Lente-free Video microscopia per la dinamica e analisi quantitativa della coltura delle cellule aderenti

Lente-libero video microscopia permette di monitorare le colture cellulari direttamente all'interno dell'incubatrice. Qui descriviamo il protocollo completo utilizzato per acquisire e analizzare un'acquisizione di 2,7 giorni lunghi delle cellule coltivate di HeLa, che conduce a un dataset di 2.2 x 10⁶ misurazioni della morfologia delle cellule individuali e ciclo cellulare 10584 tracce.

L'obiettivo generale di questa metodologia è quello di acquisire e analizzare la dinamica dell'ampia popolazione di cellule aderenti monitorata mediante microscopia video senza lenti. Quindi, pensiamo che questa tecnica sia interessante in molti campi della biologia e per lo studio della proliferazione cellulare o della cistite cellulare o dello screening di farmaci, o del monitoraggio di diversi processi biologici. Quindi questa tecnica è priva di etichette ed è molto semplice.

Ma è molto efficace nello studio di grandi popolazioni cellulari. Quale idea per questo metodo, quando siamo passati dal campo della rilevazione dei batteri al campo dell'imaging delle cellule dei mammiferi. Quindi è stato utile che il biologo, avranno bisogno di acquisizione time-lapse della circuitura direttamente nell'incubatrice.

Poi abbiamo costruito un microscopio video personalizzato e senza lenti compatibile con l'incubatore e abbiamo sviluppato un algoritmo di ricostruzione olografica per ottenere l'immagine di migliaia di cellule presenti nel campo visivo molto ampio. Iniziare questa procedura rivestendo una piastra di vetro a 6 pozzetti con fibronectina a temperatura ambiente per 1 ora. Dopo 1 ora, rimuovere la fibronectina in eccesso e risciacquare la piastra di fondo in vetro a 6 pozzetti con PBS.

In questa dimostrazione vengono utilizzate cellule Hela, coltivate in DMEM, più terreno di glutammina, integrato con il 10% di calore nel siero fetale di vitello attivato e l'1% di penicillina e streptomicina. Semina ventimila cellule per piastra di coltura. È importante utilizzare un contenitore con fondo in vetro.

Per la qualità dell'acquisizione senza lenti. Posizionare la piastra di coltura nell'incubatore sopra il videomicroscopio senza lenti. Il videomicroscopio senza lente utilizzato per questa acquisizione time-lapse è disponibile in commercio.

È dotato di un sensore di immagine a semiconduttore in ossido di metallo con un'area di imaging di 29,4 millimetri quadrati e un passo dei pixel di 1,67 micrometri. L'illuminazione a lunghezza d'onda multipla è fornita da un dispositivo a diodi emettitori di luce multi-chip situato sopra un foro stenopeico di 150 micro metri a una distanza di circa 5 centimetri dalle celle. Prima di iniziare l'acquisizione time-lapse, è importante verificare che non vi sia condensa sulla piastra di copertura.

Perché la condensa degraderà la qualità dell'immagine dell'acquisizione. Se si è formata della condensa sul coperchio della piastra di coltura, pulire il coperchio. Controlla il microscopio senza obiettivo video con un software di acquisizione disponibile in commercio.

Che esegue sia l'acquisizione time-lapse che la ricostruzione olografica. Inserire i parametri di input richiesti nell'interfaccia del software. Impostare la frequenza dei fotogrammi su 1 acquisizione ogni 10 minuti, il tipo di coltura cellulare su aderente e la durata dell'esperimento su 3 giorni.

Avvia l'acquisizione time-lapse. Questa immagine mostra un esempio dell'intero campo visivo di un'acquisizione raw nel canale blu su un'area di 29,4 millimetri quadrati in un fotogramma. Il pannello B è il dettaglio del pannello A e il pannello C è il dettaglio del pannello B.L'algoritmo di ricostruzione olografica elaborerà automaticamente l'acquisizione senza lenti per ottenere l'immagine di fase della coltura cellulare.

