Quantificazione delle informazioni codificate dal Gene Expression livelli durante la durata della vita modulazione sotto restrizione dietetica di ampio spettro, in c. elegans

L'obiettivo generale di questo quadro è identificare i geni coinvolti nella restrizione dietetica ad ampio raggio, quantificare le informazioni ambientali codificate dai loro livelli di espressione e comprendere la strategia di codifica sottostante che collega l'ambiente alla durata della vita. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della neurobiologia dell'invecchiamento, come ad esempio quali geni trasmettono informazioni dall'ambiente per modulare la durata della vita. Sebbene questo quadro possa fornire informazioni sul sistema sensoriale C Elegan, può anche essere applicato più in generale a qualsiasi sistema biologico i cui componenti cooperano, per elaborare l'informazione ambientale.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che quantifica l'informazione ambientale codificata da gruppi di neuroni e determina la strategia di codifica impiegata dai neuroselquiti per veicolare queste informazioni ai bersagli a valle. Dopo aver coltivato OP50 su piastre MGM secondo il protocollo di testo, preparare 500 millilitri di terreno LB in ciascuna delle fiasche di erlenmeyer da due litri e sterilizzarle in autoclave. Inoculare ogni pallone con una singola colonia di OP50 e far crescere le colture a 37 gradi Celsius e 200 RPM per circa 14 ore.

Successivamente, integrare le colture con 50 microgrammi per millilitro di streptomicina. Quindi agitare i palloni per altri 30 minuti a 37 gradi Celsius, prima di mettere i palloni sul ghiaccio per 15 minuti. Trasferire 450 millilitri di ciascuna coltura in flaconi da centrifuga sterili separati da 500 millilitri, conservare la coltura rimanente sul ghiaccio, poiché verrà utilizzata per determinare la concentrazione dei batteri.

Centrifugare le bottiglie a 4500 x G e quattro gradi Celsius per 25 minuti, quindi scartare il surnatante e conservare le bottiglie in ghiaccio. Con 900 microlitri di libbra sterile, diluire 100 microlitri di coltura avanzata da ogni pallone. Utilizzare un millilitro di LB sterile per azzerare lo spettrofotometro e quindi determinare l'OD600 della diluizione di 10 volte di ciascuna coltura.

Se, ad esempio, l'OD600 della diluizione di 10 volte della coltura notturna è 0,28, allora la coltura aveva un OD600 effettivo di 2,8. Da questo esempio, per arrivare a una soluzione madre di 1,12 x 10 alla decima cellula OP50 per millilitro, che equivale a un OD600 di 56, risospendere il pellet dalla coltura da 450 millilitri in un 20° del volume originale o 22,5 millilitri di soluzione basale sterile di S o SB, integrata con 50 microgrammi per millilitro di streptomicina. Effettuare tutte le concentrazioni successive utilizzate negli esperimenti su SB e streptococco, da diluizioni seriali del materiale lavorante, utilizzando i fattori di diluizione elencati in questa tabella.

Dopo aver coltivato e sincronizzato i ceppi reporter di C Elegans secondo il protocollo di testo, utilizzare 15 millilitri di SB per lavare in serie i vermi dalle tre piastre e raccogliere il liquido in una provetta sterile da 15 millilitri. Lasciare sedimentare naturalmente le larve L4 e poi aspirare tutto tranne circa 0,5 millilitri di liquido. Nei ceppi reporter di tipo selvatico, questo tipo rimuove tutte le larve più giovani di L4.In di sfondo mutante, questo passaggio aiuta nella rimozione di eventuali larve arrestate, come la nostra, in caso di morte di un OK3125.

Quindi, usa nove millilitri di SB per risospendere i vermi. Anche in questo caso, monitorare il tasso di sedimentazione delle larve di L4 e quindi aspirare tutti tranne circa 0,5 millilitri di surnatante una volta che la maggior parte delle larve di L4 si è pellettizzata prima di ripetere il processo. Aggiungere 10 microlitri di terreno basale S sterile, integrato con F127 pluronico allo 0,1% al liquido contenente le larve L4.

Questo agisce come tensioattivo e impedisce alle larve di attaccarsi alla superficie interna dei puntali delle pipette in plastica. Utilizzando un puntale per pipetta P200 a bassa ritenzione, risospendere delicatamente le larve e quindi aliquotare 150 microlitri su tre piastre RNAi da 10 centimetri che vengono seminate con 5 x 225 microlitri di batteri RNAi uovo a cinque pollici. Assicurati che i vermi siano distribuiti equamente su tutti e cinque i prati batterici.

