Riconoscimento di sequenza-specifico e selettivo di Double-stranded RNA sopra Single-stranded RNA da modificati chimicamente acidi peptido nucleici

L'obiettivo generale di questo articolo sui metodi è presentare le procedure dettagliate utilizzate nel nostro laboratorio per lo studio del riconoscimento molecolare di RNA a doppio filamento da parte di acidi peptidici nucleici modificati chimicamente. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia chimica dell'RNA, come il rilevamento e il targeting di strutture dell'RNA. Il principale vantaggio di questa tecnica è che i principi di progettazione possono essere applicabili al targeting di qualsiasi struttura a doppio filamento di RNA.

La procedura sarà dimostrata da Desiree Toh, un'assistente di ricerca del mio laboratorio. Per iniziare la procedura, aggiungere quattro microlitri di una soluzione al 35% di glicerolo ai campioni di RNA-PNA precedentemente preparati e mescolare delicatamente. Utilizzando una micropipetta e punte per caricamento di gel, aggiungere con attenzione 20 microlitri di ciascun campione a un gel di poliacrilamide precedentemente preparato, assicurandosi di non introdurre bolle d'aria.

Eseguire l'elettroforesi su gel a una tensione costante di 250 volt per cinque ore. Trascorse cinque ore, spegnere l'alimentatore e rimuovere la lastra di vetro dal supporto del gel. Successivamente, rimuovere il nastro sigillante del gel e smontare la lastra di vetro.

Rimuovere delicatamente il gel dalla lastra di vetro e collocarlo in un contenitore riempito con 350 millilitri di acqua deionizzata. Aggiungere con attenzione 35 microlitri di bromuro di etidio al contenitore e posizionarlo sullo shaker a piattaforma a bassa velocità per 30 minuti. Dopo aver smaltito la soluzione di bromuro di etidio, risciacquare il gel con 1,5 a due litri di acqua distillata.

Quindi scansionare il gel utilizzando un sistema di imaging con un laser verde a 532 nanometri e un filtro di emissione impostato a 610 nanometri. Quantificare le intensità delle bande del gel mediante software gratuito. Trasferire la quantità appropriata di RNA bicatenario marcato con 2-aminopurina in un tubo pulito da 1,5 millilitri.

Quindi concentrare le soluzioni di RNA utilizzando un concentratore a vuoto. Successivamente, trasferire i volumi appropriati della PNA bersaglio per diverse concentrazioni dal relativo stock principale precedentemente preparato in provette separate da 1,5 millilitro. Concentrare le soluzioni di PNA utilizzando il concentratore a vuoto.

Aggiungere 975 microlitri di buffer di incubazione al tubo contenente l'RNA liofilizzato e mescolare accuratamente per assicurare che tutto l'RNA sia disciolto. Dopo una breve centrifugazione della soluzione di RNA, sottoporla ad annealing ponendo il tubo in un blocco termico preriscaldato per 10 minuti. Al termine, spegnere il blocco termico e lasciare raffreddare il campione a temperatura ambiente.

Aggiungere 75 microlitri di RNA a ciascuna delle provette contenenti il PNA essiccato e mescolare accuratamente. Dopo aver lasciato riposare i campioni a temperatura ambiente per almeno un'ora, incubarli a quattro gradi Celsius durante la notte. Ora, trasferire le quantità appropriate di RNA monocatenario marcato con 2-aminopurina in provette separate da 1,5 millilitro.

Trasferire i volumi appropriati di PNA mirati per diverse concentrazioni dallo stock principale nei rispettivi tubi contenenti l'RNA a singolo filamento. Dopo l'essiccazione dei campioni, aggiungere 75 microlitri di buffer di incubazione a ciascun tubo e mescolare accuratamente. Sottoporre ciascun campione ad annealing ponendo ogni tubo in un blocco riscaldante preriscaldato per 10 minuti.

