Name: Riconoscimento di sequenza-specifico e selettivo di Double-stranded RNA sopra Single-stranded RNA da modificati chimicamente acidi peptido nucleici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Scopri i protocolli per studiare il riconoscimento di RNA a doppio filamento da parte di acidi peptido nucleici modificati chimicamente. Questo metodo consente di analizzare l'interazione selettiva con strutture RNA specifiche.

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Questo lavoro è stato supportato dal Ministero di Singapore di formazione (MOE) Tier 1 (RGT3/13 e 15/RG42 al G.C.) e MOE Tier 2 (MOE2013-T2-2-024 e MOE2015-T2-1-028 di G.C.).

È stata presentata una domanda di brevetto (PAT/179/14/15/PCT) sulla base dei lavori segnalati qui.

Oligomeri PNA di RNA duplex-associazione (ad es., 10-mers) sono molecole di piccole e medie e così può mostrare spostamento di mobilità elettroforetica legandosi a RNA con una dimensione paragonabile o leggermente più grande (ad es., 50-mer o più piccoli). Se un RNA è significativamente maggiore di ANP, titolazione di PNA in RNA potrebbe non funzionare a causa di uno spostamento di mobilità limitata gel. Così, il grande RNA potrebbe essere troncato per le analisi di pagina non-denaturante. Titolazione di un grande RNA in un fluoroforo PNA consente il monitoraggio della formazione triplex da un non-denaturante del gel dell'agarosi con il campione caricato nel mezzo il gel40.
Per un esperimento di titolazione di non-denaturante pagina con una costante concentrazione totale di RNA, generalmente utilizziamo una concentrazione di RNA senza etichetta di 1 µM per efficiente post colorazione del RNA gratis e bande triplex di bromuro di etidio. Una concentrazione di RNA a partire da 0,2 µM può anche essere sufficiente a seconda del costrutto di RNA31. La concentrazione del RNA senza etichetta (0,2 µM) determina che i valori did Kpossono essere accuratamente misurati devono essere circa 0,2 µM o più grande. Altri coloranti colorazione possono essere utilizzati per migliorare l'efficienza di colorazione. In alternativa, i nostri dati non pubblicati suggeriscono che Cy3 tingere-contrassegnati RNAs utilizzabile in non-denaturante pagina esperimenti per misurare la stretta associazione di eventi.
Dovuto al fatto che è solo moderatamente fluorescente 2-aminopurine, titolazione fluorescenza 2-aminopurine è anche limitato alla misura dell'associazione con valori did Kvicino o sopra 0,2 µM31. il RNA o il PNA può essere marcato con un colorante relativamente luminoso per quantificare un'associazione relativamente stretto in soluzione mediante titolazione fluorescenza, se l'associazione si traduce in cambiamenti nella fluorescenza segnali53,54, 55.
La strategia di targeting strutture di RNA di dsRNA-associazione PNAs è stata testata per un numero limitato di RNA. È probabile che la proprietà binding può variare per dsRNA con diverse composizioni di sequenze e coppia di basi. Uno può scegliere sempre il filo di ricchi di purine di un duplex per la progettazione di TFPNAs. È fondamentale capire come consecutivi è C-G triple possono influenzare la stabilità di un triplex. Studi più approfonditi dipendente dalla sequenza chiaramente sono necessari per comprendere le proprietà di associazione dipendente dalla sequenza di TFPNAs.
L'affinità di legame di TFPNAs può essere ulteriormente migliorata aumentando la lunghezza e/o modificare ulteriormente le basi e dorsali56,57 di TFPNAs. Tuttavia, un'area duplex continua spesso non può consistere di più di 10 coppie consecutive di base senza la rottura di strutture non-Watson-Crick. Uno può coniugato TFPNAs con piccole molecole per il riconoscimento delle strutture non-Watson-Crick adiacenti alle regioni di dsRNA. In linea di principio, un coniugato di TFPNA-piccola molecola dovrebbe hanno maggiore affinità e specificità rispetto a un TFPNA o un piccola molecola da solo. Tuttavia, le proprietà chimiche e fisiche del linker per la coniugazione58,59,60,61,62,63,64 deve essere ottimizzato.