Viene mostrata un'immagine di esempio delle celle prima dello srotolamento della fase, seguita da un'immagine dopo lo srotolamento della fase. Il tracciamento delle celle viene realizzato utilizzando l'algoritmo TrackMate, un plug-in open source delle Fiji per il tracciamento automatizzato di singole particelle. Dopo il caricamento, l'acquisizione time-lapse completa nelle Fiji e la configurazione degli algoritmi come descritto nel protocollo di testo, impostare i parametri di input.

Impostate il diametro stimato del blob a 15 pixel, la soglia del rivelatore a 0,25, la distanza massima di collegamento a 15 pixel, la distanza massima di chiusura dello spazio a 15 pixel e il numero di punti in traccia a 3,5. Il primo passo nell'algoritmo di tracciamento cellulare è il rilevamento delle cellule nell'acquisizione senza lente. Vengono mostrati i risultati dell'algoritmo di tracciamento delle celle, con tutte le tracce delle celle mostrate in cinquanta fotogrammi, o circa 8 ore.

Con un codice colore corrispondente alla velocità mediana. Il pannello inferiore è un'immagine dettagliata del rettangolo giallo dal pannello superiore. Qui viene mostrato un video rappresentativo del tracciamento delle celle.

Al termine del processo di tracciamento delle celle, selezionare il pulsante di analisi per generare i risultati sotto forma di 3 file di testo. Sulla base di questi dati, eseguire la segmentazione cellulare e rilevare le divisioni cellulari utilizzando algoritmi dedicati, come dettagliato nel protocollo di testo e nei file di codice supplementari. La compilazione di tutte le misurazioni di singole celle durante l'acquisizione time-lapse completa produce grafici a dispersione di diverse metriche in funzione del tempo.

Il numero totale di celle nell'intero campo visivo, aumenta da duemila fino a quindicimila in 2,7 giorni. Moltiplicato per il numero di punti temporali, questo porta a un ampio set di dati di celle rilevate. Ognuno di essi è caratterizzato dalle sue coordinate e caratteristiche morfologiche, come la massa secca, l'area, lo spessore medio, la lunghezza di accesso maggiore e il rapporto d'aspetto.

La combinazione di algoritmi di tracciamento e segmentazione cellulare consente misure cinetiche a livello di singola cellula. Questo esempio mostra l'analisi della traccia cellulare che dura circa sessantasei ore, e mostra 4 divisioni cellulari nei punti temporali cerchiati in giallo. Diverse metriche sono state calcolate in funzione del tempo: area della superficie cellulare, massa secca, spessore medio e motilità cellulare.

La distribuzione della durata del ciclo cellulare per l'osservazione di 2,7 giorni era vicina all'agouziano. Con una media di 16,5 ore. Le lunghezze dei cicli delle celle, misurate automaticamente, sono ben correlate a quelle misurate manualmente.

Sono stati esaminati anche altri parametri, come la massa secca iniziale della cellula, la massa secca finale e il tasso di crescita medio durante il ciclo cellulare. Una volta padroneggiata, l'analisi completa dei dati dell'acquisizione time-lapse, può essere eseguita in poche ore, a seconda della configurazione della CPU e delle prestazioni dell'hardware. Durante il tentativo di questa procedura è molto importante valutare attentamente la concentrazione iniziale delle cellule.

Se la concentrazione iniziale della cella è troppo grande, l'algoritmo di tracciamento delle celle non riuscirà a definire correttamente le traiettorie delle celle. Ma, se la concentrazione cellulare è troppo bassa, anche le statistiche dell'analisi completa saranno troppo basse. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire analisi automatizzate come il tracciamento cellulare per rispondere ad altre domande nei campi della biologia, della biologia fondamentale o della chemiotassi.

Questa nuova tecnica, apre anche la strada al monitoraggio della linea cellulare che si spera possa portare interessanti intuizioni per studiare il ciclo cellulare. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come condurre l'acquisizione time-lapse per mezzo della microscopia video senza lenti e di come analizzare una vasta popolazione di cellule.