato ACS</td><td>Fisher Chemical</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Sodio fosfato monobasico diidrato 99,0%</td><td>Sigma</td><td>13472-35-0</td><td></td></tr><tr><td>2',4' Trietilammina, 99+%Alfa</td> <td>Aesar</td><td>121-44-8</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Amresco</td><td>761</td><td></td></tr><tr><td>Triidrofluoruro di trietilammina, 98%</td><td>Aldrich</td><td>73602-61-6</td><td></td></tr><tr><td>Acido trifluoroacetico, 99%</td><td>Alfa Aesar</td><td>76-05-1</td><td></td></tr><tr><td>6'-Triidrossiacetofenone monoidrato 98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>480-66-0</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP154-3</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Fisher Scientific</td><td>U15-3</td><td></td></tr><tr><td>Reagenti per la sintesi dell'RNA: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deblocking mix, acido tricloroacetico al 3% in diclorometano</td><td>Glen Research</td><td>&nbsp; 40-4140-57</td><td></td></tr><tr><td>Cap Mix A, THF / Piridina / Anidride acetica</td><td>Glen Research</td><td>40-4110-52</td><td></td></tr><tr><td>Cap Mix B, 10% 1-metilimidazolo in THF</td><td>Glen Research</td><td>40-4120-52</td><td></td></tr><tr><td>Attivatore, 0,25 M 5-etiltio-1H-tetrazolo in acetonitrile anidro</td><td>Glen Research</td><td> 30-3140-52</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione ossidante, 0,02 M di iodio in THF/Piridina/Acqua</td><td>Glen Research</td><td>40-4330-52</td><td></td></tr><tr><td>U-RNA-CPG</td><td>Glen Research</td><td>20-3330-xx</td><td></td></tr><tr><td>Ac-G-RNA-CPG&nbsp;</td><td>Glen Research</td><td>20-3324-xx</td><td></td></tr><tr><td>Ac-G-CE Fosforamidite&nbsp;</td><td>Glen Research</td><td>10-3025-xx</td><td></td></tr><tr><td>U-CE Fosforamidite</td><td>Glen Research</td><td>10-3030-xx</td><td></td></tr><tr><td>Ac-C-CE Fosforamidite</td><td>Glen Research</td><td>10-3015-xx</td><td></td></tr><tr><td>Bz-A-CE Fosforamidite&nbsp;</td><td>Glen Research</td><td>10-3003-xx</td><td></td></tr></tbody></table>

protocollo per la sintesi in fase solida di oligomeri di rna contenente un 2&#39;-<em&gt; o</em&gt; -thiophenylmethyl modifica e caratterizzazione attraverso il dicroroo circolare

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

La sintesi a fase solida è stata utilizzata per ottenere polimeri canonici e modificati di acidi nucleici, in particolare di DNA o RNA, che lo ha reso una metodologia popolare per applicazioni in vari settori e per scopi diversi di ricerca. La procedura qui descritta si concentra sulla sintesi, la purificazione e la caratterizzazione di dodecameri di RNA 5 &#39;- [CUA CGG AAU CAU] -3&#39; contenenti zero, una o due modifiche situate alla posizione C2&#39;- O . Le sonde sono basate sui gruppi 2-tiofenilmetilici, incorporati in nucleotidi RNA tramite la sintesi organica standard e introdotti nei corrispondenti oligonucleotidi attraverso i loro rispettivi fosforamiditi. Questo rapporto si avvale di fosforammidite chimica attraverso i quattro basi azotate canoniche (uridina (U), citosina (C), guanosina (G), l&#39;adenosina (A)), nonché 2-thiophenylmethyl nucleotidi modificati funzionalizzati al 2&#39;- O - posizione; Tuttavia, la metodologia è amenable per un grande varLe modifiche che sono state sviluppate nel corso degli anni. Gli oligonucleotidi sono stati sintetizzati su un supporto a vetrino controllato (CPG) seguito da scissione dalla resina e deprotezione in condizioni standard, vale a dire una miscela di ammoniaca e metilammina (AMA) seguita da idrogeno fluoruro / trietilammina / N-metilpirrolidinone. I corrispondenti oligonucleotidi sono stati purificati mediante elettroforesi in poliacrilammide (denaturazione del 20%) seguita da eluizione, disidratazione e isolamento mediante cromatografia a fase inversa (Sep-pak, C 18- colonna). Quantificazione e parametri strutturali sono stati valutati, rispettivamente, mediante l&#39;analisi fotometrica a raggi ultravioletti (UV-vis) e circolare dichroismo (CD). Questo rapporto mira a servire come risorsa e guida per i principianti e per i ricercatori esperti interessati ad intraprendere questo settore. Si prevede di essere un lavoro in corso, in quanto si sviluppano nuove tecnologie e metodologie. La descrizione delle metodologie e delle tecniche in essoS corrispondono a un DNA / RNA sintetizzatore (rinnovato e acquistato nel 2013) che utilizza la chimica di fosforamidite.