Il fatto che TFPNAs possono legarsi selettivamente a dsRNA sopra ssRNAs e dsDNAs suggerisce che è possibile sviluppare TFPNAs come sonde chimiche molto utili e terapeutici potenziali ligandi attraverso la regolazione della dinamica strutturale RNA ed interazioni con proteine e metaboliti. L'assorbimento cellulare di TFPNAs può essere facilitata attraverso la coniugazione con cellula-penetrante moiety come piccole molecole, peptidi e nanoparticelle o complessazione con strutture supramolecolari come liposomi5,6 ,12,17,25,31,41,65,66. Funzionalizzazione di TFPNAs con tag di Bioimmagini come fluorofori e radioisotopi può facilitare ulteriormente la rilevazione, di imaging e di targeting delle strutture funzionali di RNA negli organismi viventi.

RNAs stanno emergendo come biomarcatori importanti e bersagli terapeutici, dovuto gli avanzamenti recenti nella catalisi di diversi processi biologici1,2,3e le scoperte dei ruoli degli RNA nel regolamento. Tradizionalmente, i fili antisenso sono stati utilizzati per associare a ssRNAs a Watson-Crick formazione duplex3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. recentemente, triplex-formando acidi peptido nucleici (TFPNAs) sono stati progettati per associare a dsRNA via (Figura 1)3,28,29di bonding dell'idrogeno di Hoogsteen. regioni di dsRNA sono presenti nella maggior parte dei tradizionali RNA antisenso-mirati, tra cui pre-mRNA e mRNA, pre- o pri-miRNA3e molti altri non-codificazione RNAs1,26,27. RNAds attraverso formazione di tripla elica usando TFPNAs di targeting può essere vantaggioso a causa della sua specificità di struttura ed è di grande potenziale per l'uso nel ripristinare le normali funzioni degli RNA, che sono dysregulated in malattie, per esempio.
La recente pubblicazione funziona da Rozners et al.e noi3,28,29,30,31,32,33, 34,35,36,37,38,39,40,41, segnalati gli sforzi sul miglioramento il legame selettivo di modificate TFPNAs verso dsRNA con maggiore affinità. Abbiamo sviluppato metodi di sintesi per razionalmente progettati monomeri PNA (Figura 2) tra cui thio-pseudoisocytosine (L) monomero30 e guanidina-modificato 5-metil citosina (Q) monomero31. Attraverso vari metodi di caratterizzazione biochimica e biofisica, abbiamo dimostrato che PNAs relativamente breve (6-10 residui) che incorpora L e Q residui mostrano migliore riconoscimento di coppie di basi di Watson-Crick G-C e C-G, rispettivamente, di dsRNA. Inoltre, rispetto ai non modificato PNAs, PNAs contenenti residui L e Q mostrano associazione più selettivi verso dsRNA sopra ssRNA e dsDNA. La funzionalità di guanidina42 nella base Q consente PNAs entrare di cellule HeLa31.
Nel nostro laboratorio, sintetizziamo PNAs dalla Boc-chimica manuale (Boc o t- Boc acronimo di tert-butyloxycarbony (Vedi Figura 2) fase solida del peptide sintesi metodo4. La sintesi del monomero PNA con Boc come l'ammina protezione gruppo è comoda come il gruppo di Boc è stericamente meno ingombrante rispetto al fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) ammina proteggere il gruppo, che può essere utile durante il monomero PNA accoppiamento supporto solido. Il gruppo di Boc è acido-labile e può essere facilmente rimosso il supporto solido di 20-50% di acido trifluoroacetico (TFA) in diclorometano (DCM) durante la sintesi PNA. Un sintetizzatore di peptidi automatizzato può essere impiegato per sintetizzare gli oligomeri PNA; Tuttavia, eccesso di 3-5 volte di monomero PNA è necessaria per un sintetizzatore di peptidi automatizzato. Sintesi manuale richiede significativamente meno monomero PNA (2-3 volte in eccesso), con ogni accoppiamento facilmente monitorato dal Kaiser prova43. Inoltre, molti sintetizzatori automatizzati non sono compatibili con la sintesi di strategia Boc dovute all'uso di corrosivo TFA durante la fase di rimozione di Boc.
