Riconoscimento di sequenza-specifico e selettivo di Double-stranded RNA sopra Single-stranded RNA da modificati chimicamente acidi peptido nucleici

L'obiettivo generale di questo articolo sui metodi è quello di introdurre i protocolli dettagliati utilizzati dal nostro laboratorio per studiare il riconoscimento molecolare di RNA a doppio filamento da parte di acidi nucleici peptidici chimicamente modificati. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia chimica dell'RNA, come il rilevamento e il targeting delle strutture dell'RNA. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i principi di progettazione possono essere applicabili al targeting di qualsiasi struttura duplex di RNA.

A dimostrare la procedura sarà Desiree Toh, una ricercatrice associata del mio laboratorio. Per iniziare questa procedura, aggiungere quattro microlitri di una soluzione di glicerolo al 35% ai campioni di RNA PNA precedentemente preparati e mescolare delicatamente. Utilizzando una micropipetta e punte di caricamento del gel, trasferire con cura 20 microlitri di ciascun campione in un gel di poliacrilammide precedentemente preparato facendo attenzione a non introdurre bolle d'aria.

Far funzionare il gel a una tensione costante di 250 volt per cinque ore. Dopo cinque ore, spegnere l'alimentazione e rimuovere la lastra di vetro dal supporto per gel. Quindi rimuovere il nastro sigillante in gel e smontare la lastra di vetro.

Rimuovere delicatamente il gel dalla lastra di vetro e metterlo in un contenitore riempito con 350 millilitri di acqua deionizzata. Aggiungere con cautela 35 microlitri di bromuro di etidio al contenitore e posizionarlo sullo shaker a bassa velocità per 30 minuti. Dopo aver smaltito la soluzione di bromuro di etidio, sciacquare il gel con 1,5-2 litri di acqua distillata.

Quindi scansiona il gel utilizzando un imager con un laser verde di 532 nanometri e il filtro di emissione impostato a 610 nanometri. Quantifica le intensità della banda di gel utilizzando un software gratuito. Trasferire la quantità appropriata di RNA a doppio filamento marcato con 2-amminopurina in una provetta pulita da 1,5 millilitri.

Quindi concentrare le soluzioni di RNA utilizzando un concentratore a vuoto. Successivamente, trasferire i volumi appropriati del PNA mirato per varie concentrazioni dallo stock principale precedentemente preparato a provette separate da 1,5 millilitri. Concentrare le soluzioni di PNA utilizzando il concentratore sotto vuoto.

Aggiungere 975 microlitri di tampone di incubazione alla provetta contenente l'RNA essiccato e mescolare accuratamente per garantire che tutto l'RNA sia disciolto. Dopo aver centrifugato brevemente la soluzione di RNA, sottoporla a ricottura posizionando la provetta in un blocco termico preriscaldato per 10 minuti. Al termine, spegnere il blocco termico e lasciare raffreddare il campione a temperatura ambiente.

Aggiungere 75 microlitri di RNA a ciascuna delle provette contenenti il PNA essiccato e mescolare accuratamente. Dopo aver lasciato riposare i campioni a temperatura ambiente per almeno un'ora, incubarli a quattro gradi Celsius durante la notte. Ora, trasferire le quantità appropriate di RNA a filamento singolo marcato con 2-amminopurina in provette separate da 1,5 millilitri.

Trasferire i volumi appropriati di PNA mirato per varie concentrazioni dallo stock principale alle rispettive provette contenenti l'RNA a filamento singolo. Dopo aver asciugato i campioni, aggiungere 75 microlitri di tampone di incubazione a ciascuna delle provette e mescolare accuratamente. Sottoporre ogni campione alla ricottura posizionando ogni provetta in un blocco termico preriscaldato per 10 minuti.

Dopo aver lasciato raffreddare i campioni a temperatura ambiente, incubarli a quattro gradi Celsius durante la notte. Successivamente, trasferire 70 microlitri di ciascun campione in una cuvetta quadrata di un centimetro. Posizionare la cuvetta in uno spettrofotometro a fluorescenza e misurare l'emissione su un intervallo di lunghezze d'onda da 330 a 550 nanometri.

Una volta completata la misurazione, rimuovere il tampone dalla cuvetta. Sciacquare la cuvetta con acqua distillata e asciugarla con azoto gassoso. Dopo aver ripetuto la misurazione per tutti i campioni, tracciare l'intensità della fluorescenza rispetto alla lunghezza d'onda.

Trasferire le quantità appropriate di RNA a filamento singolo in provette separate da 1,5 millilitri. Quindi trasferire i volumi appropriati di PNA mirato dallo stock principale alle rispettive provette contenenti l'RNA a filamento singolo. Dopo aver asciugato i campioni, aggiungere 130 microlitri di tampone di incubazione a ciascuna delle provette e mescolare accuratamente.

Sottoporre ogni campione alla ricottura posizionando ogni provetta in un blocco termico preriscaldato per 10 minuti. Dopo aver lasciato raffreddare i campioni a temperatura ambiente, incubarli a quattro gradi Celsius durante la notte. A questo punto, trasferire 130 microlitri di ciascun campione in una cuvetta a otto microcelle con una cellula contenente un tampone di incubazione.

Utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis, misurare l'assorbanza di ciascun campione a 260 nanometri. Misurare a una temperatura crescente da 15 a 95 gradi Celsius seguita da una temperatura decrescente da 95 a 15 gradi Celsius a una velocità di rampa di 0,5 gradi Celsius al minuto. Gli oligomeri di PNA sono stati ottenuti dopo due purificazioni HPLC in fase inversa.

L'identità dei PNA può essere confermata dall'analisi MALDI/TOF. I dati non denaturanti di PAGE suggeriscono che il PNA modificato Q e L può riconoscere la regione dell'RNA a doppio filamento solo con una coppia C-G. Questo riconoscimento specifico e potenziato avviene attraverso la formazione tripla basata su T-A-U-L-G-C e Q-C-G PNA RNA two.

Uno studio di titolazione in fluorescenza con 2-amminopurina ha dimostrato che un PNA modificato con Q e L si lega a un RNA a doppio filamento mirato, ma non all'RNA a singolo filamento. I PNA contenenti residui di Q non mostrano transizioni di fusione termica, suggerendo un'assenza di legame con l'RNA a singolo filamento a causa dello scontro sterico nella coppia Watson Watson-Crick come Q-G. Rispetto al PNA P1 non modificato, i PNA P4 e P5 contenenti residui di L mostrano una temperatura di fusione più bassa per i corrispondenti duplex di RNA PNA a causa dello scontro sterico nella coppia di Watson-Crick come L-G.

I dati di fusione termica rilevati dall'assorbanza UV sono coerenti con i dati di titolazione della fluorescenza con 2-amminopurina che mostrano anche che un PNA contenente residui di Q e L non si lega fortemente all'RNA a singolo filamento. Incorporare una base Q è più destabilizzante di una base L poiché una base Q ha uno scontro sterico più significativo nella formazione di una coppia Watson-Crick come Q-G. Una volta padroneggiati, i vari esperimenti possono essere eseguiti in una settimana se eseguiti correttamente.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come il sondaggio e il targeting delle strutture dell'RNA nelle cellule, al fine di rispondere a ulteriori domande, come la possibilità di rilevare le strutture dell'RNA e regolare le funzioni dell'RNA utilizzando PNA leganti l'RNA a doppio filamento. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia e delle malattie dell'RNA per esplorare lo sviluppo terapeutico mirato della struttura dell'RNA.