Viene descritta la sintesi di dodecameri RNA contenenti zero, uno o due modificazioni 2-tiofenilmetilico alla posizione C2&#39;- O, insieme alla sua corrispondente purificazione e caratterizzazione. Inoltre, è inclusa una descrizione dettagliata dell&#39;analisi strutturale eseguita tramite CD. I quattro fili di RNA (incluso uno strato con una sequenza complementare) sono stati ottenuti mediante sintesi a fase solida,...

Questo articolo fornisce una procedura dettagliata sulla sintesi a fase solida, la purificazione e la caratterizzazione di dodecameri di RNA modificati nella posizione C2&#39;- O . Le analisi fotometriche UV-vis e dicroismo circolare sono utilizzate per quantificare e caratterizzare gli aspetti strutturali, cioè singoli fili o doppioni.

Protocollo per la sintesi in fase solida di oligomeri di RNA contenente un 2&#39;-<em&gt; O</em&gt; -thiophenylmethyl Modifica e caratterizzazione attraverso il Dicroroo circolare

Solid-phase synthesis has been used to obtain canonical and modified polymers of nucleic acids, specifically of DNA or RNA, which has made it a popular ...

L'obiettivo generale di questo rapporto è illustrare la procedura per ottenere oligonucleotidi di RNA mediante sintesi in fase solida. Saranno sintetizzati dodecameri di RNA come modelli e verranno inoltre mostrate la loro purificazione e caratterizzazione. Grazie al suo componente visivo, questa pubblicazione amplierà la portata delle metodologie e delle attrezzature utilizzate per i ricercatori in diversi campi.Fornire un ausilio visivo, insieme a un breve protocollo, permetterà ai ricercatori di impiegare queste tecniche. Un vantaggio di questa tecnica è la sua adattabilità a un'ampia gamma di modifiche. Poiché le applicazioni odierne diventano sempre più complesse, è fondamentale disporre di un protocollo standard.La chimica dei fosforamiditi sta vivendo una rinascita grazie alla robustezza del metodo e al suo potenziale per ottenere oligonucleotidi per applicazioni terapeutiche. Sebbene l'acquisto di oligonucleotidi sia allettante, il prezzo e la disponibilità delle modifiche spostano l'interesse verso la preparazione di questi oligomeri in laboratorio, rendendo così questa procedura di fondamentale importanza. Per iniziare questa procedura, pesare ciascun fosforamidite in bottiglie ambrate da 10 millilitri precedentemente essiccate in forno e chiudere ogni bottiglia con un setto precedentemente perforato con un ago da 20 gauge.Posizionare immediatamente le bottiglie sotto vuoto utilizzando un desiccator contenente un agente essiccante. Dopo aver riempito il desiccator con argon secco, rimuovere ogni bottiglia e aggiungere immediatamente acetonitrile anidro prima di fissarla su un sintetizzatore peptidico in fase solida. Successivamente, rimuovere i setti da ciascuna bottiglia e posizionarla sul sintetizzatore mediante la funzione di cambio bottiglia.Per configurare la sintesi in fase solida, selezionare l'icona del software. Selezionare il nome del sintetizzatore e fare clic su OK. Successivamente, creare una nuova sintesi selezionando File e Nuovo Ordine di Sintesi. A questo punto, utilizzare la finestra di dialogo per inserire la data dell'esecuzione, il cliente e l'ID dell'esecuzione. Selezionare lo strumento, il nome della sequenza e la sequenza stessa.Nella scheda Ciclo, assegnare il metodo creato in precedenza. Quindi, selezionare la procedura manuale End Procedure, che lascia l'oligonucleotide legato alla resina CPG. Selezionare DMT Off.Salvare il file selezionando File e Salva con nome. Quindi, assegnare un nome all'esperimento e fare clic su Salva. Successivamente, inviare il file per avviare la sintesi selezionando Ordine e Invia ordine al sintetizzatore. Nella finestra di richiesta, selezionare una posizione di colonna e fare clic su OK. Nella finestra del sintetizzatore, selezionare Monitoraggio Trityl.Fare clic su Scegli Funzione e