Gli oligomeri PNA possono essere purificati mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni a fase inversa (RP-HPLC) seguita dalla caratterizzazione di peso molecolare mediante MALDI-TOF (figure 3 e 4)30, 31. impieghiamo pagina non-denaturante per monitorare la formazione triplex, causa del fatto che libero duplex RNA costruisce e PNA associato triplexes spesso Mostra di migrazione diverse tariffe (Figura 5)30,31 . Nessuna etichettatura è necessaria se efficiente post-colorazione può essere raggiunto per entrambe le RNA duplex e PNA· Bande di triplex2 RNA. Una relativamente piccola quantità di campione è necessario per non-denaturante pagina esperimenti. Tuttavia, i buffer di caricamento (incubazione) e i buffer in esecuzione (pH 8.3) non possono essere lo stesso, con conseguente le misurazioni si limita a triplexes cineticamente stabile, perché un pH relativamente alto 8.3 significativamente potrebbe destabilizzare un triplex.
2-Aminopurine è un isomero di adenina (6-aminopurine); l'intensità di fluorescenza 2-aminopurine (con un picco di emissione a circa 370 nm) è sensibile ai cambiamenti di ambiente strutturale locale ed è adatto per il monitoraggio della formazione triplex con il residuo di 2-aminopurine incorporato vicino l'ANP associazione sito ( Figura 6) 31. a differenza di molti altri coloranti che mostrano l'emissione di fluorescenza nella gamma visibile, 2-aminopurine-labeled RNA possa essere esposti alla luce della stanza senza foto candeggio. A differenza di esperimento di pagina in cui è spesso necessario un buffer in esecuzione del pH 8.3, titolazione fluorescenza 2-aminopurine basata permette la misura di associazione in un'unica soluzione a pH specificato e così può consentire la misurazione e la rilevazione di relativamente debole e Associazione cineticamente instabile all'equilibrio.
Esperimenti di fusione termici UV-assorbanza-rilevato consentono la misura della stabilità termica del duplex (Figura 7)31 e triPlex30,32,44,45. A seconda della lunghezza e sequenza di composizione, lo scioglimento dei triplexes può o non può mostrare una chiara transizione. Parametri termodinamici possono essere ottenuti se le curve di riscaldamento e raffreddamento si sovrappongono. Parametri termodinamici accurati possono essere ottenuti isotermica di titolazione calorimetria (ITC)32; Tuttavia, relativamente grandi quantità di campioni sono generalmente richiesti per ITC.