Dopo aver lasciato raffreddare i campioni a temperatura ambiente, incubarli a quattro gradi Celsius durante la notte. Successivamente, trasferire 70 microlitri di ogni campione in una cuvetta quadrata di un centimetro. Posizionare la cuvetta in un fluorimetro e misurare l'emissione nell'intervallo di lunghezze d'onda compreso tra 330 e 550 nanometri.

Al termine della misurazione, rimuovere il tampone dalla cuvetta. Sciacquare la cuvetta con acqua distillata e asciugare con gas azoto. Dopo aver ripetuto la misurazione per tutti i campioni, riportare l'intensità di fluorescenza in funzione della lunghezza d'onda.

Trasferire le quantità appropriate di RNA a filamento singolo in provette separate da 1,5 millilitri. Successivamente, trasferire i volumi appropriati di PNA mirato dalla soluzione madre nelle rispettive provette contenenti l'RNA a filamento singolo. Dopo aver essiccato i campioni, aggiungere 130 microlitri di buffer di incubazione a ciascuna provetta e mescolare accuratamente.

Sottoporre ogni campione a ricottura ponendo ogni provetta in un blocco riscaldante pre-riscaldato per 10 minuti. Dopo aver lasciato raffreddare i campioni a temperatura ambiente, incubarli a quattro gradi Celsius durante la notte. Trasferire ora 130 microlitri di ogni campione in una cuvetta a otto microcelle, con una cella contenente il buffer di incubazione.

Utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis, misurare l'assorbanza di ogni campione a 260 nanometri. Effettuare le misurazioni aumentando la temperatura da 15 a 95 gradi Celsius e successivamente diminuendo la temperatura da 95 a 15 gradi Celsius, con una velocità di rampa di 0,5 gradi Celsius al minuto. Gli oligomeri PNA sono stati ottenuti dopo due purificazioni mediante HPLC in fase inversa.

L'identità delle PNA può essere confermata mediante analisi MALDI/TOF. I dati di elettroforesi su gel in condizioni non denaturanti (PAGE) indicano che la PNA modificata con Q e L può riconoscere esclusivamente la regione di RNA a doppio filamento contenente una coppia C-G. Questo riconoscimento specifico e potenziato avviene attraverso la formazione di triplex a due basi tra PNA e RNA, precisamente tramite le sequenze T-A-U-L-G-C e Q-C-G.

Uno studio di titolazione mediante fluorescenza della 2-aminopurina ha mostrato che un PNA modificato con Q e L si lega a un RNA a doppio filamento bersaglio, ma non all'RNA a singolo filamento. I PNA contenenti residui Q non mostrano transizioni di fusione termica, suggerendo l'assenza di legame all'RNA a singolo filamento a causa dello scontro sterico nella coppia Q-G simile a quella di Watson-Crick. Rispetto al PNA non modificato P1, i PNA P4 e P5 contenenti residui L mostrano una temperatura di fusione più bassa per i corrispondenti duplex RNA-PNA, a causa dello scontro sterico nella coppia L-G simile a quella di Watson-Crick.

I dati di fusione termica rilevati mediante assorbanza UV sono coerenti con i dati di titolazione della fluorescenza della 2-aminopurina, che mostrano anche che un PNA contenente residui Q e L non si lega in modo forte all'RNA a singolo filamento. L'introduzione di una base Q è più destabilizzante rispetto a una base L, poiché la base Q provoca un ingombro sterico maggiore durante la formazione di una coppia Q-G simile a quella di Watson-Crick. Una volta acquisite le competenze necessarie, i vari esperimenti possono essere eseguiti in una settimana, se effettuati correttamente.

Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come l'analisi e il targeting delle strutture dell'RNA nelle cellule, al fine di rispondere ad ulteriori domande, ad esempio se sia possibile rilevare le strutture dell'RNA e regolarne le funzioni utilizzando PNA a legame doppio filamento per l'RNA. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia dell'RNA e delle malattie per esplorare lo sviluppo di terapie mirate alla struttura dell'RNA.