monitorare ogni passaggio del tritile digitando 1. Avviare la sintesi selezionando Sintetizzatore e Prepararsi a Iniziare. Posizionare le colonne con l'estremità tre-prime desiderata sulle posizioni indicate sullo strumento.Quindi, fare clic su Start e No sull'apparecchiatura. Al termine della sintesi, rimuovere la colonna dall'apparecchiatura e posizionarla in un pallone a fondo rotondo. Asciugare la colonna sotto pressione ridotta per circa 0,5 ore.Trasferire la resina bianca dalla colonna a un tubo da centrifuga da 1,6 millilitri e aggiungere 0,5 millilitri di una soluzione acquosa di metilammina e ammoniaca. Sigillare il cappuccio del tubo da centrifuga con parafilm e riscaldare il contenuto a 60 gradi Celsius per un'ora e mezza. Posizionare un oggetto pesante sopra i tubi per garantire che la concentrazione rimanga costante.Dopo aver raffreddato a temperatura ambiente, centrifugare brevemente il campione per far sedimentare il contenuto. Successivamente, trasferire il soprannatante in un nuovo tubo da centrifuga. Raffreddare il tubo a 70 gradi Celsius ponendolo in un bagno di etanolo con ghiaccio secco per cinque minuti, quindi concentrare fino a essiccazione utilizzando un concentratore a vuoto.Ora, risospendere i solidi in 0,4 millilitri di una soluzione di triidrofluoruro di ammina e quindi fissare il tappo con pellicola da laboratorio. Riscaldare la soluzione a 60 gradi Celsius per un'ora e mezza. Posizionare un oggetto pesante sopra le provette per garantire una concentrazione costante.Dopo aver raffreddato la soluzione a temperatura ambiente, aggiungere 0,04 millilitri di una soluzione di acetato di sodio seguiti da un'accurata miscelazione con la punta di una pipetta. Aggiungere un millilitro di etanolo e raffreddare la soluzione a circa 70 gradi Celsius utilizzando un bagno di etanolo e ghiaccio secco per 15 minuti. Successivamente, centrifugare la soluzione a 15.000 giri al minuto a quattro gradi Celsius per dieci minuti.Utilizzare una pipetta per prelevare il soprannatante ed essiccare il pellet risultante sotto pressione ridotta. Dopo l'essiccazione, risospendere il solido ottenuto in un buffer di carico e mescolare fino a ottenere una soluzione omogenea. Quindi, caricare la sospensione su un gel di poliacrilamide precedentemente preparato.Applicare una corrente attraverso il gel fino a quando il marcatore di blu di bromotimolo si trova tra la metà e i due terzi del gel. Dopo aver rimosso il gel dal supporto, trasferire il contenuto del gel dal vetro alla pellicola di plastica e posizionarlo su una piastra per cromatografia su strato sottile ricoperta di silice, per visualizzare le bande utilizzando una lampada UV. Utilizzare un pennarello per delimitare la posizione in cui si trova la banda superiore e tagliarla con una lametta.Posizionare il gel contenente l'RNA in un tubo conico da 50 millilitri e frantumarlo in piccoli pezzi utilizzando una bacchetta di vetro. Successivamente, sospendere i residui di gel in una soluzione acquosa di cloruro di sodio e agitare la sospensione a 37 gradi Celsius per 12 ore. Trasferire la sospensione in un tubo da 15 millilitri e quindi centrifugare a 3400 giri al minuto per dieci minuti.Per desalinare il campione utilizzando una cartuccia a fase inversa C18, lavare prima la cartuccia con acetonitrile, acqua, cloruro di ammonio acquoso e la soluzione di RNA, lasciando i residui di gel. Dopo il lavaggio con acqua, eluire l'RNA dalla colonna utilizzando tre millilitri di soluzione acquosa di metanolo al 60% in tre provette diverse. Raffreddare le provette a 70 gradi Celsius in un bagno di ghiaccio secco per cinque minuti, quindi concentrare il contenuto fino a completa essiccazione utilizzando un concentratore a vuoto.Dopo aver concentrato l'eluito sotto pressione ridotta, ricongelare il residuo in 0,3 millilitri di acqua priva di RNasi. Dopo aver diluito la soluzione, depositare un microlitro