<table><tbody><tr><td>Setacci molecolari, 4A, pellet di diametro 1-2 mm&nbsp;</td><td>Alfa Aesar</td><td>87956</td><td></td></tr><tr><td>4-metilbenzidrilammina cloridrato (MBHA&Yuml; HCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>532444</td><td></td></tr><tr><td>N,N-diisopropiletilamina (DIPEA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11801</td><td></td></tr><tr><td>(Benzotriazol-1-il-ossi)tripirrolidinofosfonio esafluorofosfato (PyBOP)</td><td>Alfa Aesar</td><td>B25251</td><td></td></tr> Kit di test <tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>320102</td><td></td>Kaiser per<td>anidruro acetico</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60017</td><td></td></tr><tr><td>Acido trifluoroacetico (TFA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L06374</td><td></td></tr><tr><td>Monomeri PNA non modificati</td><td>ASM Research Chemicals GmbH</td><td>5004007, 5004008, 5004009, 5004010</td><td></td></tr><tr><td>Boc-Lys(Z)-OH / Fmoc-Lys(Boc)-OH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8389 / 47624</td><td></td></tr><tr><td>Tioanisolo</td><td>Alfa Aesar</td><td>A14846</td><td></td></tr><tr><td>1,2-Ethanedithiol</td><td>Alfa Aesar</td><td>L12865</td><td></td></tr><tr><td>Acido trifluorometanosolfonico</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10173</td><td></td></tr><tr><td>LiChrosper&reg; 100 RP-18 endcapped (5 &micro; m) LiChroCART&reg; 250-4</td><td>Merck Millipore</td><td>150838</td><td></td></tr><tr><td>Oligo di RNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Personalizzato&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-ciano-4-idrossicinnamico (CHCA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39468</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>J15694</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>Acrilammide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8887</td><td></td></tr><tr><td>N.N'-metilenbisacrilammide</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>146072</tr><tr><td>Persolfato di ammonio (APS)</td><td>Bio-rad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametiletilendiammina (TEMED)</td><td>Bio-rad</td><td>161-0800</td><td></td></tr><tr><td>10X Tris-Borato-EDTA (TBE) Tampone, pH 8.3</td><td>1a base</td><td>BUF-3010-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo&nbsp;</td><td>Promega&nbsp;</td><td>H5433</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro di etidio (10 mg/mL)</td><td>Bio-rad&nbsp;</td><td>161-0433</td><td></td></tr><tr><td>Cella ad alta precisione (quarzo suprasil, 200-2500 nm)</td><td>Hellma Analytics&nbsp;</td><td>105.250-QS</td><td></td></tr></tbody></table>

riconoscimento di sequenza-specifico e selettivo di double-stranded rna sopra single-stranded rna da modificati chimicamente acidi peptido nucleici

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

RNAs stanno emergendo come biomarcatori importanti e bersagli terapeutici. Così, c'è grande potenziale nello sviluppo di sonde chimiche e terapeutiche ligandi per il riconoscimento della sequenza di RNA e struttura. Modificati chimicamente Peptide degli acidi nucleici (PNA) oligomeri sono state recentemente sviluppati in grado di riconoscere RNA duplex in modo sequenza-specifico. I PNA sono chimicamente stabili con una dorsale di peptide-come neutra. PNAs possono essere sintetizzati relativamente facilmente dal metodo di sintesi del peptide di fase solida Boc-chimica manuale. PNA è purificati mediante HPLC in fase inversa, seguita dalla caratterizzazione di peso molecolare in matrix-assisted laser desorption/ionizzazione-tempo di volo (MALDI-TOF). Non-denaturante del gel di poliacrilammide tecnica di elettroforesi (pagina) facilita l'imaging della formazione triplex, perché attentamente progettato gratis RNA duplex costruisce e PNA associato triplexes spesso tassi di migrazione diversi Visualizza. PAGINA non-denaturante con etidio bromuro post colorazione spesso è una tecnica facile ed informativa per caratterizzare l'affinità di legame e la specificità degli oligomeri PNA. In genere, più RNA forcine o duplex con singola coppia di basi mutazioni utilizzabile per caratterizzare le proprietà di associazione di PNA, come l'associazione affinità e specificità. 2-Aminopurine è un isomero di adenina (6-aminopurine); l'intensità di fluorescenza 2-aminopurine è sensibile ai cambiamenti di ambiente strutturale locale ed è adatto per il monitoraggio della formazione triplex con il residuo di 2-aminopurine incorporato nei pressi del sito di associazione di PNA. Titolazione fluorescenza 2-Aminopurine può essere utilizzato anche per confermare la selettività di associazione dei PNA modificate verso mirati RNA double-stranded (dsRNA) sopra RNA a singolo filamento (ssRNAs). Esperimenti di fusione termici UV-assorbanza-rilevato consentono la misura della stabilità termica di PNA-RNA duplex e PNA· Triplexes2 di RNA. Qui, descriviamo la sintesi e purificazione degli oligomeri PNA che incorporano modificato residui e descrivere i metodi biochimici e biofisici per la caratterizzazione del riconoscimento del RNA duplex dal PNAs modificate.