Una volta che il liquido è stato assorbito nell'agar, rimuovere dalle piastre eventuali larve non L4 che non sono state eliminate dalla procedura di lavaggio, prelevandole manualmente. Quindi conservare i piatti a 20 gradi Celsius per 24 ore. Per avviare la DR ad ampio raggio, raccogli tutte le giovani larve che sono sfuggite alla precedente fase di rimozione manuale, lasciando solo gli adulti di un giorno sui piatti.

Per ogni ceppo, utilizzare 15 millilitri di streptococco SB sterile, per lavare gli adulti di un giorno dalle tre piastre, in una provetta da 15 millilitri. Lasciare che i vermi sedimentino naturalmente e poi aspirare tutto tranne 0,5 millilitri di surnatante. Risospendere i vermi con 9,5 millilitri di streptococco SB e ripetere le fasi di sedimentazione e lavaggio.

Dopo il lavaggio finale e l'aspirazione di tutti i supernatanti tranne 0,5 millilitri, aggiungere 10 microlitri di SB Plu e utilizzare un puntale per pipetta P200 per risospendere delicatamente le larve. Aliquotare 100 microlitri di larve su una piastra NSC, seminata con 5 x 225 microlitri di batteri, a una concentrazione di 2 x 10 per nona cellula per millilitro. Distribuire uniformemente i 100 microlitri su tutti e cinque i prati batterici.

Al microscopio, stimare il numero di animali presenti sulla piastra, puntando a un numero compreso tra 100 e 150 vermi per piastra. Determinare il volume di liquido necessario per raggiungere una densità di viti senza fine all'interno di questo intervallo e quindi aliquotarlo su due piastre aggiuntive. Regola il numero di vermi sulla prima piastra in modo che rientrino anche in questo intervallo.

E poi conservare i piatti a 20 gradi Celsius per 24 ore. Il giorno successivo, raccogliere gli adulti di due giorni e distribuire i vermi su nuove piastre NSC seminate con il desiderio di sperimentare la concentrazione del cibo. Una volta che il liquido è stato assorbito nell'agar, spostare le piastre alla temperatura sperimentale desiderata per 24 ore.

Il giorno seguente, raccogliete gli adulti di tre giorni e distribuiteli su piastre NSC fresche, seminate con la stessa concentrazione sperimentale di cibo. Una volta che il liquido è stato assorbito nell'agar, riportare le piastre alla temperatura sperimentale per 48 ore. Infine, utilizzare un dispositivo microfluidico per visualizzare gli animali prima di assemblare e quantificare i dati secondo il protocollo di testo.

Come mostrato qui, la durata media della vita del ceppo n2 wild type, mostra una risposta complessa alla DR ad ampio raggio. L'entità di questa risposta è attenuata in un mutante del gene daf-7, suggerendo che questo gene influenza la capacità del verme di rispondere correttamente ai cambiamenti nell'abbondanza di cibo. I livelli medi di espressione di un reporter trascrizionale per il gene daf-7 e il background wild type, mostrano anche una complessa risposta non monotona ad un'ampia gamma DR.In il daf-7 (background genetico, l'espressione di questo reporter trascrizionale è altamente attenuata e mostra poca risposta ai cambiamenti nel livello di cibo. Questa figura illustra la stima della distribuzione congiunta dell'espressione di TPH1 nei neuroni ADF e dell'espressione di daf-7 nei neuroni ASI per un dato livello di cibo.

Questi grafici a barre presentano le informazioni sugli alimenti codificate, combinatoriamente o individualmente, dai neuroni ADF, ASI e NSM, in base ai livelli di espressione genica di TPH1 e daf-7. Caratteri ridondanti e sinergici della codifica, risulta dal confronto tra l'informazione combinatoria e quella individuale codificata dai neuroni rappresentata dalla differenza di altezza delle barre impilate a destra e l'informazione codificata dall'intero circuito. Mentre si tenta questa procedura, è importante ricordare che la replicazione della teoria dell'informazione per quantificare la strategia di codifica richiede una stima accurata delle distribuzioni di espressione genica.

Per questo motivo, la dimensione del campione è un fattore critico per l'applicabilità generale di questo quadro. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire esperimenti di restrizione dietetica ad ampio raggio per identificare e caratterizzare nuovi geni che collegano l'abbondanza di cibo alla durata della vita.