sullo strumento UV-vis per misurare lo spettro UV-vis tra 200 e 450 nanometri. Per l'analisi MALDI-TOF, lavare innanzitutto una punta di pipetta C18 con acetonitrile al 50%.Equilibrare la punta della pipetta con acido trifluoroacetico allo 0,1%. Successivamente, caricare la punta della pipetta con una soluzione contenente da 100 a 150 picomoli di campione. Dopo aver lavato la punta della pipetta con TFA allo 0,1% e acqua, eluire il campione in una soluzione contenente la matrice desiderata.Depositi 0,9 microlitri della soluzione su una piastra MALDI e lasci asciugare il campione. Per l'analisi della struttura dell'RNA, trasferisca il campione contenente RNA in una microcuvetta e posizionilo nel portacampioni di uno strumento a circolare dicromia. Apra la bombola di azoto per fornire un flusso che sposti il galleggiante dell'aria presente sullo strumento a circa 40.Quindi, accendere il refrigeratore. Ora, accendere lo strumento. Aprire il software facendo clic sull'icona di Spectrum Manager e quindi aprire la finestra di acquisizione facendo clic su Misurazione spettrale.Dopo aver purgato lo strumento con azoto, acquisire gli spettri di dicromia circolare selezionando Misura e Parametri. Nella scheda Generale, selezionare 200-350 nanometri per la scansione, CD e HT per i canali, 0,1 nanometri per l'intervallo dati, 100 nanometri al minuto per la velocità di scansione, un nanometro per la larghezza di banda e cinque per il numero di accumulazioni. Nella scheda Unità Cuvetta, scegliere 20 gradi Celsius.Nella scheda Controllo, selezionare "L'otturatore viene aperto e chiuso automaticamente". Nella scheda Informazioni, inserire il nome del campione, l'operatore, la concentrazione e il solvente. Nella scheda Dati, individuare la cartella desiderata e fare clic su OK. Acquisire gli spettri facendo clic su Misura e Misurazione del campione.Infine, identificare le posizioni delle cuvette nel portacampioni da uno a sei e fare clic su OK. Le quattro catene di RNA sono state ottenute mediante sintesi in fase solida e, dopo la purificazione, hanno prodotto da 300 a 700 nanomoli di ciascun oligonucleotide. I cromatogrammi MALDI-TOF degli oligonucleotidi sono mostrati qui. Non si osserva alcuna differenza significativa negli spettri UV-vis normalizzati confrontando il picco a 260 nanometri tra oligonucleotidi canonici e modificati, sia nei campioni a singolo filamento che nelle strutture a doppio filamento.Tuttavia, si osservano lievi variazioni durante la misurazione dei loro spettri di dicromismo circolare. Inoltre, le misurazioni della temperatura di fusione (Tm) delle tre strutture duplex hanno mostrato un valore distinto, indicativo della destabilizzazione indotta dall'incorporazione della modificazione di fenilmetile a due prime othyo su uno dei filamenti. È importante ricordare che la resa della sintesi in fase solida dipende dalla purezza dei reagenti.L'umidità avrà un impatto negativo su ogni passaggio, poiché la quantità di acqua presente deve essere controllata in ogni momento. La metodologia descritta ha lo scopo di rappresentare una risorsa generale per i ricercatori. La tecnica può variare a seconda della modifica desiderata, dello strumento disponibile o dei vincoli di tempo.Il tipo di chimica utilizzato in questo contesto rappresenta una metodologia molto robusta, in uso sin dagli anni '80, e ancora ampiamente impiegata in ambiti accademici e industriali. Dopo aver visto questo video, dovresti essere in grado di eseguire la sintesi, la purificazione e il caratteramento di oligonucleotidi modificati o canonici di RNA o DNA. Non dimenticare che lavorare con i reagenti necessari può comportare rischi, pertanto è indispensabile indossare sempre dispositivi di protezione come occhiali di sicurezza, guanti e camici da laboratorio.Tutti i reagenti devono essere maneggiati con cautela e all'interno di una cappa aspirante quando appropriato.