HPLC di inverso-fase permette la purificazione degli oligomeri PNA. Possiamo ottenere puri oligomeri PNA con due turni di purificazione HPLC (Figura 3). L'identità dei PNA può essere confermata dalle analisi MALDI-TOF (Figura 4).
PAGINA non-denaturante è una tecnica facile ed informativa per caratterizzare l'affinità di legame e la specificità degli oligomeri PNA. In genere utilizziamo più RNA forcine o duplex con mutazioni di singola coppia di basi per caratterizzare le proprietà di associazione (Figura 5). I dati della pagina non-denaturante illustrati nella Figura 5 indicano chiaramente che il Q - e L-modificato PNA può riconoscere una regione di dsRNA con una C-G la coppia (Figura 5B, pannello inferiore) ma non l'uno senza un paio di C-G (Figura 5B, top pannello). Questo riconoscimento specifico e migliorato è attraverso il T· A-U, L · G-C ed è C-G PNA· Formazione di RNA2 triple base (Figura 1A, C, D). PNAs vari con le mutazioni di singole o multipli può essere utilizzato anche per dimostrare le proprietà di associazione migliorata di un PNA modificato. Abbiamo dimostrato che l'aggiunta di 2 mM Mg2 + in tampone di incubazione non pregiudica l'associazione significativamente31.
Abbiamo dimostrato di titolazione fluorescenza 2-aminopurine che un PNA Q - e L-modificato si lega a una regione di dsRNA mirati (Figura 6A, 6C, 6D) ma non ssRNA (Figura 6B, 6E, 6F). PNA P3 associa il dsRNA 2-aminopurine-etichettati con un valore did Kdi 0,8 ± 0,1 µM. L'intensità della fluorescenza a 370 nm per il 2-aminopurine-labeled ssRNA rimane relativamente costante con varia concentrazione P3, che indica la mancanza di associazione di PNA P3 per il ssRNA.
PNAs contenente Visualizza residui (P2 e P3) Q no thermal transizioni (Figura 7), non suggerendo vincolante per il ssRNA di fusione. Ciò è dovuto lo scontro sterico presente a Watson-Crick come Q-G la coppia. Rispetto al non modificato PNA P1, PNAs P4 e P5 contenente modificato L residui ma senza residui di Q, Visualizza diminuito temperature di fusione per i duplex RNA-PNA corrispondente a causa dello scontro sterico presente a Watson-Crick come L-G la coppia. I dati di fusione termici UV-assorbanza-rilevato sono coerenti con i dati di titolazione fluorescenza 2-aminopurine, che mostrano anche che un PNA contenenti residui di Q e L non associare a ssRNA sensibilmente (Figura 6B, 6E, 6F). Incorporando una base di Q è più destabilizzante di una base di L, una base di Q ha un scontro sterico più significativo nella formazione di una coppia di Watson-Crick-come Q-G (Figura 1F) rispetto ad una coppia di Watson-Crick-come L-G (Figura 1E ).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig1v2.jpg"> 
Figura 1 : Strutture chimiche delle strutture di base triple e instabile base stabile coppia. (A-D) Major-groove PNA· Triple base di RNA2 di T· A-U (A), C+· G-C (B), l · G-C (C) ed è C-G (D). (E, F) Watson-Crick instabile come coppie di basi di PNA-RNA di L-G (E) e Q-G (F). La lettera R rappresenta la spina dorsale di zucchero-fosfato del RNA. Legami dell'idrogeno sono indicate da linee nere tratteggiate. La figura è riprodotto dal riferimento31. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig2v2.jpg"> 
Figura 2 : Struttura chimica dei monomeri PNA. Vengono visualizzati quattro monomeri PNA (T, C, L e Q). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig3.jpg"> 
Figura 3 : Struttura chimica di un oligomero PNA e purificazione mediante RP-HPLC. (A) struttura chimica della sequenza PNA P3. (B, C) Dati di RP-HPLC di greggio PNA P3 (B) e ri-purificato PNA P3 (C). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig4.jpg"> 
Figura 4 : Spettro MALDI-TOF di purificato PNA P3. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig5.jpg"> 
Figura 5 : Hairpin RNA e sequenze di PNA e caratterizzazione di associazione di non-denaturante pagina. Forcine per capelli (A), RNA (rHP1 e rHP2), PNA P3 e un PNA· RNA2 triplex formate tra PNA P3 e rHP2. (B) Non-denaturante pagina (12%) risultati per rHP1 e rHP2 associazione a PNA P3. Il tampone di incubazione è di 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7.5. Le forcine di RNA caricate (rHP1 e rHP2) sono a 1 µM a 20 µ l. Le concentrazioni di PNA in corsie da sinistra a destra sono 0, 0,2, 0,4, 1, 1.6, 2, 4, 10, 16, 20, 28, e 50 µM. PNA P3 non associare a rHP1 (pannello superiore) ma si lega al rHP2 (pannello inferiore). (C) Kd determinazione per l'associazione di P3 a rHP2. La frazione di formazione triplex (Y) è stata tracciata contro la concentrazione di PNA. La figura è adattata da riferimento31. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig6.jpg"> 
Figura 6 : Studio di titolazione fluorescenza di PNA P3 associazione2-aminopurine-labeled RNAs. Il residuo di 2-aminopurine è designato come '2' nella sequenza di RNA. Il tampone di incubazione è di 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7.5. (A) un PNA· RNA2 triplex formate tra P3 e un 2-aminopurine-labeled dsRNA (dsRNA2-2AP). (B), un ipotetico duplex PNA-RNA formata tra P3 e un 2-aminopurine-labeled ssRNA (ssRNA2-2AP). (C, E) Spettri di emissione di fluorescenza per il 2-aminopurine-labeled RNA duplex (1 µM) e ssRNA (1 µM), rispettivamente, con varie P3 concentrazione a pH 7.5. Il picco a circa 475 nm è dovuto l'emissione di fluorescenza debole della base L in ANP. (D, F) K d determinazione basata su appezzamenti di intensità di fluorescenza 2-aminopurine (370 nm) di RNA duplex e ssRNA, rispettivamente, contro concentrazione di PNA P3. La figura è adattata da riferimento31. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig7.jpg"> 
Figura 7 : Thermal fusione risultati per Duplex RNA-PNA. Il tampone di incubazione è di 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20mm NaH2PO4, pH 7.5. Tutti i campioni contengono 5 µM di singoli filamenti di RNA (ssRNA1) e PNA in 130 µ l. (A) Single-stranded RNA (ssRNA1), PNAs (P1, P2, P3, P4 e P5) e un ipotetico duplex PNA-RNA formata tra PNA P3 e ssRNA1 in un orientamento parallelo. Lo scontro sterico è indicato per la Watson-Crick come Q-G e coppie di L-G. (B) fusione delle curve per diversi PNAs associazione a ssRNA1. Le temperature di fusione sono indicate per le curve con transizioni di fusione. La figura è adattata da riferimento31.

Segnaliamo i protocolli per la sintesi e purificazione degli oligomeri di Peptide degli acidi nucleici (PNA) che incorporano per volta residui. Sono descritti i metodi biochimici e biofisici per la caratterizzazione del riconoscimento del RNA duplex dal PNAs modificate.