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Qui presentiamo un protocollo per dimostrare un metodo efficiente per la sintesi di eterocicli spirocyclic. Sintesi in fase solida e rigenerante strategie del linker Michael utilizza il processo in cinque fasi. Generalmente difficili da sintetizzare, presentiamo un metodo personalizzabile per la sintesi di molecole spirocyclic altrimenti inaccessibili ad altri approcci moderni.

Sintesi in fase solida di [4,4] Spirocyclic ossime

Qui, descriviamo l'assemblaggio di complessi di allungamento della polimerasi RNA II (Pol II) che richiedono solo brevi oligonucleotidi di DNA sintetico e RNA e Pol II purificati. Questi complessi sono utili per studiare i meccanismi alla base dell'elaborazione co-trascrizione delle trascrizioni associate al complesso di allungamento di Pol II.

Complessi di allungamento dell'RNA artificiale Polymerase II per eventi di elaborazione dell'RNA co-trascrizione

Qui presentiamo un protocollo per la scissione dell'RNA dipendente da DNAzyme. Ciò consente un'analisi rapida e dipendente dal sito dell'RNA 2'-O-metilazione. Questo approccio può essere utilizzato per la valutazione preliminare o importante dell'attività dello snoRNA.

Analisi dipendente da DNAzyme del rRNA 2'-O-Metilazione

Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per un metodo di sequenziamento basato su LC-MS che può essere utilizzato come metodo diretto per sequenziare RNA corto (&lt;35 nt per corsa) senza un intermedio di cDNA e come metodo generale per sequenziare diverse modifiche nucleotidiche in un singolo studio con precisione a base singola.

2D-HELS MS Seq: Un metodo generale basato su LC-MS per il sequenziamento diretto e de novo di miscele di RNA con diverse modifiche nucleotidiche

Presentiamo un protocollo per misurare la dinamica da micro a millisecondo su 13C/15RNA N-labeled e unlabel con spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) a dispersione di rilassamento 1H R1ρ.  Il focus di questo protocollo risiede nella preparazione di campioni ad alta purezza e nella configurazione di esperimenti NMR.

Aspetti pratici della preparazione del campione e della configurazione di 1H R1ρ Esperimenti di dispersione di rilassamento dell'RNA

Gli oligonucleotidi 5′-trifosfati sono componenti onnipresenti nei percorsi biologici essenziali e hanno visto un uso crescente nelle applicazioni biotecnologiche. Qui descriviamo le tecniche per la sintesi e la purificazione di routine degli oligonucleotidi 5′-trifosfati, a partire da oligonucleotidi preparati con tecniche di sintesi automatizzate standard.

Trifosforilazione chimica degli oligonucleotidi

Impara la sintesi in fase solida di oligomeri di RNA dodecamerici con modifiche 2'-O-tiofenilmetiliche. Questo protocollo dettagliato include purificazione e caratterizzazione mediante dicroroo circolare per la chimica degli acidi nucleici.

Protocollo per la sintesi in fase solida di oligomeri di RNA contenente un 2- O -thiophenylmethyl Modifica e caratterizzazione attraverso il Dicroroo circolare (Video) | JoVE Journal

Protocollo per la sintesi in fase solida di oligomeri di RNA contenente un 2'-

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