Riconoscimento di sequenza-specifico e selettivo di Double-stranded RNA sopra Single-stranded RNA da modificati chimicamente acidi peptido nucleici

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

L'obiettivo generale di questo articolo sui metodi è presentare le procedure dettagliate utilizzate nel nostro laboratorio per lo studio del riconoscimento molecolare di RNA a doppio filamento da parte di acidi peptidici nucleici modificati chimicamente. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia chimica dell'RNA, come il rilevamento e il targeting di strutture dell'RNA. Il principale vantaggio di questa tecnica è che i principi di progettazione possono essere applicabili al targeting di qualsiasi struttura a doppio filamento di RNA.La procedura sarà dimostrata da Desiree Toh, un'assistente di ricerca del mio laboratorio. Per iniziare la procedura, aggiungere quattro microlitri di una soluzione al 35% di glicerolo ai campioni di RNA-PNA precedentemente preparati e mescolare delicatamente. Utilizzando una micropipetta e punte per caricamento di gel, aggiungere con attenzione 20 microlitri di ciascun campione a un gel di poliacrilamide precedentemente preparato, assicurandosi di non introdurre bolle d'aria.Eseguire l'elettroforesi su gel a una tensione costante di 250 volt per cinque ore. Trascorse cinque ore, spegnere l'alimentatore e rimuovere la lastra di vetro dal supporto del gel. Successivamente, rimuovere il nastro sigillante del gel e smontare la lastra di vetro.Rimuovere delicatamente il gel dalla lastra di vetro e collocarlo in un contenitore riempito con 350 millilitri di acqua deionizzata. Aggiungere con attenzione 35 microlitri di bromuro di etidio al contenitore e posizionarlo sullo shaker a piattaforma a bassa velocità per 30 minuti. Dopo aver smaltito la soluzione di bromuro di etidio, risciacquare il gel con 1,5 a due litri di acqua distillata.Quindi scansionare il gel utilizzando un sistema di imaging con un laser verde a 532 nanometri e un filtro di emissione impostato a 610 nanometri. Quantificare le intensità delle bande del gel mediante software gratuito. Trasferire la quantità appropriata di RNA bicatenario marcato con 2-aminopurina in un tubo pulito da 1,5 millilitri.Quindi concentrare le soluzioni di RNA utilizzando un concentratore a vuoto. Successivamente, trasferire i volumi appropriati della PNA bersaglio per diverse concentrazioni dal relativo stock principale precedentemente preparato in provette separate da 1,5 millilitro. Concentrare le soluzioni di PNA utilizzando il concentratore a vuoto.Aggiungere 975 microlitri di buffer di incubazione al tubo contenente l'RNA liofilizzato e mescolare accuratamente per assicurare che tutto l'RNA sia disciolto. Dopo una breve centrifugazione della soluzione di RNA, sottoporla ad annealing ponendo il tubo in un blocco termico preriscaldato per 10 minuti. Al termine, spegnere il blocco termico e lasciare raffreddare il campione a temperatura ambiente.Aggiungere 75 microlitri di RNA a ciascuna delle provette contenenti il PNA essiccato e mescolare accuratamente. Dopo aver lasciato riposare i campioni a temperatura ambiente per almeno un'ora, incubarli a quattro gradi Celsius durante la notte. Ora, trasferire le quantità appropriate di RNA monocatenario marcato con 2-aminopurina in provette separate da 1,5 millilitro.Trasferire i volumi appropriati di PNA mirati per diverse concentrazioni dallo stock principale nei rispettivi tubi contenenti l'RNA a singolo filamento. Dopo l'essiccazione dei campioni, aggiungere 75 microlitri di buffer di incubazione a ciascun tubo e mescolare accuratamente. Sottoporre ciascun campione ad annealing ponendo ogni tubo in un blocco riscaldante preriscaldato per 10 minuti.Dopo aver lasciato raffreddare i campioni a temperatura ambiente, incubarli a quattro gradi Celsius durante la notte. Successivamente, trasferire 70 microlitri di ogni campione in una cuvetta quadrata di un centimetro. Posizionare la cuvetta in un fluorimetro e misurare l'emissione nell'intervallo di lunghezze d'onda compreso tra 330 e 550 nanometri.Al termine della misurazione, rimuovere il tampone dalla cuvetta. Sciacquare la cuvetta con acqua distillata e asciugare con gas azoto. Dopo aver ripetuto la misurazione per tutti i campioni, riportare l'intensità di fluorescenza in funzione della lunghezza d'onda.Trasferire le quantità appropriate di RNA a filamento singolo in provette separate da 1,5 millilitri. Successivamente, trasferire i volumi appropriati di PNA mirato dalla soluzione madre nelle rispettive provette contenenti l'RNA a filamento singolo. Dopo aver essiccato i campioni, aggiungere 130 microlitri di buffer di incubazione a ciascuna provetta e mescolare accuratamente.Sottoporre ogni campione a ricottura ponendo ogni provetta in un blocco riscaldante pre-riscaldato per 10 minuti. Dopo aver lasciato raffreddare i campioni a temperatura ambiente, incubarli a quattro gradi Celsius durante la notte. Trasferire ora 130 microlitri di ogni campione in una cuvetta a otto microcelle, con una cella contenente il buffer di incubazione.Utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis, misurare l'assorbanza di ogni campione a 260 nanometri. Effettuare le misurazioni aumentando la temperatura da 15 a 95 gradi Celsius e successivamente diminuendo la temperatura da 95 a 15 gradi Celsius, con una velocità di rampa di 0,5 gradi Celsius al minuto. Gli oligomeri PNA sono stati ottenuti dopo due purificazioni mediante HPLC in fase inversa.L'identità delle PNA può essere confermata mediante analisi MALDI/TOF. I dati di elettroforesi su gel in condizioni non denaturanti (PAGE) indicano che la PNA modificata con Q e L può riconoscere esclusivamente la regione di RNA a doppio filamento contenente una coppia C-G. Questo riconoscimento specifico e potenziato avviene attraverso la formazione di triplex a due basi tra PNA e RNA, precisamente tramite le sequenze T-A-U-L-G-C e Q-C-G.Uno studio di titolazione mediante fluorescenza della 2-aminopurina ha mostrato che un PNA modificato con Q e L si lega a un RNA a doppio filamento bersaglio, ma non all'RNA a singolo filamento. I PNA contenenti residui Q non mostrano transizioni di fusione termica, suggerendo l'assenza di legame all'RNA a singolo filamento a causa dello scontro sterico nella coppia Q-G simile a quella di Watson-Crick. Rispetto al PNA non modificato P1, i PNA P4 e P5 contenenti residui L mostrano una temperatura di fusione più bassa per i corrispondenti duplex RNA-PNA, a causa dello scontro sterico nella coppia L-G simile a quella di Watson-Crick.I dati di fusione termica rilevati mediante assorbanza UV sono coerenti con i dati di titolazione della fluorescenza della 2-aminopurina, che mostrano anche che un PNA contenente residui Q e L non si lega in modo forte all'RNA a singolo filamento. L'introduzione di una base Q è più destabilizzante rispetto a una base L, poiché la base Q provoca un ingombro sterico maggiore durante la formazione di una coppia Q-G simile a quella di Watson-Crick. Una volta acquisite le competenze necessarie, i vari esperimenti possono essere eseguiti in una settimana, se effettuati correttamente.Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come l'analisi e il targeting delle strutture dell'RNA nelle cellule, al fine di rispondere ad ulteriori domande, ad esempio se sia possibile rilevare le strutture dell'RNA e regolarne le funzioni utilizzando PNA a legame doppio filamento per l'RNA. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia dell'RNA e delle malattie per esplorare lo sviluppo di terapie mirate alla struttura dell'RNA.

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